利用在吻侧迁移流中注射表达通道视紫红质2的慢病毒，并结合植入式微型LED进行慢性光刺激，可对嗅球中成年新生神经元进行光遗传学操控。
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本文内容
摘要
摘要
局部中间神经元在成年啮齿类动物的嗅球中持续再生1-3。这一过程被称为成年神经发生，起源于侧脑室壁的神经干细胞产生神经母细胞，这些神经母细胞沿着吻侧迁移流（RMS）迁移数毫米，最终到达并整合至嗅球。为了研究不同阶段以及新生神经元整合到已有嗅觉环路中的影响，有必要对这群特定神经元进行选择性标记并调控其活性。近年来发展的光遗传学技术使得研究人员能够利用光精确激活这群特定神经元，同时不干扰周围神经元的活动4,5。本文介绍了一系列实验步骤，通过病毒载体在神经母细胞进入嗅球并发育为成年新生神经元之前，实现对RMS中特定时间窗口内的一群神经母细胞特异性表达通道视紫红质2（ChR2）-YFP。此外，我们还展示了如何植入并校准微型LED，以实现对表达ChR2的神经元进行长期的体内光刺激。
方案
1. 立体定位注射
- 本实验所用病毒为基于 HIV 病毒的复制缺陷型慢病毒载体，该载体在突触素启动子驱动下表达 Channelrhodopsin2-YFP（黄色荧光蛋白）融合构建体6。该质粒由 K. Deisseroth 研究组慷慨提供（http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html）。慢病毒可从商业来源获取，或根据既定方案在实验室中制备7。平均病毒滴度约为 1010 转导单位/mL。病毒分装后应保存于 -80°C，使用前即刻解冻。避免反复冻融。切勿使病毒溶液直接接触干冰。
- 使用标准的拉针仪（Sutter P-97 拉针仪）将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制为玻璃移液管。拉针参数应适当校准，以获得长而刚性的移液管。随后用剪刀剪去移液管尖端，使其尖端直径达到 30–40 μm。将拉制好的移液管存放于无尘盒中。
- 按照制造商说明设置 Nanoject II 微量注射仪，使其每次注射量为 50 nL。通过从后端填充矿物油的方式准备注射用移液管，并将其插入微量注射仪的推杆中。将微量注射仪固定于立体定位仪框架上。在填充病毒溶液前，先将玻璃移液管中的部分矿物油排出。
- 使用移液器将 2 μL 病毒....
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讨论
光遗传学工具最近增强了我们对特定神经元群体的控制能力，包括嗅觉系统中的成年新生神经元。本文描述了如何通过立体定位注射将表达ChR2-YFP的慢病毒载体注入特定群体的成年新生神经元中。通过仔细监测注射后的时期，我们能够分析并操控一群相对同龄的成年新生神经元的活动。
由于慢病毒载体扩散范围较小、转导效率高，并且对侧脑室下区迁移流（RMS）中的成神经细胞具有相对良好的趋向性，因此相较于其他病毒载体（如逆转录病毒或腺相关病毒（AAV）），应优先选用慢病毒载体。逆转录病毒载体只能特异性感染分裂期细胞（如干细胞或前体细胞），因此必须注射至侧脑室下区，且转导的新生神经元数量较少。与慢病毒载体相比，AAV载体的感染扩散范围更广。然而，应避免使用AAV转导RMS中的成神经细胞，因为它会同时转导周围结构（例如副嗅球核），而该区域会发出轴突投射回嗅球。最后，植入式LED也可应用于其他脑部浅表结构，例如皮层区域，通过病毒载体或转基因小鼠品系10在特定神经元群体中驱动ChR2的表达。
通过植入LED，我们能够对清醒且行为正常的动物.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到了人寿保险公司“Novalis-Taitbout”、巴黎神经科学学院（ENP）、法国国家科研署“ANR-09-NEUR-004”项目（在欧洲委员会第七框架计划“ERA-NET NEURON”框架内）、“医学研究基金会”、莱滕基金会和巴斯德基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯胺酮 | Merial | Imalgène 1000 | |
| 赛拉嗪 | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| 拉针仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 玻璃毛细管（3.5"） | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II 微量注射器 | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| 高速外科钻机 | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| 0.7 mm 尖端直径的钢制微型钻头 | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS 蓝光 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| 雌性电连接器（2.54 mm） | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| LED 电流控制器（最大：1A） | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| 脉冲发生器 | AMPI | Master-8 | |
| 光功率计 | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| 氰基丙烯酸酯粘合剂 | Loctite | 454 | |
| 聚羧酸盐水泥（第一层水泥） | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| 甲基丙烯酸甲酯水泥（第二层水泥） | GC International | Unifast Trad – 液体 (#339292) Unifast Trad – 粉末 (#339114) | |
| 卡洛芬 | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
参考文献
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ.....
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