transgenic Drosophila melanogaster 中 cis-调控元件（CRE）活性的定量比较

摘要

性状的表型变异可能源于顺式调控元件（CRE）序列的突变，这些突变会影响基因表达模式。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中建立的方法可用于定量比较由修饰型或天然存在的CRE变异所介导的基因表达在空间和时间上的表达水平模式。

摘要

基因表达模式由 顺式-调控元件（CRE）序列，也称为增强子或顺式调控模块。典型的CRE包含多个转录因子蛋白的结合位点，这些结合位点构成一种调控逻辑，决定受调控基因在何时、何地以及以何种水平表达。动物基因组中全部CRE的集合编码了该生物体的发育与功能调控程序′发展计划程序¹，且实证研究与理论研究表明，顺式调控元件中的突变在形态进化中发挥了重要作用^2-4此外，人类基因组全关联研究显示，顺式调控元件（CREs）中的遗传变异对表型变异具有显著贡献。^5,6因此，理解调控机制以及突变如何影响这种调控机制是遗传学的核心目标之一。

报告基因转染提供了一种强大的方法来研究 体内 CRE功能的研究。在此方法中，将已知或疑似CRE序列与异源启动子及报告基因的编码序列连接，该报告基因编码一种易于观察的蛋白质产物。当报告转基因插入宿主生物体后，CRE′其活性以编码的报告蛋白形式显现。果蝇物种中的P元件介导转基因技术 黑腹果蝇（Drosophila (D.) melanogaster）⁷ 几十年来，人们一直利用该方法将报告基因转入这种模式生物，但转基因在基因组中的插入位置是随机的。因此，报告基因的活性受到局部染色质状态和基因环境的强烈影响，限制了顺式调控元件（CRE）之间的比较，只能进行定性分析。近年来，基于phiC31的整合系统已被改造并应用于D. 黑腹果蝇 将转基因插入特定的基因组着陆位点^8-10这一能力使得对基因以及此处相关的CRE活性进行定量测量成为可能^11-13 可行。转基因果蝇的制备可外包完成，包括基于phiC31的整合，从而无需购买昂贵的设备和/或掌握专业的转基因显微注射技术。

在此，我们提供一种定量评估CRE的通用方案′活性，并展示如何利用该方法来检测引入的突变对CRE的影响′s 活性，并比较直系同源顺式调控元件（CREs）的活性。尽管文中示例涉及果蝇变态发育期间具有活性的 CRE，但该方法可应用于其他发育阶段、果蝇物种或模式生物。最终，广泛采用此方法研究 CRE 将有助于深入理解基因调控逻辑及其变异与进化机制。

方案

概述：

本视频展示了一种能够定量测量Drosophila (D.) melanogaster中顺式调控元件（CRE）序列基因调控活性的实验方案。该方案可用于比较以下不同情况下的调控活性：野生型与突变型CRE形式、同一物种内自然存在的CRE等位基因，或不同物种间直系同源的CRE。

1. 将报告基因在Drosophila melanogaster基因组中的特定位点进行整合

A. 报告基因转基因构建

1. 第一步，必须将任何待评估的CRE单独克隆到报告载体中，该载体包含：(1) 用于位点特异性转基因整合的attB细菌附着位点序列^8-11；(2) 位于(3)异源启动子上游的多克隆位点；以及紧随其后的(4)荧光蛋白编码序列（如EGFP或DsRed）。
2. 尽管可通过在载体骨架中引入attB序列使任意载体兼容phiC31介导的位点特异性整合，但载体pS3aG12-14可从addgene质粒库获取 (http://www.addgene.org/pgvec1)。pS3aG是P因子介导转化载体15的一种定制版本，其中两个gypsy绝缘子之一被SfIb绝缘子取代，该载体含有增强型多克....

讨论

cis调控元件编码基因组程序，决定基因表达模式，从而控制发育过程¹，同时也是形态进化相关突变^2-4以及人类性状表型变异^5,6,19的重要位点。尽管其重要性已广为人知，但人们对调控元件（CREs）的调控机制仍知之甚少。造成这一认知不足的一个主要原因是缺乏可用于定量比较CRE功能序列的合适方法。本文介绍了一种利用黑腹果蝇（D. melanogaster）转基因技术改进方法的实验方案，从而为CRE研究引入定量分析维度。

根据我们的经验，在定量分析顺式调控元件（CRE）的调控活性时，若重复样本满足以下两个条件：（1）处于相同的发育阶段，且（2）报告转基因位于相同的基因组整合位点，则重复样本间的变异幅度不超过校正后平均像素值的10%。该变异水平与图3中所示CRE所确定的结果一致，这也意味着该定量方法仅适用于那些在调控活性上差异超过10%的不同遗传版本CRE的比较。然而需要强调的是，相较于以往研究者在描述CRE活性变化时只能使用“降低”或“增强”等定性描述，这一局限性已代表了显著的进步。