一种用于检测和清除主流香烟烟雾中气相自由基的实验方案

摘要

采用自旋捕获电子自旋共振（ESR）波谱法研究植物抗氧化剂番茄红素、碧萝芷和葡萄籽提取物对香烟烟雾气相自由基的清除作用。

摘要

吸烟与人类癌症相关。据报道，大多数肺癌死亡病例由吸烟引起^5,6,7,12。尽管香烟烟雾颗粒相中的焦油及相关产物是致癌和致突变相关疾病的主要原因，但香游戏副本中还含有大量自由基，也被认为是一类重要的致癌物^9,10。自由基通过破坏蛋白质结构、脂质和DNA序列，攻击细胞组分，从而增加患多种癌症的风险。吸入的自由基在肺部形成加合物，导致烟草烟雾的多种负面健康效应³。已有研究致力于降低香烟烟雾中的自由基，以减少吸烟所致损害的风险。据报道，血红蛋白及含血红素的化合物可部分清除香烟烟雾中的一氧化氮、活性氧化物和致癌性挥发性亚硝基化合物⁴。一种由血红蛋白和活性炭组成的“生物过滤器”被用于清除自由基，可去除香烟烟雾中高达90%的自由基¹⁴。然而，由于成本效益不佳，尚未成功实现商业化。另一项研究显示，中药成分紫草素具有良好的自由基清除效率⁸。在本研究中，我们报告了一种将常见天然抗氧化提取物引入香烟滤嘴以清除香烟烟雾气相自由基的实验方案，并采用自旋捕获电子顺磁共振（ESR）波谱法测定其对主流香烟烟雾（MCS）中气相自由基的清除效果^1,2,14。我们发现番茄红素和葡萄籽提取物具有高效的自由基清除能力，提示其未来可应用于香烟滤嘴。这些潜在清除剂的一个重要优势在于，它们可分别从番茄或葡萄酒工业的副产物中大量获取^11,13

方案

1. 材料

本研究所用的所有溶剂均为试剂级。自旋捕获剂包括N-叔丁基-α-苯基亚硝基腈（PBN）和标准自旋标记物2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧自由基（TEMPO），购自Sigma公司，直接使用未作进一步纯化。植物抗氧化剂购自美国斯旺森公司（Swanson, Inc.）。

2. 香烟烟雾的制备及自由基分析

1. 为了将抗氧化剂引入滤材，首先将抗氧化剂碧萝芷（pycnogenol）和葡萄籽提取物溶解于95%乙醇中，而番茄红素则溶解于丙酮中。溶剂体积根据抗氧化剂的溶解度而有所不同。
2. 每支滤材使用0.4 mg的抗氧化剂，并随后包覆10 mg活性炭。为此，将活性炭在无氧条件下与抗氧化剂溶液搅拌约12小时，过滤后在真空下干燥。
3. 然后将抗氧化剂引入常规醋酸纤维滤嘴（CA滤嘴）。具体操作是将滤嘴切成两段，将包覆有植物抗氧化剂的材料置于两段滤嘴之间，并用胶带包裹，形成“滤嘴-抗氧化剂-滤嘴”三明治结构（图1A）。该复合滤嘴随后连接至含烟草的烟支上。对照组滤嘴以相同方式制备，但不添加抗氧化剂。
4. 在进行吸烟模拟前，实验用香烟需拆封并置于恒定湿度环境（20 °C，60%相对湿度）中，使用饱和溴化钠（NaBr）溶液平衡至少2天。
5. 常规分析的吸烟模拟在室温下进行，使用单通道吸烟装置，如图1所示，该装置由一个水流抽吸器或GAST DOA-P104-BN真空泵/空气压缩机（Benton Harbor, Mich）通过T型接头连接至自旋捕获装置，T型接头一端开放。抽吸时封闭开放端，两次抽吸之间保持开放。通过流量计检测气体流速，并调节泵与排气口之间的阀门，使流速稳定在约2.2 SCFH（即17.5 mL/s）。
6. 实验香烟在每次抽吸35 mL、持续2秒、每60秒重复一次的条件下进行抽吸，方法类似文献¹。用于定量测定气相自由基的吸烟模拟与自旋捕获系统联用，如图1所示。
7. 每支香烟抽取10次强力抽吸（每次35 mL）。气相自由基通过主流烟气（MCS）先经过剑桥滤片，再导入自旋捕获溶液（苯中0.05 M PBN，2.0 mL）中进行收集。
8. 最后一次抽吸后，将起泡后的捕获溶液用相同苯溶剂补足至初始体积（2.0 mL）。取部分溶液转移至一支长约250 mm、内径3 mm、一端密封的玻璃管中。
9. 采用冷冻-抽气-解冻法对捕获溶液进行除氧处理：先在液氮中冷冻，施加真空；然后在氩气氛围下解冻，使溶解的气体气泡逸出，再重新冷冻。此循环重复三次后，在真空条件下火焰密封玻璃管，用于后续电子顺磁共振（ESR）测量。此步骤是必要的，因为氧气在苯中溶解度较高，会加宽有机自由基的ESR谱线。除氧可显著提高信噪比。
10. X波段ESR谱图在Bruker EMX波谱仪上记录，频率为9.34 GHz，标准条件下测定。大多数实验采用的仪器参数为：中心磁场3312.5 G，扫描宽度80 G，调制幅度0.5 G，时间常数82微秒，扫描时间40秒。
11. 自旋捕获加合物在实验条件下相对稳定，某些情况下需累积25次扫描，通常耗时约20分钟。然而，12小时后，苯溶液中ESR信号强度会下降约5倍。
12. 为定量测定捕获加合物的浓度，对其初始的一阶导数ESR谱图进行积分。所得吸收谱图显示一个宽幅单峰背景，很可能来源于烟气中的烟灰/焦油成分。
    
    扣除该背景后，对分离出的捕获加合物三重峰再次进行积分（图2）。

3. 代表性结果

燃烧香烟产生的烟雾（气相）中的大多数自由基是瞬时且不稳定的。为了观测这些自由基，需采用自旋捕获技术。该技术通过将气相自由基转化为更稳定的自旋加合物，从而利用电子自旋共振（ESR）进行检测（图1）。在本研究中，使用了0.05 M的PBN自旋捕获溶液来收集烟雾气相中的自由基，这些自由基为氧中心和碳中心自由基的混合物，难以分离¹⁵。然而，在本实验中观察到的超精细分裂常数a_N = 13.7 G和a_H = 1.95 G，与烷氧自由基（RO·）捕获加合物的相应数值非常接近²，表明其为主要产物。我们发现，初始测量中观察到的微弱ESR信号和低重复性（图2）是由于烟流中的水分所致。为解决此问题，我们在剑桥滤片与自旋捕获溶液之间添加了一个液氮（LN₂）捕集装置。该液氮捕集装置通过快速冷冻并将水分凝结在玻璃管内壁的方式，有效去除主流烟气（MCS）中的水蒸气。这一改进显著增强了ESR信号，并实现了高度可重复的实验结果（图3）。

使用参考样品测定被捕获的自由基量。对于不含抗氧化剂的对照样品，通过将其双重积分谱图与已知浓度的TEMPO双重积分谱图进行比较，估算出苯中加合物的典型浓度为1.24 μM（图2）。由于每支香烟在抽吸过程中通过的空气量约为350 ml，由此估算主流烟气（MCS）气相中自由基浓度约为7.1×10^-9M，整支香烟气相中被捕获的自由基总数约为1.5×10¹⁵。对整支香烟烟雾中自由基总量（包括气相和颗粒相）的估算值约为10¹⁶个自由基⁹。

观察到植物抗氧化剂对主流烟气中气相自由基的清除效果存在不同水平。其清除率如图4所示。番茄红素和葡萄籽提取物表现出最高的清除率，而碧萝芷（pycnogenol）的清除率较低（图4）。

图1．利用自旋捕获剂收集主流香烟烟雾（MCS）中气相自由基的改进型吸烟模拟装置示意图。MCS通过水流抽吸泵依次经过醋酸纤维滤膜、剑桥滤膜（黄色滤膜），再通过液氮捕集阱以去除H₂O。气相产物最终进入自旋捕获装置，并在自旋捕获剂溶液中鼓泡。植物抗氧化剂置于两片常规醋酸纤维滤膜之间（圆圈A处放大图），并连接在香烟末端，用于清除MCS中的自由基。

图2. 要定量估算苯中自旋捕获加合物的浓度，需从第一积分谱中扣除一个宽的背景信号。自旋捕获加合物的超精细分裂参数为 a_H = 1.95 G，a_N = 13.7 G。

图3. 经过液氮陷阱可显著提高通过自旋捕获MCS所获得的电子自旋共振（ESR）信号的质量。

图4．天然抗氧化剂对MCS中自由基浓度的影响。相对信号强度分别为：对照组 - 100%，碧萝芷（pycnogenol） - 55%，葡萄籽提取物 - 12%，番茄红素 - 10%。

讨论

要可靠地评估不同自由基清除剂在烟草烟雾中的作用，需要一种可重复的自由基定量检测技术。先前的研究¹表明，在非极性溶剂中使用较高浓度的小体积自旋捕获剂溶液，对捕获烟草烟雾中的自由基最为有效。香烟烟雾中始终含有有机物燃烧产生的水蒸气以及烟草中残留的水分，这些水分可能进入捕获溶剂中。水与PBN自旋捕获剂溶液的混合会显著缩短自旋捕获加合物的寿命，并降低其电子自旋共振（ESR）信号的强度。在我们的实验中，通过将主流烟雾（MCS）简单地经过液氮冷却的U形管以去除水分，显著改善了ESR谱图的质量，尽管部分气相自由基也可能被冻结在表面而被捕获。

利用该技术，我们比较了将不同天然自由基清除化合物引入卷烟滤嘴后的相对效率。研究发现，番茄红素和葡萄籽提取物在刚加入卷烟滤嘴后，能够清除气相主流烟气（MSC）中高达90%的自由基。如此高的清除能力使这些廉价且易得的天然化合物与血红蛋白和紫草素等已报道的最高效自由基保护剂^8,14处于同等地位。然而，在我们的实验中，负载了上述天然抗氧化剂的卷烟滤嘴在室温下储存一周后，其清除能力明显下降。解决这一问题有望推动番茄红素和葡萄籽提取物在未来商业卷烟滤嘴中的应用。