方法文章

细胞脂质提取用于靶向稳定同位素稀释液相色谱-质谱分析

DOI：

10.3791/3399

⸱

2011年11月17日

 ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania , 2Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案将演示从细胞中提取和分析游离及酯化生物活性脂肪酸的方法。采用稳定同位素稀释法、手性液相色谱-电子捕获大气压化学电离多反应监测质谱法（SID-LC-ECAPCI-MRM/MS）对脂肪酸进行准确定量。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂肪酸（如花生四烯酸（AA）和亚油酸（LA））的代谢会生成氧化型生物活性脂质，包括多种立体异构体1,2。这些代谢物可由游离或酯化形式的脂肪酸生成。许多此类氧化代谢物具有生物活性，并已被证实与多种疾病相关，包括心血管疾病、神经退行性疾病、哮喘和癌症3-7。氧化型生物活性脂质可通过酶促反应或活性氧（ROS）作用生成。参与脂肪酸代谢的酶包括环氧化酶（COX）、脂氧合酶（LO）和细胞色素P450（CYPs）1,8。酶促代谢导致对映体选择性产物的生成，而ROS氧化则生成外消旋混合物。

尽管本方案主要侧重于分析花生四烯酸（AA）和部分亚油酸（LA）衍生的生物活性代谢物，但也可轻松应用于其他脂肪酸的代谢物分析。生物活性脂质通过液-液（l-l）萃取法从细胞裂解液或培养基中提取。在液-液萃取过程开始时，加入稳定同位素内标，以校正样品制备过程中可能产生的误差。稳定同位素稀释法（SID）还可校正代谢物在质谱（MS）分析过程中可能遇到的各类差异，例如离子抑制效应9。萃取后，采用电子捕获（EC）试剂五氟苄基溴（PFB）进行衍生化，以提高检测灵敏度10,11。使用多反应监测（MRM）模式以增强质谱分析的选择性。在质谱分析前，采用手性正相高效液相色谱法（HPLC）对脂质进行分离。HPLC条件经过优化，可有效分离目标脂质的对映异构体及各种立体异构体12。该特定的LC-MS方法可监测前列腺素（PGs）、异前列腺素（isoPs）、羟基二十碳四烯酸（HETEs）、羟基十八碳二烯酸（HODEs）、氧代二十碳四烯酸（oxoETEs）和氧代十八碳二烯酸（oxoODEs）；然而，HPLC和MS参数可进一步优化，以涵盖其他脂肪酸代谢物13。

目前大多数可用的生物分析方法均未考虑对对映异构体进行分别定量。在判断代谢物是由酶催化产生还是由活性氧（ROS）产生时，这一点极为重要。此外，对映异构体的比例可能为特定的酶促生成途径提供证据。采用稳定同位素稀释法（SID）可实现对代谢物的准确定量，并能校正样品制备过程中的损失以及电离过程中存在的差异。使用五氟苄基溴（PFB）作为电子捕获试剂，可使检测灵敏度比传统的常压化学电离（APCI）方法提高两个数量级。总体而言，该方法即稳定同位素稀释-液相色谱-电子捕获-常压化学电离多反应监测质谱法（SID-LC-EC-APCI-MRM/MS），是目前针对生物活性脂质定量分析中最灵敏、选择性最强且最准确的方法之一。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 标准品与内标混合物

  1. 在脂质提取之前，必须配制标准品混合液（SM）和内标混合液（ISM）。对于SM，使用校准过的注射器，将试剂表中所列的每种标准品（共25种）各取相当于1 μg的体积，加入10 mL容量瓶中。在氮气下将标准品干燥，并用10 mL乙腈（ACN）重新溶解。标准品混合液的最终浓度为100 pg/μL。分装为每份1 mL，于-80°C保存，直至使用。
  2. 从该标准品混合液中可进一步稀释配制6个浓度的标准溶液，共得到7个校准标准品（1 pg/μL、2 pg/μL、5 pg/μL、10 pg/μL、20 pg/μL、50 pg/μL和100 pg/μL）。每次样品制备批次均需同时分析这些标准品，以建立定量分析所用的校准曲线。
  3. 对于ISM，使用校准过的注射器，将试剂表中所列的每种内标物（共14种）各取相当于1 μg的体积，加入10 mL容量瓶中，并在氮气下吹干。用10 mL ACN重新溶解ISM，分装为每份1 mL。ISM的最终浓度应为100 pg/μL。所配制的ISM足以处理1000个样品。
  4. 将SM和ISM于-80°C保存。

2. 培养基和细胞裂解液的收集

  1. 对于每个贴壁细胞的10 cm培养皿（约1 × 107个细胞），在10 mL玻璃离心管中收集3 mL培养基。随后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次。向培养皿中加入1 mL PBS，用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下，并用移液器转移至第二个10 mL玻璃离心管中。若此时不继续后续操作，可将细胞和培养基样品保存。长期保存请置于-80°C，若保存时间少于一周，可置于-20°C。

3. 从培养基中提取脂质

  1. 游离的生物活性脂质存在于细胞培养基中，可通过一步液-液萃取法轻松提取。向收集的培养基（2.1）中加入 10 μL 内标混合物（ISM）。此时，另取 8 个 10 mL 玻璃离心管，标记为 #0–7，用于配制校准标准品。向每个管中加入 3 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），然后向编号 1–7 的管中分别加入 10 μL 对应的标准品混合物（SM）（1.1 中的 1–7）。
  2. 让内标混合物（ISM）在各校准标准品和样品中平衡 10 分钟，然后加入 5 mL 乙醚。将样品和校准标准品置于摇床中，在室温下低速振荡 30 分钟。
  3. 振荡结束后，将所有校准标准品和样品在 1935 × g 离心 10 分钟。随后，使用巴斯德吸管将上层有机相转移至新的 10 mL 玻璃离心管中，并在氮气下吹干。

4. 从细胞裂解液中提取脂质

  1. 将玻璃离心管中的细胞样品在1935 × g下离心5分钟。弃去上清液；向每根管中加入2 mL PBS，短暂涡旋混匀。取25 μL样品用于蛋白质定量。总蛋白含量将用于细胞裂解液的归一化处理。
  2. 接下来，将一半的裂解液/PBS混合物转移至另一个10 mL玻璃离心管中。向每个样品中额外加入2 mL PBS和10 μL内标物（ISM）。按照第3.2和3.3节中所述的液-液（l-l）萃取方法处理。此份样品用于测定细胞内的游离脂质，并避免脂质（如前列腺素）发生碱性降解。该份样品不进行下文所述的步骤4.3和4.4。
  3. 酯化脂质的液-液萃取过程的第一步是向每个样品中加入5 mL CHCl3/MeOH（2:1）。将样品置于摇床上低速振荡30分钟。振荡结束后，在1935 × g下离心10分钟。随后，使用巴斯德吸管将液-液萃取的下层（有机层）转移至新的10 mL玻璃离心管中，并在氮气流下吹干样品。
  4. 酯化脂质在定量前必须进行皂化处理。样品完全干燥后，向每根管中加入0.5 mL含0.4N KOH的80% MeOH溶液。将样品在60°C下孵育1小时。孵育结束后，加入2 mL PBS，用浓盐酸（约30 μL）调节pH至6。向每个样品中加入10 μL内标物（ISM）。后续步骤与培养基中的脂质提取相同，可参照第3.2和3.3节进行。
  5. 若这些提取样品与培养基样品同时检测，则可使用相同的校准标准品绘制校准曲线；然而，若这些样品在其他时间检测，则必须按照第3.1–3.3节所述方法同时处理校准标准品。

5. 五氟苄基溴（PFB）衍生化

  1. 向干燥后的样品和校准标准品中加入 100 μL 无水二氯甲烷（CH2Cl2），随后加入 100 μL 20%（v/v）的无水 CH2Cl2 溶液中的 N,N-二异丙基乙胺，最后加入 100 μL 20%（v/v）的无水 CH2Cl2 溶液中的 PFB。
  2. 加入衍生化试剂后，将样品涡旋混匀，在 60°C 下孵育 1 小时，并在氮气下干燥。若样品和校准标准品不能立即分析，可保存于 -80°C；或在 -20°C 下保存不超过一周。

6. 稳定同位素稀释手性液相色谱-电子捕获-大气压化学电离质谱法（SID-LC-ECAPCI-MS）分析

  1. 将干燥的样品和校准标准品用 100 μL 正己烷/乙醇（97:3）重新溶解。随后可将全部样品转移至带有内插管的 HPLC 小瓶中。将样品置于冷藏自动进样器（4°C）中，并创建样品分析列表。
  2. 接下来，使用下文表 1和表 2中所述参数设置 HPLC 和 MS 方法。表 3包含特定化合物信息，包括每种脂质的多反应监测（MRM）转换和碰撞能量（CE），以及 Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra 分析估算的保留时间。碰撞能量（CE）是在方法开发过程中通过对每种脂质单独优化确定的。
  3. 采用 Chiralpak AD-H 色谱柱（4.6 X 250 mm，5 μm），加热至 30°C，用于正相分离。初始流动相为 98% 正己烷和 2% 甲醇/异丙醇（1:1）。HPLC 分离后，柱后添加甲醇（0.75 mL/min），以避免在 Corona 放电针上沉积而降低灵敏度。质谱仪采用负离子模式，使用 APCI 离子源。若需将离子源从 ESI 更换为 APCI，务必插入 Corona 放电针。
  4. 首先应运行一次正己烷空白样品。该步骤可平衡色谱柱，并检测色谱柱是否存在可能干扰校准标准品和样品分析的污染。
  5. 接下来按浓度递增顺序（0–7，SM 浓度递增）依次运行校准标准品样品。这些标准品将用于建立校准曲线，其中 y 轴为标准品峰面积/内标（IS）峰面积的比值，x 轴为标准品浓度或质量。根据该曲线拟合所得的 y = mx + b 方程，可利用样品峰面积/内标峰面积的比值（y）计算样品中待测物的含量或浓度（x）。
  6. 培养基中检测到的生物活性脂质含量可归一化为培养基总体积，细胞裂解液中检测到的脂质含量可归一化为每孔总细胞数或每孔总蛋白量。在实验方案第 4.1 步中应采取相应措施，确保完成细胞计数或蛋白定量。

7. 代表性结果：

色谱图中的 图1 代表一个靶向脂质组学谱。第一组（图1A) 显示了由亚油酸衍生的13-和9-HODE及其相应的13-和9-oxoODE。此外，第二组还显示了15-HETE的氧化代谢物15-oxoETE。底部两组显示了20-HETE和20-HETE-IS，[2H6]-20-羟二十碳四烯酸 图1B 显示了由花生四烯酸（AA）经酶促氧化或活性氧（ROS）氧化生成的HETE立体异构体的分离情况及确定的特征性裂解反应。 图1C 是前列腺素（PGs）、异前列烷（isoPs）和白三烯B（LTB）的示意图4某些标准品没有 commercially available 的氘代内标，因此使用保留时间相似的内标进行定量。例如，[2H8]-12(S)-HETE 用于定量 11-HETE 和 8-HETE 物种，以及 12(R)-HETE 和 12(S)-HETE

从代表性色谱图可以看出，与未标记的标准品相比，氘代内标物的保留时间发生了微小偏移。这种向更晚保留时间的偏移是氘与正相色谱柱相互作用的结果。氘比氢更具极性，因此与色谱柱的正相发生更强的相互作用。如果该分离过程采用反相色谱柱进行，则偏移将表现为更早的保留时间，因为极性更强的基团与反相的相互作用较弱。

用于脂质氧化产物分析的高效液相色谱图。
图1. 本图是靶向脂质组学分析的代表性示例。图1A 显示了多个亚油酸（LA）和花生四烯酸（AA）氧化代谢物的总离子色谱图（TIC），其中第一面板为13-oxoODE和9-oxoODE，第二面板为15-oxoETE，第三和第五面板为13-HODE和9-HODE，第七面板为20-HETE。HODEs和20-HETE在下方面板（4、6和8）中均有相应的氘代内标。 图2B 中的TIC展示了来自AA的HETE立体异构体的分离情况及其独特的质谱跃迁。 图2C 展示了前列腺素（PGs）、异前列腺素（isoPs）和白三烯（LTs）的分析结果。每种化合物的碰撞能量（CE）、多反应监测跃迁（MRM transitions）和保留时间（RT，min）均使用Waters 2695液相色谱系统与Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra质谱仪联用进行优化，并列于表3中。

时间（分钟）% A% B
0982
3982
1196.43.6
15928
27928
305050
385050
39982
45982

表1. 手性正相脂质组学分离的高效液相色谱梯度条件。溶剂A为100%正己烷，溶剂B为甲醇/异丙醇（1:1）。

质谱参数设置
离子源APCI
模式负离子模式
方法时长40 min
MRM 扫描宽度0.002 m/z
MRM 扫描时间0.15 sec
MRM 峰宽0.70 FWHM
管透镜电压164 V
源内 CID10 eV
Q2 碰撞气1.5 units
汽化器温度450°C
毛细管温度250°C
放电电流0 μA
鞘气压力25 units
离子清扫气压力3 units
辅助气压力5 units

表2. 上列为此生物活性脂质检测所优化的质谱参数。这些参数源自赛默飞世尔TSQ Quantum Ultra。

化合物跃迁碰撞能量 (eV)保留时间 (min)
13-oxoODE293.03 → 113.10219.9
9-oxoODE293.03 → 113.102117.9
15-oxoETE317.05 → 113.18188.1
13(R)-HODE295.03 → 195.121812.5
13(S)-HODE295.03 → 195.121814.8
[2H4]-13(S)-HODE299.03 → 198.121814.9
9(R)-HODE295.03 → 171.101813.7
9(S)-HODE295.03 → 171.101821.2
[2H4]-9(S)-HODE299.03 → 172.121821.2
20-HETE319.03 → 289.101812.4
[2H6]-20-HETE325.03 → 295.101812.4
5(R)-HETE319.04 → 115.041615.7
5(S)-HETE319.04 → 115.041616.2
[2H8]-5(S)-HETE327.04 → 116.041616.4
12(R)-HETE319.04 → 179.111411.7
12(S)-HETE319.04 → 179.111412.3
[2H8]-12(S)-HETE327.13 → 184.111412.5
15(R)-HETE319.04 → 219.121312.4
15(S)-HETE319.04 → 219.121315.9
[2H8]-15(S)-HETE327.03 → 226.121316.1
11(R)-HETE319.04 → 167.111611.1
11(S)-HETE319.04 → 167.111612.5
8(R)-HETE319.04 → 155.091611.7
8(S)-HETE319.04 → 155.091612.6
LTB4335.03 → 195.101832.0
[2H4]-LTB4339.03 → 197.101832.0
PGE2351.03 → 271.151831.2
[2H4]-PGE2355.03 → 275.151831.2
PGD2351.03 → 271.152532.5
[2H4]-PGD2355.03 → 275.152532.5
8-iso-PGE2351.03 → 271.151837.4
11β-PGF2353.03 → 193.112527.6
[2H4]-11β-PGF2357.03 → 197.112527.6
PGF2α353.03 → 193.112533.1
[2H4]-PGF2α357.03 → 197.112533.1
8-iso-PGF2α353.03 → 193.112534.4
[2H4]-8-iso-PGF2α357.03 → 197.112534.4

表3. 本表列出了在图1A-C的总离子色谱图中检测到的化合物。第二列为MRM/MS所用的离子跃迁，第三列列出了碰撞能量（CE，eV），最后一列列出了保留时间（RT，min）。参数优化使用Waters 2695分离模块与Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra联用完成。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案中使用的一系列标准品和内标品代表了一种靶向脂质组学方法。液相色谱-质谱分析采用 Waters 2695 分离模块和 Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra 质谱仪，其最佳参数设置见表1和表2。此外，本提取方案最初针对贴壁细胞设计，但也可修改后适用于其他细胞类型以及尿液、血液和组织等其他生物基质。许多脂质标准品均可商业获取，并可纳入本分析流程。在衍生化步骤中，必须使用无水溶剂以及最高纯度的N,N-二异丙基乙胺。对于液相色谱-质谱分析，同样必须使用最高纯度的溶剂，这些溶剂已在试剂列表中列出。柱后添加甲醇也至关重要，可防止科罗纳放电针上沉积物积聚，否则将显著降低方法的检测灵敏度。

加入校准标准品不仅能够实现准确的定量，还使研究人员能够排查提取或液相色谱-质谱（LC-MS）流程中的问题。在某些情况下，某个色谱峰可能难以定量。此时应将样品色谱图与校准标准品色谱图进行比较。通常发现，校准标准品色谱图中并不包含该干扰峰。这表明存在一种干扰化合物，它来源于细胞培养基或裂解液，并在色...

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

目前大多数可用于测定生物活性脂质的生物分析方法尚不够全面，因其未包含手性正相色谱或稳定同位素稀释技术（SID）。手性正相液相色谱对于分离对映异构体以及区分酶促反应与活性氧（ROS）介导的代谢过程至关重要。使用稳定同位素稀释法可确保在定量过程中充分考虑样品提取或分析过程中可能出现的人为误差或技术问题。结合电子捕获大气压化学电离多反应监测（EC-APCI-MRM）技术，这些附加组分使本方法成为当前可用于生物活性脂质分析的最灵敏、最选择性最强的分析方法。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-氧代-6E,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯-6,8,9,11,12,14,15-d7 酸Cayman Chemical334250[2H7]-5-氧–TE 内标
5S-羟基-6E,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 酸Cayman Chemical334230[2H8]-5(S)-HETE 内标
12S-羟基-5Z,8Z,10E,14Z-二十碳四烯-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 酸Cayman Chemical334570[2H8]-12(S)-HETE 内标
15S-羟基-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 酸Cayman Chemical334720[2H8]-15(S)-HETE 内标
20-羟基-5Z,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯-16,16,17,17,18,18-d6 酸Cayman Chemical390030[2H6]-20-HETE 内标
9S-羟基-10E,12Z-十八碳二烯-9,10,12,13-d4 酸Cayman Chemical338410[2H4]-9(S)-HODE 内标
13S-羟基-9Z,11E-十八碳二烯-9,10,12,13-d4 酸Cayman Chemical338610[2H4]-13(S)-HODE 内标
9α,11α,15S-三羟基-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4Cayman Chemical316010[2H4]-PGF2α 内标
9α,11α,15S-三羟基-(8β)-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸-3,3,4,4-d4Cayman Chemical316350[2H4]-8-iso-PGF2a 内标
9α,11β.,15S-三羟基-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸-3,3,4,4-d4Cayman Chemical10008989[2H4]-11β-PGF2 内标
9α,15S-二羟基-11-氧代-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4Cayman Chemical312010[2H4]-PGD2 内标
9-氧代-11α,15S-二羟基-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4Cayman Chemical314010[2H4]-PGE2 内标
5S,12R-二羟基-6Z,8E,10E,14Z-二十碳四烯-6,7,14,15-d4 酸Cayman Chemical320110[2H4]-LTB4 内标
9α,11,15S-三羟基-血栓烷-5Z,13E-二烯-1-酸-3,3,4,4-d4Cayman Chemical319030[2H4]-TxB2 内标
5-氧代-6E,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯酸Cayman Chemical342505-氧–TE 标准品
12-氧代-5Z,8Z,10E,14Z-二十碳四烯酸Cayman Chemical3458012-氧–TE 标准品
15-氧代-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯酸Cayman Chemical3473015-氧–TE 标准品
5R-羟基-6E,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯酸Cayman Chemical342255(R)-HETE 标准品
5S-羟基-6E,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯酸Cayman Chemical342305(S)-HETE 标准品
8R-羟基-5Z,9E,11Z,14Z-二十碳四烯酸Cayman Chemical343508(R)-HETE 标准品
8S-羟基-5Z,9E,11Z,14Z-二十碳四烯酸Cayman Chemical343608(S)-HETE 标准品
11R-羟基-5Z,8Z,12E,14Z-二十碳四烯酸Cayman Chemical3450511(R)-HETE 标准品
11S-羟基-5Z,8Z,12E,14Z-二十碳四烯酸Cayman Chemical3451011(S)-HETE 标准品
12R-羟基-5Z,8Z,10E,14Z-二十碳四烯酸Cayman Chemical3456012(R)-HETE 标准品
12S-羟基-5Z,8Z,10E,14Z-二十碳四烯酸Cayman Chemical3457012(S)-HETE 标准品
15R-羟基-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯酸Cayman Chemical3471015(R)-HETE 标准品
15S-羟基-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯酸Cayman Chemical3472015(S)-HETE 标准品
20-羟基-5Z,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯酸Cayman Chemical9003020-HETE 标准品
9R-羟基-10E,12Z-十八碳二烯酸Cayman Chemical384059(R)-HODE 标准品
9S-羟基-10E,12Z-十八碳二烯酸Cayman Chemical384109(S)-HODE 标准品
13R-羟基-9Z,11E-十八碳二烯酸Cayman Chemical3860513(R)-HODE 标准品
13S-羟基-9Z,11E-十八碳二烯酸Cayman Chemical3861013(S)-HODE 标准品
9α,11α,15S-三羟基-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸Cayman Chemical16010PGF2α 标准品
9α,11α,15S-三羟基-(8β)-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸Cayman Chemical163508-iso-PGF2α 标准品
9α,11β,15S-三羟基-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸Cayman Chemical1652011β-PGF2 标准品
9α,15S-二羟基-11-氧代-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸Cayman Chemical12010PGD2 标准品
9-氧代-11α,15S-二羟基-(8β)-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸Cayman Chemical143508-iso-PGE2 标准品
9-氧代-11α,15S-二羟基-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸Cayman Chemical14010PGE2 标准品
5S,12R-二羟基-6Z,8E,10E,14Z-二十碳四烯酸Cayman Chemical20110LTB4 标准品
9α,11,15S-三羟基血栓烷-5Z,13E-二烯-1-酸Cayman Chemical19030TxB2 标准品
磷酸盐缓冲液GIBCO, by Life Technologies14190
乙醚Sigma-Aldrich346136
二氯甲烷Acros Organics61030-1000无水
N,N-二异丙基乙胺Sigma-Aldrich387649
五氟苄基溴Sigma-Aldrich101052
盐酸Sigma-Aldrich320331
氢氧化钾Fluka00650
乙腈Fisher ScientificA996-4
甲醇Fisher ScientificA454-4
氯仿Fisher Scientific366927
正己烷Fisher ScientificH303-4
异丙醇Fisher ScientificA464-4
乙醇Decon Laboratories2716
水Fisher ScientificW7-4
巴斯德移液管Fisher Scientific13-678-200
10 mL 玻璃离心管Kimble Chase73785-10螺口盖
酚类螺口盖Kimble Chase73802-13415
Chiralcel ADH 色谱柱Chiral Technologies19325
HPLC 小瓶Waters60000751CV
HPLC 插管WatersWAT094171

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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