在以下章节中，我们概述了用于生物医学应用的海藻酸盐微球的制备方法。我们重点介绍一种用于制备多层海藻酸盐微球的技术，该技术可同时包封细胞和蛋白质，有望用于治疗1型糖尿病。
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本文内容
摘要
摘要
由于海藻酸盐类材料具有亲水性、生物相容性以及独特的物理结构，其在生物医学领域已受到广泛关注。其应用包括细胞包封、药物递送、干细胞培养以及组织工程支架。事实上，目前已有临床试验正在开展，通过将胰岛细胞包封于聚-L-鸟氨酸（PLO）包被的海藻酸盐微球中，用于治疗I型糖尿病。然而，由于移植后细胞存活率较低，需要大量胰岛细胞才能达到治疗效果。若能在包封细胞周围局部促进微血管网络的形成，则可通过改善氧气、葡萄糖及其他重要营养物质的输送，提高细胞的存活率。成纤维细胞生长因子-1（FGF-1）是一种天然存在的生长因子，能够促进血管生成，并改善缺血组织中的氧含量。与单次大剂量给药相比，持续释放方式可显著增强FGF-1的疗效。若能在胰岛包封系统中实现生长因子的局部长期释放，将有望引导血管直接向移植细胞生长，从而可能改善移植物的功能效果。本文中，我们概述了用于生物医学应用的海藻酸盐微球的制备步骤。此外，我们还介绍了一种自主研发的多层海藻酸盐微球的制备方法：细胞可包封于内部的海藻酸盐核心中，而促血管生成蛋白则置于外部的海藻酸盐层中。该外层蛋白的释放将可刺激局部微血管网络直接向移植的胰岛细胞生长。
方案
本方案描述了一种制备多层海藻酸盐微球的三步法（图1）。首先形成海藻酸盐微球（图2A），该步骤详见下文第1节。在此步骤中可将细胞或蛋白质加入微球，以实现递送功能。下一步是在微球表面形成一层具有选择透过性的屏障层，详见第2节。最后一步是形成额外的海藻酸盐外层，详见第3节。该外层位于微球表面外部（图2B），可用于包封和递送治疗性分子（图2C），从而在移植后调控细胞对该系统的响应。
1. 藻酸盐微珠的制备
- 通过将15克LVM海藻酸盐溶解于1 mL内层海藻酸盐溶液（25 mM HEPES缓冲液、118 mM NaCl、5.6 mM KCl和2.5 mM MgCl2溶于去离子水中，调节pH至7.4）中，制备1.5% (w/v)的LVM海藻酸盐溶液。在涡旋振荡器上混合，直至海藻酸盐完全溶解，形成澄清且黏稠的溶液。注意：本方案描述了在海藻酸盐微胶囊中包封胰岛细胞的最佳条件1。可根据其他应用（如药物递送、组织工程等）的需求调整海藻酸微球的浓度与组成。注意：进行细胞包封时，可在将海藻酸盐溶液装入微胶囊装置前，将胰岛细胞加入该溶液中。
- 通过将100 mM CaCl2和10 mM HEPES缓冲液溶解于去离子水中并调节pH至7.4，制备交联溶液（22 mM CaCl2溶于去离子水中）。注意：根据所需海藻酸凝胶的性质，可使用其他二价阳离子（如Br2+、Sr2+等）替代Ca2+。
- 安装双通道气流套管式海藻酸盐微胶囊装置：将25号针头连接至注射器，并调节两侧阀门，确保针头位于气流套管中心位置。可根据目标海藻酸微珠的尺寸选择不同规格的针头。
若无微胶囊装置，也可使用注射器完成此步骤。将海藻酸盐溶液装入注射器，并根据所需微珠尺寸选择合适的针头规格。 - 在针头正下方放置一个含有10 mL交联溶液的烧瓶，并在溶液中放入磁力搅拌子。
- 将液滴直接注入CaCl2溶液中，使海藻酸盐交联形成微珠。将微珠置于交联溶液中孵育至少十五分钟，并持续搅拌以完成固化。
- 将微珠转移至15 mL离心管中。去除残留溶液，并用含0.2% CaCl2的生理盐水溶液洗涤三次，每次两分钟。
2. 用多聚-L-鸟氨酸包被微珠
- 在生理盐水中配制 3 mL 的 0.1% (w/v) 聚-L-鸟氨酸 (PLO) 溶液。将溶液置于涡旋振荡器上，直至完全溶解，形成澄清溶液。此步骤中可使用聚-L-赖氨酸 (PLL) 替代 PLO，所得选择透过性水平相似。
- 将海藻酸盐微珠转移至 PLO 溶液中。置于涡旋振荡器上反应 30 分钟，使 PLO 有足够时间与海藻酸盐相互作用，形成多聚阳离子-多聚阴离子复合物。30 分钟后，海藻酸盐微珠周围应出现明显可见的白色包被层。
- 移除 PLO 溶液，并用含 0.2% CaCl2 的生理盐水洗涤三次，每次两分钟。
3. 制备外层海藻酸盐
- 制备所需浓度的海藻酸盐溶液，用于形成外层。该溶液的制备方法如上文(1.1)所述。外层的大小受所用海藻酸盐的组成和浓度影响（图3）。
- 将海藻酸盐微珠转移至细胞过滤器中。使用Kimwipe纸吸除多余溶液，尽可能将微珠干燥。
- 将微珠转移至Parafilm表面。可根据需要，用其他光滑表面（如玻璃或塑料培养皿）替代Parafilm。
- 将步骤(3.1)中制备的海藻酸盐溶液涂覆于海藻酸盐微珠上。所加溶液的体积应完全覆盖微珠。让微珠在海藻酸盐溶液中静置45分钟。
- 使用移液器移除未结合到微珠上的多余海藻酸盐溶液。
- 将微珠转移至22 mM CaCl2溶液中。该步骤可使海藻酸盐溶液在微珠周围发生交联，从而形成明显的外层海藻酸盐结构。
- 用22 mM CaCl2的生理盐水溶液洗涤三次，每次两分钟。在显微镜下观察微珠，应可见围绕核心微珠形成的明显外层海藻酸盐结构。
4. 典型结果
图 1. 多层海藻酸盐微珠制备流程示意图。经 Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95(2), 632-40 (2010) 许可转载。
图 2. （A）和（B）为海藻酸盐微珠的相差显微图像。（A）显示合成步骤（1.7）后的微珠，而（B）显示完成步骤（3.7）后出现的明显外层海藻酸盐结构。（C）为荧光标记的 BSA 蛋白在外层包封的 FITC 图像。经 Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov;95(2), 632-40 (2010) 许可转载。
图 3. 外层海藻酸盐的尺寸可根据所用海藻酸盐的组成和浓度进行调节。我们的结果表明，对于 LVM 和 LVG 型海藻酸盐，外层尺寸均随海藻酸盐浓度的增加而增大，且在相同浓度下，LVG 型海藻酸盐产生的外层厚度大于 LVM 型。经许可转载自 Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95(2), 632-40 (2010)。
图4. 血管生成生长因子蛋白FGF-1从外层海藻酸盐层的释放情况随所用LVM和LVG海藻酸盐浓度的不同而变化。(A)和(B)显示不同外层配方下FGF-1的释放百分比，(C)和(D)表示相应的FGF-1质量释放量随时间的变化。所有条件下在最初5小时内均表现出突释现象（A和C），随后可持续低剂量释放长达30天（B和D）。经许可转载自Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95(2), 632-40 (2010)。 点击此处查看高清大图。
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讨论
海藻酸盐是一种从藻类中提取的天然酸性多糖，由1,4'-β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）单元组成2,3。当二价阳离子（如Ca2+、Sr2+或Ba2+）与G-单体相互作用，在相邻的海藻酸盐链之间形成离子桥时，即可发生简单的凝胶化过程。海藻酸盐微球已被用于递送多种蛋白质，包括成纤维细胞生长因子-1（FGF-1）、神经生长因子、白血病抑制因子、血管内皮生长因子（VEGF），以及包封软骨细胞、肝细胞和胰岛细胞等。使用此类微粒聚合物系统的优势包括：保护蛋白质和细胞在体内不被降解和引发反应、微小的颗粒体积便于通过注射给药，以及通过调控材料的物理性质来控制溶质的扩散。
目前，表面包被有选择性渗透聚合物层的海藻酸盐微球正在开展用于治疗1型糖尿病的临床试验。然而，移植后包封胰岛的长期存活能力在一定程度上依赖于其从血管血液供应中获取氧气和营养物质的能力。一种既能作为胰岛包封系统、又能作为促血管生成蛋白持续递送系统的生物材料体系，可能促进移植细胞周围的血管生长，从而提高移植物的存活率。持续性的新生血管...
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致谢
本研究由美国退伍军人事务部（华盛顿特区）、国家科学基金会（阿灵顿，弗吉尼亚州）资助，资助编号为0852048、0731201和0854430，以及美国国立卫生研究院（贝塞斯达，马里兰州）的RO1 DK080897资助。Khanna先生获得了比尔及梅琳达·盖茨基金会（西雅图，华盛顿州）Edward Ross先生和Monica Moya博士慷慨捐赠的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Pronova Ultrapure LVG 藻酸盐 | Nova-Matrix | 4200006 | 提供多种藻酸盐配方。藻酸盐的选择会影响微珠的最终特性，包括尺寸、机械性能和传质性能。应针对特定应用优化所用配方的组成。 |
| Pronova Ultrapure LVM 藻酸盐 | Nova-Matrix | 4200206 | 提供多种藻酸盐配方。藻酸盐的选择会影响微珠的最终特性，包括尺寸、机械性能和传质性能。应针对特定应用优化所用配方的组成。 |
| 聚-L-鸟氨酸盐酸盐 | Sigma-Aldrich | P2533 |
参考文献
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- Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads. J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).
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- Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation. Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).
- Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration. Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).
- Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering. Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells. Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1. J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).
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