等离激元镊子和光子晶体纳米结构可有效提高光学捕获微纳米粒子的效率并实现取向控制。
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摘要
摘要
一种能够以非破坏性方式操控亚微米级颗粒位置和取向的方法，将为基础生物学研究提供极为有用的工具。目前用于实现小颗粒无创操控的最广泛应用的物理力是介电电泳（dielectrophoresis, DEP）1。然而，由于传统DEP依赖于固定电极，其在操控细胞时缺乏所需的灵活性和精确性。光镊技术利用三维电磁场梯度对小颗粒施加作用力，能够实现理想的灵活性与精度2。但该方法的主要缺点是需要高强度的辐射才能产生足够的捕获力，这可能对生物样品造成损伤3。一种可实现较低光强下捕获与分选的解决方案是光电子镊（optoelectronic tweezers, OET），但OET在小颗粒精细操控方面存在局限性；同时，由于其基于DEP技术，也对溶液的性质有所限制4,5。
本视频文章将介绍两种降低活细胞光学操控所需辐射强度的方法，并描述一种取向控制方法。第一种方法是等离激元镊子，该方法使用随机分布的金纳米颗粒（AuNP）阵列作为样品基底，如图1所示。AuNP阵列将入射光子转化为局域表面等离激元（LSP），后者由共振偶极矩组成，能够辐射并产生具有显著梯度的图案化辐射场，作用于细胞溶液中。Righini等人早期关于表面等离激元增强捕获的研究以及我们自己的建模结果表明，等离激元基底产生的场通过增强捕获粒子所需的梯度场，显著降低了初始所需光强。6,7,8 由于光学能量向机械能的转换效率更高，且辐射场依赖于偶极特性，等离激元方法可在低光强条件下实现对椭球形粒子和细胞的精细取向控制。这些场分布如图2所示，低捕获光强的具体数据见图4和图5。等离激元镊子的主要问题是LSP会产生大量热量，且捕获仅限于二维。该热量会引发对流和热泳效应，其强度足以将亚微米级粒子从捕获区域排出。9,10 我们将介绍的第二种方法是利用周期性电介质纳米结构，将入射光高效地散射至衍射模式中，如图6所示。11 理想情况下，应采用电介质材料制备该结构，以避免等离激元镊子中出现的加热问题；但在本方法中，使用铝涂层衍射光栅作为一维周期性电介质纳米结构。尽管该材料并非半导体，但未观察到显著加热现象，并能在低捕获光强下有效捕获微小粒子，如图7所示。粒子与光栅基底的对齐现象从概念上验证了二维光子晶体可实现对非球形微米级粒子的精确旋转控制。10 本文所述纳米结构所产生的增强场显著提高了这些光学捕获装置的效率。
方案
1. 随机金纳米颗粒阵列的制备 8,10,12,14
- 首先通过制备模板形成金纳米颗粒阵列，该模板由平均直径为454 nm的随机吸附的乳胶微球致密层构成。具体方法是先在玻璃盖玻片上使用铬作为粘附层，蒸发沉积20 nm厚度的金。
- 然后将聚苯乙烯微球单层通过将金涂层基底暴露于1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、乳胶微球悬浮液和去离子水的混合物中实现自组装。
- 吸附过程持续约一小时，随后用大量水冲洗去除未吸附的微球。
- 形成的单层自然风干。
- 最后，在乳胶微球单层上再蒸发沉积20 nm厚的金，从而形成随机分布的金纳米颗粒阵列。
- 若有扫描电子显微镜（SEM）可用，可在SEM下观察AuNP阵列，其形貌如图1所示，图8展示了该过程的示意图。
2. 生物样本制备9,11
- 现在展示用于光学捕获小鼠细胞核的样品制备过程。
- 标记了吖啶橙染料的小鼠 3T3 细胞核由弗雷德·哈钦森癌症研究中心的 Tewari 团队提供。
- 将磷酸盐缓冲液（PBS）中含 10% 牛血清白蛋白（BSA）以大约 1 : 10（BSA : 小鼠细胞核）的比例加入小鼠细胞核中。BSA 有助于防止细胞核粘附到基底上。
- 使用超声处理混合溶液。
- 取 5 µL 溶液滴加到铝制光栅阵列盖玻片上。最好在铝制光栅位于显微镜载物台时进行此步骤，以避免溶液滴加后转移样品。
- 使用两组叠放的 1 英寸 × 1 英寸盖玻片支撑第五片盖玻片，通过该盖玻片观察样品。
- 将样品置于显微镜下进行观察。
3. 捕获方法
- 通过将35 mW氦氖激光器发射的光束导入配备GFP 17滤光片组的蔡司Axio Imager.D1M显微镜，并对该滤光片组进行改造以允许633 nm激光辐射到达样品，从而构建光镊系统。
- 使用蔡司LD EC Epiplan - NEOFLUAR 50倍物镜对直径约为5微米的细胞核进行成像。
- 将样品置于物镜下后，调节显微镜聚焦于金纳米颗粒阵列或衍射光栅。
- 垂直移动显微镜直至聚焦到需要捕获的细胞核上。
- 将激光捕获光斑定位在颗粒上方，此时颗粒应能在激光光斑中稳定保持其位置，即使移动载物台亦能维持不动。
4. 代表性结果：
随机金纳米颗粒阵列的制备过程应沉积一层金纳米颗粒（AuNP），在扫描电镜（SEM）下观察应如图1所示。这些等离激元镊子所产生的捕获力可达标准光镊所产生的力的10至20倍。图4展示了不同尺寸颗粒实现 confinement 所需的等离激元镊子的最低强度9,10。与金纳米点相比，衍射光栅实现了更高的对准和捕获效率，捕获效率高出20倍，并且仅需低至17 μW/μm2 的光强即可实现捕获（图7）11。
图 110 （a）自组装金纳米颗粒的扫描电镜图像。单个金纳米颗粒的直径约为 450 nm。（b）等离激元基底的近场扫描光学显微镜（NSOM）图像，显示颗粒分布较稀疏区域的近场辐射。激发激光波长为 633 nm。（c）（b）图中红色方框区域的高倍放大图像。（d）等离激元基底的散射效率光谱，显示在 624 nm 处出现峰值。（e）等离激元基底的吸收效率光谱，显示在 668 nm 处出现峰值。
图 213 (a) 金纳米球随机分布在 1 × 1 μm2 的二维区域上。每个蓝色点代表一个纳米球的中心（a = 60 nm）。图 (b) - (e) 显示了与随机分布的纳米球阵列平行的观测平面上的散射场分布。该纳米球阵列被波长为 540 nm 的平面波均匀照射。周围介质的折射率为 1.33。平面波的偏振方向沿 X 轴方向（在 (a) 中为水平方向）。计算中假设入射电场的幅度为 1。观测平面与纳米球阵列之间的距离定义为 h。b) h = a。c) h = 2a。d) h = λ。e) h = 2λ。
图 39 定制荧光显微镜构型示意图，包含一个被旁路的激发滤光片和一个被替换的二向色镜分光器。此构型用于同时进行光镊捕获与荧光成像。
图 410 利用等离激元捕获技术，维持捕获所需的最小激光强度随周围流体流速的变化关系。所有光强均在显微镜物镜下方的样品平面上测得。(a) - (f) 分别显示了直径为 7.3、6.3（非球形）、5.0、3.9、2.5 和 1.1 μm 的单个聚苯乙烯微球的测量结果。插图为相应粒子的显微图像。所有图像中的比例尺长度均为 5 μm。
图 510 表面等离激元捕获中，图 4 中过原点拟合直线的斜率随颗粒尺寸的变化关系。误差棒表示线性拟合的标准偏差。如本图所示，图 4 中拟合直线的斜率（光学强度阈值与流速的比值）与颗粒尺寸呈近似线性关系，表明表面等离激元捕获在捕获较小颗粒方面的优势。
图611 (a) 利用一维周期性纳米结构增强光学捕获的示意图。入射光束被周期性纳米结构在远场发生衍射。(b) 在周期为417 nm的铝光栅表面，通过FDTD模拟获得的两种正交偏振光在远场的光强分布。光强分布已归一化至平坦铝表面的光强。(c) 和 (d) 分别为在光栅表面正上方的微粒捕获势能随位置的变化关系，(c) 对应350 nm的聚苯乙烯微球，(d) 对应1 μm的聚苯乙烯微球。白色圆圈表示微粒的尺寸。插图为相同尺寸微粒在平坦铝表面上方的捕获势能，作为对比。数值已针对每种微粒尺寸进行了归一化。所有FDTD模拟图像的视场均为10 × 8 μm2。
图 711 （a）测量不同尺寸的聚苯乙烯微球在入射光偏振方向垂直于光栅刻线时的捕获效率及最低捕获强度。插图显示将一个直径为 3.87 µm 的聚苯乙烯微球沿垂直和平行于光栅刻线方向移动时，捕获效率的不对称性。实线（大不对称性）对应入射光偏振方向垂直于光栅的情况，虚线（小不对称性）对应入射光偏振方向平行于光栅的情况。单位为 pN[mW/μm2]-1。（b）-（d）荧光标记的 590 nm 聚苯乙烯微球的捕获演示。红色圆圈标示激光光斑位置，因激光太暗而无法直接观察。初始时，较高功率下粒子被束缚在光斑内；随着功率降低，粒子的布朗运动克服了捕获力，导致粒子逃逸。（e）-（g）荧光标记的卵巢癌细胞核的捕获演示。使用 20 倍物镜时，实现捕获所需的最低强度为 16 μW/μm2。
图814 帽状金纳米颗粒的制备流程：a）在玻璃盖玻片上蒸镀铬和金的薄层。b）暴露于聚苯乙烯微球悬浮液中，并吸附微球1小时。c）去除未吸附的聚苯乙烯微球并干燥表面。d）在模板微球顶部再蒸镀一层金。e）帽状金纳米颗粒阵列的示意图，其中金仅覆盖模板微球的上表面。
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讨论
这些捕获方法的意义在于，它们将实现持续捕获所需的光强从大约 103 μW/μm2 降低到大约 10 μW/μm2 的水平。10,11 这些技术的局限性在于，金纳米颗粒阵列会经历必须克服的加热问题。为解决这一问题，可采用由介电材料构成的二维光子晶体结构。理论上，这种结构能够在低光强下实现捕获，并通过调控输入偏振态，精确控制微米和纳米颗粒的旋转与位置。图6和图7中的光栅结果已证实了一维情况下的可行性。下一步是构建二维光子晶体，展示光子晶体镊子阵列，从而推动其在众多生物学研究领域的应用。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们还要感谢缪晓宇（Xiaoyu Miao）和本·威尔逊（Ben Wilson）开发了本文所述的大部分方法。本研究由美国国家科学基金会（DBI 0454324）、美国国立卫生研究院（R21 EB005183）以及美国国家普通医学科学研究所通过PHS NRSA T32 GM07270向ECK提供的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| Axio Imager 显微镜 (D1M) | Carl Zeiss, Inc. | D1M | Zeiss Axio Imager.D1M |
| 显微镜物镜 (50x/0.55) | Carl Zeiss, Inc. | LD EC Epiplan - NEOFLUAR 50x/0.55 HD DIC | |
| Zeiss 显微镜相机 (AxioCam MRc) | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 氦氖激光器 (35 mW) | Research Electro-Optics | ||
| 连续可变衰减器 | Thorlabs Inc. | NDC-100C-4M | 用于调节显微镜光强 |
| Zeiss 滤光片组 #17 | Carl Zeiss, Inc. | 488017-9901-000 | 滤光片组 #17 |
| 显微镜载玻片，厚度 0.5 mm | VWR international | ||
| 3T3 小鼠细胞核 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | 尽可能低温保存 | |
| 吖啶橙染料 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | ||
| 牛血清白蛋白，PBS 中 1 至 10 比例 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | ||
| 454 nm 聚苯乙烯乳胶微球 | Polysciences, Inc. | ||
| 盐酸碳二亚胺 (EDC) - 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) | G-Biosciences | BC25-1 | |
| 金（用于沉积） | |||
| 反射式刻线衍射光栅 | Edmund Scientific | ||
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190-144 |
参考文献
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