在脑片电生理实验中，可对表达ChR2的成年新生神经元进行操控，以研究其对嗅觉神经环路功能的贡献。
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本文内容
摘要
摘要
标准脑片电生理技术使研究人员能够通过记录单个细胞对电或药物干预的电反应，来探究神经环路中的各个独立组分1,2。随着光遗传学技术的出现，即利用光学手段操控特定基因标记的神经元，研究人员现在能够在标准脑片制备中以前所未有的精度控制特定神经元群体。特别是光敏感通道蛋白-2（ChR2）的发现，使研究人员能够利用光激活神经元3,4。通过将基于LED的光刺激对ChR2的精确校准与标准脑片电生理记录相结合，我们能够更深入地探究成年新生中间神经元在嗅球——嗅觉系统的首个中枢中继站——中的作用。通过在成年新生神经元中特异性地利用病毒表达ChR2-YFP，我们可以在大量已存在的成熟神经元环境中选择性地操控年轻的成年新生神经元。我们的光学控制系统采用一种简单且低成本的LED装置，并展示了如何对该系统进行校准，以确定激活单个神经元产生动作电位所需的光强。因此，短暂的蓝光脉冲即可远距离控制经ChR2转导的新生细胞的放电模式。
方案
1. 光学校准：测量LED功率
- 将LED阵列连接至由风扇主动冷却的散热片，并将该LED/散热片装置固定到准直透镜上。
- 用LED/散热片/风扇/透镜装置替换明场照明中使用的光源。该装置必须准确定位，以确保准直后的LED光束沿直线光路射向聚光镜。确保散热片/风扇已正确接地至系统的公共地线。
- 使用能够提供快速且方波形电流脉冲的电源驱动LED阵列。该电源可由脉冲发生器输出的5V TTL脉冲信号控制。
- 沿视场光阑与聚光镜之间定义的光路，对准准直光束的中心。理想情况下，LED光束应略微超出完全打开的视场光阑。通常，准直程度更高的LED光束填充该孔径的范围更小，虽可提高输出功率，但会牺牲均匀性。在本实验装置中，我们通过选择一种能在聚光镜光阑共轭平面上投射出LED阵列略微放大图像的准直透镜，以提高光照均匀性。
- 通过调节聚光镜，使视场光阑（靠近光源端的光阑）的像聚焦于样本腔室（图1），从而实现科勒照明。可使用一片薄镜头纸作为投影屏，观察视场光阑像在不同深度处的聚焦情况。
- 在不透明材料上钻制一系列已知直径的小孔。将其中一个微小孔置于光学功率计的传感器表面。将功率计放置在样本载物台上，并通过移动功率计使其读数达到最大，从而将传感器中心对准视场光阑像的焦点位置。将功率计固定于该位置。
- 完全打开所有光阑（孔径光阑和视场光阑）。系统性地移动与载物台相连的样本腔室/功率计，相对于光学光路的位置，计算照明区域内光学功率的均匀性。为您的系统构建光照均匀性曲线图。若显微镜已正确设置，并实现以物镜焦点为中心的科勒照明，则最大功率应位于物镜正下方，而焦点以外区域接收到的光功率可根据均匀性曲线图准确获知。
- 针对每种尺寸的小孔，建立光学功率与小孔表面积之间的标准曲线。通过调节输入LED阵列的电流，在多个功率水平下生成该曲线，并从每条曲线计算单位mm²的功率值。若LED阵列将用于补片钳光学系统，需加入补片所需的光学元件（如聚光镜、小孔和滤光片），以确定在补片照明条件下透射的光量。
- 将功率计翻转使其朝向物镜，计算汞灯开启时在470 nm处的照明强度。
- 在腔室内加入活体脑片样本，并重新建立标准曲线，以确定光穿过散射性脑组织后的透射功率。
2. 切片操作与电生理学
第一部分：切片制备
- 麻醉小鼠（60 mg/kg 氯胺酮和 2 mg/kg 赛拉嗪），随后断头。在人工脑脊液（ACSF，单位为 mM：124 NaCl，3 KCl，1.3 MgSO₄）中解剖取出脑组织。4，26 NaHCO₃3，1.25 NaHPO4，20 葡萄糖，2 CaCl2；当用95% O₂和5% CO₂的混合气体饱和时，约310 mOsm，pH 7.425,1），注意不要损伤嗅球。将两个半球分开，并放置在琼脂上，使腹面与一侧边缘齐平（用于水平切片）。
- 将琼脂和每个大脑半球的背侧表面粘附到振动切片机的夹持器上，缓慢用冰冻的ACSF填充浴槽。从腹侧表面开始切片 300 μm 切片，将每个切片转移至预热的（34-36°C）和含氧人工脑脊液（ACSF），使其恢复30-45分钟。
第二部分：通过松散贴附记录法测量动作电位的放电阈值
- 将脑片在室温下放置30分钟后，轻轻将其放入显微镜记录装置的记录室中，并持续灌流含氧人工脑脊液（ACSF）。
为避免过度激活感染ChR2的神经元，可在落射荧光下确认EYFP-ChR2的存在（图2a） - 使用微电极拉制仪（Sutter P-97）拉制玻璃电极。用ACSF填充该电极。当电极置于ACSF浴液中时，其尖端电阻应在7–10 MΩ之间。
- 在荧光照明下，在脑片中寻找一个形态成熟且状态良好的ChR2-EYFP标记神经元。同时在封接光学系统下定位该神经元的胞体。
- 通过电极尖端施加轻微正压，将膜片电极缓慢移向已识别的荧光神经元。当电极与细胞膜接触后，迅速释放正压，并通过电极尖端施加短暂而轻微的负压吸力。此时，电极壁与细胞膜之间应形成吉欧姆级密封（giga-ohm seal）。
- 即使未形成吉欧姆级密封，只要电极足够接近荧光标记的神经元，其放电活动仍应产生可测量的局部场电位。通过施加不同剂量的光刺激来激活该神经元中的ChR2。由于光剂量取决于LED功率和持续时间，需计算在多种功率和持续时间组合下诱发动作电位所需的光量（图2b）。同时观察在汞灯照明下产生的放电情况。
3. 典型结果：
在我们的显微镜（Olympus BX51WI）上，LED 与两个孔径光阑及一个聚光镜透镜同轴排列，从而保持了显微镜出厂时弧光灯原有的光路。通过同时关闭视场光阑和孔径光阑，我们可获得足以进行膜片钳记录的明场对比度（图 1b）。当所有光阑完全打开时，脑片可暴露于最大光强下，用于激活视蛋白通道（图 1a）。在本显微镜上，这种用于膜片钳的配置所产生的光照强度，大约比最大满场照度低三个数量级（4.1 μW/mm2 对比 6.88 mW/mm2）。
在嗅球前移流中迁移的成神经细胞感染慢病毒数周后，可观察到成年新生的嗅球颗粒细胞和球周细胞被 robust 地标记（图 2a）。对单个表达 ChR2-EYFP 的成年新生颗粒细胞进行松散贴附记录表明，以最大功率（6.88 mW/mm2）进行 5 ms 的光刺激足以诱发动作电位发放（图 2b）。由于不同细胞中表达水平存在差异，因此使细胞发放动作电位所需的光强度亦会有所不同，应对每种目标细胞类型进行统计学描述。
图 1. 用于全场光刺激与膜片钳切片电生理记录的LED阵列装置。为激活通道视紫红质（ChR2），我们将准直光束通过物镜后端开放的光圈和聚光镜光学系统（a）。通过完全关闭视场光阑并调节视场光阑的宽度，可将此配置转换为高对比度的膜片钳光学系统（b）。缩略语：a. 风扇，b. 散热片，c. LED阵列，d. 准直透镜，e. 反射镜，f. 视场光阑，g. 孔径光阑，h. 聚光镜，i. 样品台，j. 物镜。
图 2. 用于膜片钳和全视野光刺激的嗅球300μm水平切片图像（a）。可见经慢病毒转染表达ChR2-EYFP的成年新生颗粒细胞从嗅球核心向外辐射。通过增加LED闪光持续时间可确定诱发动作电位所需的光剂量（b）。该颗粒细胞的阈值为LED全强度（2.43mW/mm2）下5ms。图（a）比例尺 = 500μm，图（b）比例尺 = 50ms。
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讨论
近年来，光遗传学工具在神经科学研究中的应用迅速普及6。因此，降低希望开始使用这些新工具的实验室的入门门槛变得愈发重要。本文介绍了一种简单且低成本的方法，对传统的膜片钳设备进行改造和校准，使其能够实现对表达通道视紫红质的神经元进行全视野光学刺激。特别地，我们将该技术应用于嗅球成年神经发生的研究中，利用光特异性地控制新生神经元。
我们演示如何确定LED光源是否产生足够的功率以激活ChR2，并展示LED固有的快速开关特性如何轻松调节给予神经元的光剂量。尽管我们的实验室已成功应用该技术，但仍存在其他多种向神经元施加可控光剂量的方法，每种方法均有其各自的优势与局限性。
如果需要更高的光功率，许多汞灯产生的光强会明显超过LED阵列，且显微镜的物镜和滤光片组已具备将所需波长的光聚焦到样品上的能力。然而，这种方案难以精确控制光照强度和照射时间。照射时间需通过外置快门来控制，而这类快门通常比LED阵列更昂贵；光强则需通过在光路中添加中性密度滤光片进行衰减——但这样做可能引入振动，从而降低膜片钳实验的成功率。
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致谢
本工作由人寿保险公司“AG2R-La-Mondiale”、巴黎神经科学学院（ENP）、法国国家科研署“ANR-09-NEUR-004”项目（在欧洲委员会第七框架计划“ERA-NET NEURON”框架内）以及巴斯德基金会资助。Sebastien Wagner 获得Letten基金会的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯胺酮 | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| 赛拉嗪 | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 移液管拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 玻璃毛细管 | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm 外径/1.17 mm 内径 |
| LED 阵列 | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| 准直透镜 | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm 光束直径 |
| 电源 | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 安培 |
| 光功率计 | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| 散热片 | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| 风扇 | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| 振动切片机 | Leica Microsystems | VT1200S |
参考文献
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- Bardy, C. where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).
- Grubb, M. S. Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis. The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).
- Zhang, F. Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems. Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).
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- Toni, N. Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells. Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment. PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.
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重印与许可
