利用在吻侧迁移流中注射表达通道视紫红质2的慢病毒，并结合植入式微型LED进行慢性光刺激，可对嗅球中成年新生神经元进行光遗传学操控。
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本文内容
摘要
摘要
局部中间神经元在成年啮齿类动物的嗅球中持续再生1-3。这一过程被称为成年神经发生，起源于侧脑室壁的神经干细胞产生神经母细胞，这些神经母细胞沿着吻侧迁移流（RMS）迁移数毫米，最终到达并整合至嗅球。为了研究不同阶段以及新生神经元整合到已有嗅觉环路中的影响，有必要对这群特定神经元进行选择性标记并调控其活性。近年来发展的光遗传学技术使得研究人员能够利用光精确激活这群特定神经元，同时不干扰周围神经元的活动4,5。本文介绍了一系列实验步骤，通过病毒载体在神经母细胞进入嗅球并发育为成年新生神经元之前，实现对RMS中特定时间窗口内的一群神经母细胞特异性表达通道视紫红质2（ChR2）-YFP。此外，我们还展示了如何植入并校准微型LED，以实现对表达ChR2的神经元进行长期的体内光刺激。
方案
1. 立体定位注射
- 本实验所用病毒为基于 HIV 病毒的复制缺陷型慢病毒载体，该载体在突触素启动子驱动下表达 Channelrhodopsin2-YFP（黄色荧光蛋白）融合构建体6。该质粒由 K. Deisseroth 研究组慷慨提供（http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html）。慢病毒可从商业来源获取，或根据既定方案在实验室中制备7。平均病毒滴度约为 1010 转导单位/mL。病毒分装后应保存于 -80°C，使用前即刻解冻。避免反复冻融。切勿使病毒溶液直接接触干冰。
- 使用标准的拉针仪（Sutter P-97 拉针仪）将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制为玻璃移液管。拉针参数应适当校准，以获得长而刚性的移液管。随后用剪刀剪去移液管尖端，使其尖端直径达到 30–40 μm。将拉制好的移液管存放于无尘盒中。
- 按照制造商说明设置 Nanoject II 微量注射仪，使其每次注射量为 50 nL。通过从后端填充矿物油的方式准备注射用移液管，并将其插入微量注射仪的推杆中。将微量注射仪固定于立体定位仪框架上。在填充病毒溶液前，先将玻璃移液管中的部分矿物油排出。
- 使用移液器将 2 μL 病毒溶液转移至无菌的 Parafilm 表面。轻轻将玻璃移液管插入病毒液滴中，吸取 1–2 μL 溶液。确保移液管内无气泡。
- 使用 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪（溶于无菌生理盐水）麻醉小鼠。使用啮齿类动物专用剪刀、剃刀、剪刀或化学脱毛剂去除头皮毛发。用 70% 乙醇和聚维酮碘交替擦拭三次对头皮进行消毒。所有手术器械也应经过高压灭菌，并用 70% 乙醇再次消毒。将动物固定于立体定位仪中，使用耳杆和鼻杆确保头部稳固。涂抹眼膏以防止角膜干燥。
- 使用手术刀从两眼之间向两耳之间切开头皮。将皮肤向两侧拉开以暴露颅骨，并用一对夹钳固定皮肤。清洁颅骨表面。将玻璃移液管尖端置于前囟点处，对立体定位仪进行归零校准。随后将移液管尖端移至注射位点（前后方向：3.30；内外侧方向：±0.82，分别对应左右半球）。需根据立体定位坐标的计算结果调整鼻杆位置。在本实验中，需调节鼻杆位置，使前囟点与注射位点处于相同高度。
- 确定注射位点后，使用高速外科钻在颅骨上小心钻孔。使用钩状针头清除残留的薄层骨组织，暴露硬脑膜。检查钻孔是否准确位于目标位置。钻孔时需注意避免损伤脑表面的血管。若血管破裂，可用小棉签或组织轻轻按压脑表面数秒，直至出血停止。
- 降低移液管，当移液管尖端接触脑表面时，对背腹方向高度进行归零。随后将移液管降至正确的背腹深度（背腹方向：自脑表面下 2.9 mm），等待 30 秒以使压力平衡。分 4 次注射病毒溶液，每次 50 nL，总计 200 nL。每次注射之间间隔 30 秒。
- 末次注射 1 分钟后，缓慢撤出移液管。对另一侧半球重复步骤 1.6–1.8。将动物从立体定位仪中取出，清洁切口并使用外科缝线缝合皮肤。将动物置于加热垫上恢复意识后，再放回笼中。此外，可在术后立即及术后连续 3 天给予非甾体类抗炎镇痛药（例如卡洛芬 4 mg/kg）。
2. 用于慢性LED植入 体内 嗅觉球中的光遗传学刺激
- 双侧注射慢病毒颗粒的动物随后将被长期植入微型蓝色LED（Osram，LED CMS 4.6W blue）。将LED引脚焊接到一个微型雌性电连接器上，使连接器位于LED的对侧。检查是否存在电路短路，并确定连接器上的正极和负极引脚。通过合适的电缆将LED连接至LED电流控制器以测试其功能。
- 为测量和/或设定LED的绝对光功率，将LED安装在微操作器上，并将其直接接触于功率计的光电探测器，以测量在470 nm峰值光强度下的光功率。在不透明的PVC板上钻一个直径为3 mm的针孔，将此针孔固定在功率计上，并建立光学功率与输入电流之间的标准曲线，以计算每平方毫米的光功率。2.
- 为测量光在脑组织中的传播，切取厚度分别为300、500、1000、1500和 2500 μm 厚度在 0-4°C 使用振动切片机的ACSF14. 将一块带有与活体小鼠相同颅骨开窗的颅骨碎片置于LED下方。首先，在无组织的情况下，将光功率计的探头对准LED中心测量光功率。然后，将每一块组织样本置于LED与光功率计的光电探测器之间，测量透过的光功率。根据组织厚度构建光衰减曲线 与 相对透射率，计算为通过组织测得的光功率与无组织时测得的光功率之比。
- 用100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪（溶于无菌生理盐水中）对小鼠进行麻醉。用70%乙醇清洁并消毒LED。去除动物头皮上的毛发，并用70%乙醇和聚维酮碘交替擦拭三次以消毒头皮。然后将动物置于立体定位仪中。涂抹眼膏以防止角膜干燥。将连接器固定至立体定位仪支架上。调整鼻杆位置，直至嗅球上方颅骨表面与微型LED表面完全水平且平行。
- 使用解剖刀从眼睛前方3 mm处开始，向后至耳后3 mm处切开头皮。将皮肤向两侧拉开，并用一对止血钳固定。用刀片刮除颅骨表面的膜状物。清洁并干燥颅骨。涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸酯粘合剂，以便后续粘接牙科用丙烯酸树脂。
- 使用高速外科钻在嗅球上方进行矩形开颅（前后方向1 mm，左右方向3 mm；中心位于人字缝前5.1 mm，0 mm处）。操作时，小心磨薄颅骨，直至仅剩一层极薄的骨层。借助弯头注射器针头小心去除残留骨片。操作过程中需格外注意，避免刺破硬脑膜以及损伤位于两个半球之间和嗅球尾侧边缘的主要血管。脑表面的血液积聚和凝固会阻碍光线在组织中的有效穿透。用无菌生理盐水冲洗开颅区域及脑表面，然后擦干颅骨。
- 将微型LED连接至连接器，将其置于嗅球顶部，微型LED的主轴应与小鼠的头尾轴平行。用无菌生理盐水清洁颅骨并使其干燥，随后用第一层丙烯酸树脂将LED固定在颅骨上即，聚羧酸盐水泥），然后覆盖第二层牙科丙烯酸树脂。可能需要添加两颗小螺丝以固定LED，螺丝应插入颅骨（位于LED位置后方），并用两层丙烯酸树脂覆盖。在丙烯酸树脂仍处于液态时，将头皮的游离边缘向后拉，并粘附于牙科丙烯酸树脂表面。注意避免将任何丙烯酸树脂涂覆到连接器上。待丙烯酸树脂完全硬化后，将动物从立体定位仪中取出，置于加热垫上恢复，随后放回笼中。术后动物需单独饲养，至少恢复七天。此外，可在手术后立即以及术后三天内给予非甾体抗炎镇痛药（例如，卡洛芬 4mg/kg）。LED应在植入前及实验结束后进行检测。
- 使用一根轻质的电线将动物与连接脉冲发生器（Master-8）的LED电流控制器相连，以控制LED的发光时序和强度。细电缆可确保动物活动完全自由。连接时需注意接头的极性，接反极性可能导致LED损坏。
3. 代表性结果：
转导后的神经元在注射后约48小时表达ChR2-YFP，并可稳定维持数月7。图1为注射后15天经多聚甲醛固定的动物脑组织矢状切面的代表性图像。可见RMS内标记密集且注射部位范围较大。大量新生细胞沿RMS迁移，定植于嗅球的不同层次（图1）。该融合蛋白在神经元的所有区室中均有表达，包括胞体、树突和树突棘。
微型LED植入技术可实现对大面积感兴趣区域进行大规模且低成本的光学刺激。动物通过一根轻便的电气电缆与LED控制器相连，从而在实验过程中保持完全的活动自由。通过表征光在脑组织中的扩散特性以及ChR2激活阈值，我们估计在LED表面下方约2 mm深度处仍可触发有效的光激活（图2A）。为监测表达ChR2的神经元的功能性激活情况 体内，可在重复光刺激后分析神经元活动标志物 c-fos 的表达（图 2B）。作为一种替代方法， 体外 对表达 ChR2 的神经元进行电生理记录并结合局灶性光刺激是可行的14最后，双光子靶向松散贴附记录技术已被用于研究类似微型LED对表达ChR2的皮层神经元的功能性激活 体内9.
图 1. 慢病毒注射至喙端迁移流中后 ChR2-YFP 的表达。 小鼠在喙端 RMS 注射慢病毒 15 天后，嗅球矢状切面的代表性共聚焦图像。可见新生 YFP 标记的神经元从 RMS 末端散在迁移至 OB 的不同层次。大多数新生细胞（95%）为颗粒细胞，其胞体位于颗粒细胞层（GCL），树突在外部丛状层（EPL）中分支。少量新生神经元迁移至 OB 最表层的球状层（GL）。比例尺，100μm。插图：新生颗粒细胞的高倍放大图像，显示 ChR2-YFP 在树突及树突棘上的膜表达。比例尺，20μm。
图2. 植入式LED位于嗅球上方的示意图，以及在表达ChR2-YFP的新颗粒细胞中光诱导的c-fos表达。
A，植入式LED位于嗅球上方的示意图。
B，代表性共聚焦图像，显示在对嗅球进行光刺激一小时后，双标记的ChR2-YFP+ c-fos+颗粒细胞。c-fos表达通过兔抗c-fos一抗（Calbiochem，1:5000）和A568标记的抗兔二抗（Invitrogen，1:1000）检测。比例尺，10μm。
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讨论
光遗传学工具最近增强了我们对特定神经元群体的控制能力，包括嗅觉系统中的成年新生神经元。本文描述了如何通过立体定位注射将表达ChR2-YFP的慢病毒载体注入特定群体的成年新生神经元中。通过仔细监测注射后的时期，我们能够分析并操控一群相对同龄的成年新生神经元的活动。
由于慢病毒载体扩散范围较小、转导效率高，并且对侧脑室下区迁移流（RMS）中的成神经细胞具有相对良好的趋向性，因此相较于其他病毒载体（如逆转录病毒或腺相关病毒（AAV）），应优先选用慢病毒载体。逆转录病毒载体只能特异性感染分裂期细胞（如干细胞或前体细胞），因此必须注射至侧脑室下区，且转导的新生神经元数量较少。与慢病毒载体相比，AAV载体的感染扩散范围更广。然而，应避免使用AAV转导RMS中的成神经细胞，因为它会同时转导周围结构（例如副嗅球核），而该区域会发出轴突投射回嗅球。最后，植入式LED也可应用于其他脑部浅表结构，例如皮层区域，通过病毒载体或转基因小鼠品系10在特定神经元群体中驱动ChR2的表达。
通过植入LED，我们能够对清醒且行为正常的动物...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到了人寿保险公司“Novalis-Taitbout”、巴黎神经科学学院（ENP）、法国国家科研署“ANR-09-NEUR-004”项目（在欧洲委员会第七框架计划“ERA-NET NEURON”框架内）、“医学研究基金会”、莱滕基金会和巴斯德基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯胺酮 | Merial | Imalgène 1000 | |
| 赛拉嗪 | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| 拉针仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 玻璃毛细管（3.5"） | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II 微量注射器 | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| 高速外科钻机 | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| 0.7 mm 尖端直径的钢制微型钻头 | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS 蓝光 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| 雌性电连接器（2.54 mm） | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| LED 电流控制器（最大：1A） | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| 脉冲发生器 | AMPI | Master-8 | |
| 光功率计 | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| 氰基丙烯酸酯粘合剂 | Loctite | 454 | |
| 聚羧酸盐水泥（第一层水泥） | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| 甲基丙烯酸甲酯水泥（第二层水泥） | GC International | Unifast Trad – 液体 (#339292) Unifast Trad – 粉末 (#339114) | |
| 卡洛芬 | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
参考文献
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重印与许可
