高通量膜蛋白结晶的脂质双层微碟法

摘要

双亲分子小片（bicelles）是由脂质/两亲分子组成的混合物，可在脂质双层环境中维持膜蛋白（MPs）的稳定性，同时具有独特的相行为，便于通过结晶机器人进行高通量筛选。该技术已成功解析了多种原核和真核来源的高分辨率结构。本视频介绍了制备脂质双亲分子小片混合物、将膜蛋白嵌入该混合物、设置结晶实验（包括手动和机器人操作）以及从培养基中收获晶体的实验方案。

摘要

膜蛋白（MPs）在许多生理过程中发挥着关键作用，例如将特定分子转运通过原本不可渗透的细胞和细胞器周围的膜双层结构。膜蛋白功能的改变会导致多种人类疾病和障碍；因此，深入理解其结构仍是生物学研究的关键目标。然而，膜蛋白的结构解析仍面临重大挑战，这通常源于其疏水性。

膜蛋白（MPs）具有大量嵌入双分子层的疏水区域。通常使用去垢剂将这些蛋白质从双分子层中溶解出来，形成蛋白-去垢剂胶束，随后可像可溶性蛋白一样进行操作。传统上，结晶实验采用蛋白-去垢剂混合物进行，但这类混合物常常难以结晶，或产生的晶体质量较差。这些问题主要源于去垢剂的存在。′其无法充分模拟脂双层，导致稳定性差和异质性。此外，去垢剂会遮蔽膜蛋白的疏水表面，减少可用于晶体接触的表面积。为克服这些缺点，可在脂质介质中对膜蛋白进行结晶，该方法更接近其内源性环境，近年来已成为膜蛋白结晶的一种从头技术。

脂质立方相（LCP）是一种三维脂双层结构，其内部贯穿有相互连通的水通道系统¹。尽管单油酸甘油酯是首选脂质，但其他相关脂质如单棕榈油酸甘油酯和单疫苗酸甘油酯也已被用于制备LCP²。膜蛋白被嵌入LCP中，在三维空间中扩散并促进晶体成核。LCP的一大优势在于蛋白能够保持更接近天然的环境；但该方法存在若干技术上的缺点，包括高黏度（需要专用设备）以及晶体观察和操作困难^3,4。由于这些技术难题，我们采用了另一种脂质介质进行结晶——bicelles^5,6（图1）。Bicelles是由磷脂酰胆碱脂质（DMPC）与两亲性分子（CHAPSO）或短链脂质（DHPC）混合形成的脂质/两亲体复合物。在每个bicelle盘状结构中，脂质分子形成双层结构，而两亲性分子则排列在非极性边缘，兼具脂双层和去垢剂的有利特性。重要的是，在相变温度以下，蛋白-bicelle混合物的黏度降低，其操作方式与去垢剂溶解的膜蛋白相似，因此bicelles可兼容结晶机器人系统。

双亲性微粒已成功用于结晶多种膜蛋白^5,7-11 （表1）这一不断扩大的蛋白质集合展示了双层胶束（bicelles）在结晶原核和真核来源的α螺旋及β折叠跨膜蛋白方面的多功能性。鉴于这些成功案例以及其在高通量应用中的简便性，双层胶束应成为每一位膜蛋白晶体学家实验工具中的常规组成部分。′其武器库。在本视频中，我们介绍双层胶束（bicelle）方法，并提供利用标准机器人系统对纯化的膜蛋白进行高通量结晶试验的逐步实验方案。

方案

基于bicelle的结晶包含四个基本步骤（图2）：i）制备形成bicelle的脂质：两亲性分子混合物；ii）将纯化的蛋白质掺入bicelle介质中；iii）结晶试验（手动或机器人操作）；以及iv）观察、晶体提取和冷冻。以下将详细描述这些步骤

1. 双层磁排列脂质立方相的制备

双亲分子膜（bicelle）可在多种脂质与两亲分子的组合及广泛浓度范围内形成。因此，建议初始配比参照以往成功的实验条件（表1）。其中最有效的混合物为DMPC:CHAPSO双亲分子膜配方，该配方可直接购买商用的预混即用型制剂（见下文试剂列表），也可按所述方法在实验室自行制备。本实验中，我们将制备1 ml摩尔比为2.8:1的35% DMPC:CHAPSO混合液。

1. 称取 0.26 g DMPC（分子量 677.9 g/mol）、0.09 g CHAPSO（分子量 630.9 g/mol），并加入去离子水至终体积为 1.0 ml。
   • 双层微粒（bicelle）的百分比可在 10%–40% 之间变化，DMPC:CHAPSO 的摩尔比范围为 2.6–3.0:1（表 1）。
   • 注意：双层微粒浓度越高，脂质越难溶解，导致溶液黏度升高。然而，当蛋白浓度较低时，使用高浓度双层微粒配方可能具有优势。
2. 将脂质溶解以获得均一溶液需要大量操作，是双层微粒制备方法中最耗时的步骤。重复以下步骤，直至 DMPC 完全混合：
   1. 使用水浴或培养箱将混合物加热至约 40°C，并涡旋约 1 分钟。
      • 注意：随着循环次数增加，加热后的混合物会呈现凝胶状，难以进行涡旋。
   2. 将混合物置于冰上冷却，并涡旋数分钟。冷却有助于使溶液液化，便于涡旋操作。
      • 注意：随着操作循环次数增加，混合物在冷却后可能变得浑浊。
   3. 重复上述步骤（1.2.1 和 1.2.2），直至脂质完全溶解。
      • 注意：此过程可能需要数小时。双层微粒的形成可通过 DMPC:CHAPSO 配方相行为的变化来判断。完成后，混合物在室温或更高温度下呈透明凝胶状，在冰上则为黏稠液体。
3. 双层微粒混合物现已可直接使用，也可在 -20°C 下长期保存（最长可达 5 年）。由于磷脂头部基团存在水解风险，不建议将双层微粒在室温下长期储存。

2. 将蛋白质整合入bicelle

大多数从双层胶束获得的膜蛋白结构是在DMPC:CHAPSO双层胶束浓度为2%至8%、蛋白浓度为8至12 mg/ml的条件下结晶的（表1）。如果可能，初步筛选应遵循这些参数，额外的浓度可在优化阶段进一步测试。与LCP法相比，使用双层胶束进行蛋白组装的过程较为简单（图3），且应在与结晶实验同一天完成。

1. 将 DMPC:CHAPSO 双层胶束混合物在室温下解冻，直至其相变为透明凝胶状。
   • 注意：多次冻融不会影响双层胶束的性质。
2. 将混合物置于冰上使其液化，并短暂涡旋以重新形成均匀的双层胶束相。当放置在冰上时，混合物可能变得浑浊。
3. 从此步骤开始，始终将双层胶束混合物和纯化的蛋白质置于冰上。这有助于保持双层胶束处于液态，便于移液操作。
4. 按 1:4（V/V）的比例将双层胶束混合物加入纯化的去垢剂溶解的蛋白质中。
   • 例如：通过将 80 μl 蛋白质与 20 μl 双层胶束混合，可得到 100 μl 蛋白质-双层胶束混合液。若蛋白质浓度为 15 mg/ml，双层胶束浓度为 35%，则最终所得的含双层胶束蛋白质混合液中，蛋白质浓度为 12 mg/ml，双层胶束浓度为 7%。
5. 通过轻柔地吹打混合溶液，直至其变得澄清且均匀。
   • 注意：若出现气泡，可使用台式离心机短暂离心（30–60 秒，13000 rpm，4°C）以去除气泡。
6. 将混合物在冰上孵育至少 30 分钟，以促进蛋白质完全嵌入双层胶束中。此时，蛋白质-双层胶束混合物已准备好用于结晶试验。

3. 设置结晶实验

其他脂质结晶技术（如LCP）由于介质原因需要使用专用设备′具有高粘度；但双层微粒的独特相行为使其几乎可用于任何标准的结晶方法，包括机器人自动化系统图3可采用标准市售筛选试剂盒，通过悬滴法或坐滴法进行结晶试验。

1. 无论是手动设置板还是使用结晶机器人，均需将蛋白-双微粒混合物置于冰上。这能保持蛋白-双微粒混合物的低温状态，并确保溶液的黏度最低。
2. 手动结晶实验——使用标准移液器，可将蛋白质-双层脂质微粒混合物与储液溶液混合，操作方式与通常用于可溶性或去垢剂增溶的膜蛋白的方法相同。
   • 注意： 实验过程中将蛋白质-双层微粒混合物置于冰上。
3. 机器人结晶实验 - 我们已针对Mosquito结晶机器人优化了这些实验方案，但原则上（遵循相同的注意事项），该技术应适用于所有结晶机器人。以下建议可确保蛋白-双层微粒混合物保持低温，并被机器人准确移液：
   1. 将装有蛋白质-双层微粒混合物的平板置于冰上预冷。
   2. 将蛋白质-双胶束混合物用移液器加入到孔板中，并继续将孔板置于冰上。在开始运行前，该孔板应最后放置到机器人系统上。
   3. 在蚊式机器人平台3和平台5上分别安装储液槽托盘和结晶盖。
   4. 将含有蛋白质-双胶束混合物的培养皿置于蚊式机器人平台4上。这可确保机器人最后吸取蛋白质-双胶束混合物，并立即释放。
   5. 为防止发热和黏度增加，请勿将储存液与蛋白质-双胶束混合物混合。
   6. 进行多个筛选实验时，一旦完成一次运行，立即将双分子层胶束-蛋白板放回冰上冷却。
4. 液滴体积及比例（蛋白质：储液）可参照常规结晶实验进行选择。例如，使用 Mosquito 机器人进行的初始结晶实验可采用 0.25 μl 蛋白质：bicelle 混合物加 0.25 μl 储液器
5. 在20℃的培养箱中孵育晶体试验°C. 温度是一个良好的筛选和优化参数，因为双层磁性脂质颗粒（bicelles）的相行为具有温度依赖性。
   • 较高温度诱导层状相的形成¹² (图1），其优点在于可将蛋白质预先分层排列。温度低于20°C 可以进行筛选，但不应低于 4°C，因为长时间存放可能导致脂质沉淀。
6. 与传统结晶实验一样，应定期监测bicelle实验中晶体的出现和生长情况。我们建议在第1天检查培养板^st 和 3^rd 设置后第1天开始，随后每周检查一次。
7. 晶体优化可采用常规用于去垢剂晶体的方法进行，包括网格筛选、添加剂筛选、改变温度等。此外，还可调整bicelle的百分比以及蛋白与bicelle的比例。进一步地，可在bicelle中掺入特定脂质，这些脂质可能对蛋白的稳定性或功能至关重要。

4. 可视化、晶体提取与冷冻

由于蛋白质-双层微粒混合物的结晶实验具有与蛋白质-去污剂液滴相似的黏度，因此可视化和晶体提取为常规操作，可按照传统装置进行。

1. 观察：与通常需要在普通光和偏振光下使用高质量照明来检测晶体的LCP培养基不同，使用bicelles时观察不受干扰。无论是有色还是无色的蛋白质晶体液滴，均可使用常规显微镜轻松分析，无需特殊设备。
2. 与其它脂质培养基类似，bicelles容易产生较高比例的假阳性结果。使用紫外显微镜可有效区分蛋白质晶体与盐晶体（图4）。
3. 晶体提取与冷冻：晶体的提取和冷冻过程相对简单，无需溶解周围的bicelles培养基。此外，bicelles相本身可提供一定的中等程度的冷冻保护作用。

5. 代表性结果：

晶体通常需要2-3天出现，大约一周或更长时间才能生长至最大尺寸。嗜盐菌紫红质和小鼠电压依赖性阴离子通道1（mVDAC1）晶体的情况就是这样^4,8。对于其他膜蛋白，晶体生长可能需要数周时间，因此必须在最初几周之后持续监测晶体实验。

与其他脂质介质一样，bicelle 容易形成看似晶体的结构。此外还观察到，它们会导致更高比例的盐和去垢剂晶体析出。使用可检测色氨酸荧光的紫外显微镜，可显著帮助排除此类非蛋白质来源的假阳性结果。图4展示了在可见光和紫外光下观察到的脂质结构、盐晶体和蛋白质晶体，以帮助区分可能观察到的不同结果。

图1. bicelle 示意图。bicelle 由形成双层结构的脂质分子（如 DMPC，蓝色）和两亲性分子（如 CHAPSO，绿色）组成，后者可保护双层结构的疏水边缘。随着温度升高，盘状 bicelle 会发生相变，转变为穿孔的层状片层¹²。

图2. 双层微晶结晶方法的流程图，概述了四个基本步骤。

图3. 晶体筛选实验设置示意图。纯化后的去垢剂增溶膜蛋白可直接在冰上与bicelles混合，仅需用移液器将两者溶液混合即可。将蛋白/bicelles混合物在冰上孵育约30分钟后，可采用任何标准方法（包括机器人自动化系统）进行结晶筛选实验。

图4. 晶体筛选结果的可视化。可见光图像（上图）和紫外光图像（下图）显示：（A）仅含盐条件下观察到的针状晶体。晶体无荧光信号，表明为假阳性。（B）在含MPD条件下形成的棒状晶体。晶体有微弱荧光，但经X射线衍射分析确认其不含蛋白质成分。（C）筛选实验设置约四周后观察到的晶体。在紫外光下呈现强烈荧光，证实为蛋白质晶体。

编号	蛋白质	来源	双层微粒制剂	蛋白质浓度	去垢剂1	分辨率 (Å)	参考文献
1	细菌视紫红质2	Halobacterium salinarum	8% DMPC:CHAPSO (2.8:1)	8 mg/ml		2.0	Faham 和 Bowie, 2002
			8% DTPC:CHAPSO (3:1)	8 mg/ml		1.8	Faham 等, 2005
2	β2-肾上腺素能受体/Fab 复合物	Homo sapiens	8.3% DMPC:CHAPSO (3:1)	10 mg/ml	DDM	3.4/3.7	Rasmussen 等, 2007
3	电压依赖性阴离子通道1	Mus musculus	7% DMPC:CHAPSO (2.8:1)	12 mg/ml	LDAO	2.3	Ujwal 等, 2008
4	黄视紫红质	Salinibacter ruber	4.2% DMPC, 5% NM	4 mg/ml	DDM	1.9	Luecke 等, 2009
5	菱形蛋白酶	Escherichia coli	2% DMPC:CHAPSO (2.6:1)	9 mg/ml	壬基葡萄糖苷	1.7	Vinothkumar, 2011

1 用于膜蛋白纯化的去垢剂
2 紫膜中的天然脂质在纯化过程中可能会被一同带出

表1. 使用bicelles解析膜蛋白结构的结晶条件汇总。

讨论

双亲性微碟（bicelles）是一种独特的脂质介质，可提供类似天然双分子层的环境，同时表现出类似去垢剂溶解的性质。这一特性使双亲性微碟相较于其他基于脂质的结晶方法具有明显优势，因为该技术无需特殊学习过程或专用设备。一旦获得双亲性微碟（无论是商业购买还是实验室制备），即可将其直接与纯化的蛋白质混合，随后的结晶实验流程几乎与标准的去垢剂基方法完全相同。此外，与其它技术相比，双亲性微碟还具备多种实际优势，包括可长期储存、蛋白质掺入简便、可利用标准机器人系统实现高通量操作，以及便于常规观察和晶体提取。另一个显著优势是可向双亲性微碟中掺杂特定脂质，以进行条件优化，或在已知对目标蛋白有益的情况下使用。综上所述，脂质双亲性微碟方法兼具高度的灵活性和操作简便性，可轻松应用于所有膜蛋白结晶项目。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMPC	Affymetrix	D514
CHAPSO	Affymetrix	C317
即用型双层微粒（Ready-to-use Bicelles）	MemX Biosciences	MX201001/MX201002
结晶筛选试剂盒（Crystallization Screens）	Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience		可使用标准的市售试剂盒进行初步筛选
结晶实验设置（Crystallization Set-up）			可使用实验室现有的标准手动和/或机器人自动化设置方法