使用油脂全线Bicelle方法的膜蛋白的高通量结晶

Summary

Bicelles脂质/两亲分子的混合物保持在脂质双层膜蛋白（MPS），但有独特的相行为，有利于高通量筛选的结晶机器人。这项技术已成功地生产从原核和真核来源的高分辨率结构。本视频介绍了生成油脂全线Bicelle混合物，纳入全线Bicelle混合物的国会议员，成立从中长期的结晶试验（手动以及作为机器人）和收割晶体的协议。

Abstract

在许多生理过程，如抽水整个否则周围所有的细胞和细胞器的防渗膜双层的具体分子膜蛋白（MPS）发挥了关键作用。 MPS导致许多人类的疾病和失调的功能发生变化，因此，其结构复杂的认识，仍然是生物学研究的重要目标。然而，国会议员的决心结构仍然是一个重大的挑战往往来自其疏水性所引起的。

国会议员的双层内嵌入大量的疏水区域。经常使用的洗涤剂这些蛋白质溶解产生一种蛋白质，然后可以在一个类似的方式为可溶性蛋白操纵洗涤剂胶束双层。传统上，进行结晶试验使用一种蛋白质清洁剂的混合物，但他们往往抵制结晶或生产质量较差的晶体。出现这些问题，因洗涤剂无法充分模仿双层导致稳定性差和异质性。此外，洗涤剂盾牌疏水表面的MP减少晶体接触的表面积。来规避这些弊端国会议员可结晶油脂的媒体，更加紧密地模拟其内源性环境，并在最近成为了MP的结晶新技术。

油脂立方米阶段（LCP）是一个立体的脂质双层^渗透 1水通道的互联系统。虽然monoolein是选择脂质，如monopalmitolein和monovaccenin相关的血脂也被用来做LCP ^的 2 。国会议员被纳入LCP的，他们在三个层面和饲料晶核弥漫。 LCP的一个巨大优势是，该蛋白在更自然的环境中仍然存在，但该方法具有技术的弊端，包括高VISCosity（需要专门的仪器），并在晶体中的可视化^和操纵3,4的困难。由于这些技术上的困难，我们利用另一个结晶bicelles ^5,6（ 图1）油脂中。 Bicelles是与两亲（CHAPSO）或短链的脂质（DHPC）一个混合的磷脂酰胆碱脂质（DMPC）所形成的脂质/两亲分子的混合物。在每个全线Bicelle光盘，脂质分子生成双层而行两亲分子的非极性边缘的双层和洗涤剂提供有益的特性。重要的是，其转变温度以下，蛋白全线Bicelle混合物粘度降低和控制在一个类似的方式溶解洗涤剂，国会议员，bicelles兼容结晶机器人。

Bicelles已成功地用于结晶几个膜蛋白^5,7-11（见表1）。这种增长的集合蛋白质演示的bicelles结晶从原核和真核来源的α-螺旋和β表国会议员的多功能性。由于这些成功和高通量实施简单，bicelles应该是每一个膜蛋白晶体学的武器库中的一部分。在这个视频中，我们描述全线Bicelle方法，并提供一个一步一步的协议，使用标准的机器人纯化国会议员成立的高通量结晶试验。

Protocol

全线Bicelle基础的结晶，是由四个基本步骤（图2）:我）准备一个全线Bicelle形成脂质:两亲分子的混合物;二）进入全线Bicelle介质的纯化蛋白质的结合;三）结晶试验（手动或自动机械）;及iv）可视化，晶体的提取和冻结。下面详细介绍这些步骤

1。准备的Bicelles

Bicelles可以形成:两亲组合在各种脂质的浓度范围。因此，基于以往的成功条件，初步构成建议（ 见表1） 。最成功的混合物DMPC:CHAPSO全线Bicelle制定，可以购买商业作为预混使用现成的制定（见下面试剂表）或所描述的那样在实验室准备。在本练习中我们将准备在2.8:1的摩尔比1毫升35％DMPC:CHAPSO混合物。

1. 全线Bicelle的比例在10％-40％之间，可以改变一个DMPC:CHAPSO摩尔比从2.6-3.0:1不等（表1）。
2. 注意:全线Bicelle浓度越难以溶解脂质，导致在一个较高的的溶液粘度越高。然而，一个集中的全线Bicelle制定有利的蛋白质浓度低时。
3. 溶解脂质获得一个同质的解决方案，需要相当大的努力，使这一步的大部分时间消耗在全线Bicelle方法。完全混合通过以下步骤，直到DMPC与周期:
   1. 温暖的混合物〜40℃水浴或培养箱〜1分钟的旋....

Discussion

Bicelles是一个独特的，提供原生双层式的环境，而表现犹如洗涤剂溶解油脂媒体。此属性，给出了bicelles一个明显的优势超过其他脂质体的结晶方法，因为没有学习曲线，这种技术所需的专用设备。一旦bicelles，无论是商业或准备在实验室中，他们可以直接与纯化的蛋白质，从这个角度混合结晶试验几乎完全与标准洗衣粉的协议进行的。此外，bicelles提供了包括与其他技术相比，延长贮存期，蛋白质简单地纳入，高吞吐能力，使用标准的机器人技术和常规的可视化和晶体提取几个实用的优点。另一个明显的优势是与特定的优化血脂涂料bicelles的能力，或如果显示有利于感兴趣的蛋白质。两者合计，在梨皮DIC全线Bicelle方法结合提供了相当的通用性，与实际的易于使用，使得它很容易为​​所有的膜蛋白结晶项目收养。

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