在脑片电生理实验中，可对表达ChR2的成年新生神经元进行操控，以研究其对嗅觉神经环路功能的贡献。
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本文内容
摘要
摘要
标准脑片电生理技术使研究人员能够通过记录单个细胞对电或药物干预的电反应，来探究神经环路中的各个独立组分1,2。随着光遗传学技术的出现，即利用光学手段操控特定基因标记的神经元，研究人员现在能够在标准脑片制备中以前所未有的精度控制特定神经元群体。特别是光敏感通道蛋白-2（ChR2）的发现，使研究人员能够利用光激活神经元3,4。通过将基于LED的光刺激对ChR2的精确校准与标准脑片电生理记录相结合，我们能够更深入地探究成年新生中间神经元在嗅球——嗅觉系统的首个中枢中继站——中的作用。通过在成年新生神经元中特异性地利用病毒表达ChR2-YFP，我们可以在大量已存在的成熟神经元环境中选择性地操控年轻的成年新生神经元。我们的光学控制系统采用一种简单且低成本的LED装置，并展示了如何对该系统进行校准，以确定激活单个神经元产生动作电位所需的光强。因此，短暂的蓝光脉冲即可远距离控制经ChR2转导的新生细胞的放电模式。
方案
1. 光学校准：测量LED功率
- 将LED阵列连接至由风扇主动冷却的散热片，并将该LED/散热片装置固定到准直透镜上。
- 用LED/散热片/风扇/透镜装置替换明场照明中使用的光源。该装置必须准确定位，以确保准直后的LED光束沿直线光路射向聚光镜。确保散热片/风扇已正确接地至系统的公共地线。
- 使用能够提供快速且方波形电流脉冲的电源驱动LED阵列。该电源可由脉冲发生器输出的5V TTL脉冲信号控制。
- 沿视场光阑与聚光镜之间定义的光路，对准准直光束的中心。理想情况下，LED光束应略微超出完全打开的视场光阑。通常，准直程度更高的LED光束填充该孔径的范围更小，虽可提高输出功率，但会牺牲均匀性。在本实验装置中，我们通过选择一种能在聚光镜光阑共轭平面上投射出LED阵列略微放大图像的准直透镜，以提高光照均匀性。
- 通过调节聚光镜，使视场光阑（靠近光源端的光阑）的像聚焦于样本腔室（图1），从而实现科勒照明。可使用一片薄镜头纸作为投影屏，观察视场光阑像在不同深度处的聚焦情况。
- 在不透明材料上钻制一系列已知直径的小孔。将其中一个微小孔置于光学功率计的传感器表面。将功率计放置在样本载物台上，并通过移动功率计使其读数达到最大，从而将传感器中心对准视场光阑像的焦点位置。将功率计固定于该位置。
- 完全打开所有光阑（孔径光阑和视场光阑）。系统性地移动与载物台相连的样本腔室/功率计，相对于光学光....
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讨论
近年来，光遗传学工具在神经科学研究中的应用迅速普及6。因此，降低希望开始使用这些新工具的实验室的入门门槛变得愈发重要。本文介绍了一种简单且低成本的方法，对传统的膜片钳设备进行改造和校准，使其能够实现对表达通道视紫红质的神经元进行全视野光学刺激。特别地，我们将该技术应用于嗅球成年神经发生的研究中，利用光特异性地控制新生神经元。
我们演示如何确定LED光源是否产生足够的功率以激活ChR2，并展示LED固有的快速开关特性如何轻松调节给予神经元的光剂量。尽管我们的实验室已成功应用该技术，但仍存在其他多种向神经元施加可控光剂量的方法，每种方法均有其各自的优势与局限性。
如果需要更高的光功率，许多汞灯产生的光强会明显超过LED阵列，且显微镜的物镜和滤光片组已具备将所需波长的光聚焦到样品上的能力。然而，这种方案难以精确控制光照强度和照射时间。照射时间需通过外置快门来控制，而这类快门通常比LED阵列更昂贵；光强则需通过在光路中添加中性密度滤光片进行衰减——但这样做可能引入振动，从而降低膜片钳实验的成功率。
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致谢
本工作由人寿保险公司“AG2R-La-Mondiale”、巴黎神经科学学院（ENP）、法国国家科研署“ANR-09-NEUR-004”项目（在欧洲委员会第七框架计划“ERA-NET NEURON”框架内）以及巴斯德基金会资助。Sebastien Wagner 获得Letten基金会的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯胺酮 | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| 赛拉嗪 | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 移液管拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 玻璃毛细管 | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm 外径/1.17 mm 内径 |
| LED 阵列 | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| 准直透镜 | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm 光束直径 |
| 电源 | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 安培 |
| 光功率计 | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| 散热片 | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| 风扇 | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| 振动切片机 | Leica Microsystems | VT1200S |
参考文献
- Nissant, A. Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb. Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).
- Apicella, A. Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomer....
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重印与许可
