检测蛙类精子趋化性的两种测定方法

摘要

卵子及其周围的胞外包被常会释放多肽、蛋白质和小分子，这些物质可与精子进行通讯，引导精子趋向卵子，从而促进受精。本文利用蛙类精子，描述并比较了两类用于检测精子趋化性吸引的实验方法——精子聚集实验和精子追踪实验。

摘要

在无脊椎动物中，精子的化学趋向性可能足够显著，以至于可以将含有趋化肽的移液管插入精子悬液中，通过显微镜直接观察到精子在移液管周围的聚集现象¹。而在脊椎动物（如青蛙、啮齿类动物和人类）中，精子化学趋向性的检测更为困难，需要采用定量分析方法。这类分析方法主要分为两类：一类是量化精子向趋化因子源移动情况的实验，即所谓的精子聚集实验；另一类则是实际追踪单个精子游动轨迹的实验。

精子聚集实验相对快速，可在一天内完成数十甚至数百次实验，从而能够较快地开展剂量反应曲线和时间过程的研究。这类实验已被广泛用于表征许多已建立的化学趋化系统——例如，中性粒细胞对细菌肽类的趋化作用以及精子对卵泡液的趋化作用。精子追踪实验则更为耗时，但能提供化学趋化物如何实际改变精子游动路径的额外数据。此类实验对于证明精子运动方向相对于化学趋化梯度轴的定向性，以及观察使精子更接近卵子的特征性转向或方向变化至关重要。

本文描述了上述两种类型实验所使用的方法。其中精子趋化聚集实验采用的是“双室”实验法。将两栖动物的精子置于带有聚碳酸酯滤膜底部的组织培养板小室中，滤膜孔径为12 μm。将含有精子的小室插入含有缓冲液的组织培养板孔中，并用移液器将趋化因子小心加入底部孔中，使其位于滤膜底部与孔壁交界处（见图1）。孵育一段时间后，小心移除上层含有精子储存液的小室，收集穿过滤膜进入下室的精子，经离心形成沉淀后，使用血细胞计数板或流式细胞仪进行计数。

精子追踪实验采用Zigmond小室，该装置最初用于观察中性粒细胞趋化性，后由Giojalas及其同事加以改进，用于精子观察^2,3。该小室由一块厚玻璃载片制成，其上加工出两条垂直的槽，中间由一条宽1 mm的观察平台隔开。盖上盖玻片后，将精子加入其中一条槽，化学趋化剂加入另一条槽，通过视频显微镜观察单个精子的运动。随后利用软件分析视频影像，获取精子在x-y平面内随时间变化的二维细胞运动轨迹（即xyt数据集），从而形成每条精子的运动轨迹。

方案

1. 使用的材料和缓冲液

1. 卵母细胞林格液′s 缓冲液（1.5 × OR2）含有 124 mM NaCl、3.75 mM KCl、1.5 mM CaCl₂₂，1.5 mM MgCl₂，1.5 mM Na₂HPO₄，10 mM Hepes， pH 7.8。受精缓冲液（F-1）含有 41.25 mM NaCl、1.25 mM KCl、0.25 mM CaCl₂₂，0.06 mM MgCl₂，0.5 mM Na₂HPO₄，2.5 mM Hepes，pH 7.8。
2. Xenopus laevis 根据Sugiyama等人的方法制备卵水。⁴简要描述如下：将 freshly spawned 的带胶质青蛙卵在少量 F-1 缓冲液中轻轻旋转孵育 30 分钟，随后用微量移液器移除孵育后的上清液。该上清液称为“卵水”，也可用于制备纯化的 allurin，即该胶质提取物中的主要趋化因子。精子来源于商业养殖的 非洲爪蟾 或 Xenopus tropicalis.
3. 参见材料表以获取实验所需的特定物品。

2. 一种用于蛙类精子趋化性的双室检测法

1. 将青蛙浸入含有0.07%苯佐卡因的水中进行麻醉，使用碳化硅刃剪刀断头，并进行二次穿刺以确保安乐死。剪除腹部皮肤以暴露肌肉，沿中线及两侧切开腹肌并牵开。轻柔地将肠管和脂肪组织牵开，以显露白色、豆状的睾丸。使用精细剪刀修剪掉结缔组织，注意避免损伤血管。取出一个睾丸，用1.5 × OR2缓冲液洗去血液，然后在滤纸上轻轻滚动睾丸以去除多余缓冲液及附着的小血管，随后将睾丸置于盛有0.2 ml 1.5 × OR2缓冲液的塑料培养皿中。用5 ml注射器吸取2 ml 1.5 × OR2缓冲液，轻轻在睾丸表面一端刺10–20个小孔，从另一端插入针头并缓慢注入缓冲液以冲出精子。或者，也可在刺出出口孔的同时注入缓冲液以冲洗精子。使用剪去尖端的移液枪头（避免剪切精子）将精子悬液转移至微量离心管中，并置于冰上。
2. 通过将精子以1:100比例稀释于1.5 × OR-2缓冲液中，取20 μl混合后的精子悬液，使用血细胞计数板在1 mm²的大方格区域内计数细胞数量，从而估算所获青蛙精子的数量。根据血细胞计数板的计数结果和稀释比例，计算精子密度及收获的总精子数。当使用双侧睾丸时，总体积约为2 ml，总精子数通常为2–6 × 10⁷。用1.5 × OR2缓冲液稀释原液精子悬液，使精子密度达到2 × 10⁷/ml。制备后2至3小时内使用精子进行实验。通过将5 μl精子与F-1缓冲液按1:10稀释，并使用相差光学显微镜观察运动情况来评估精子活力。至少应有40%至50%的精子具有活动能力。即使合适的制备样本中也会含有大量不活动的精子，其中大多数为未成熟精子。
3. 使用移液枪向新的24孔塑料组织培养板的每个孔中加入700 μl F1缓冲液进行准备。每个孔底部直径约为15 mm。
4. 在室温（约21至23°C）下，将100 μl精子悬液与900 μl F1缓冲液在微量离心管中混合稀释，通过渗透压冲击激活精子运动能力，开始一系列实验。每次以该方式新激活的精子必须在1–2分钟内使用完毕。
5. 将一个孔径为12 μm的插入式滤器（外径12 mm）放入已加满缓冲液的孔中；确保滤器偏心放置，在一侧留出空间。立即使用剪去尖端的移液枪头吸取400 μl已激活运动的精子悬液，将其加至滤器插入孔的壁上，使其沿壁缓慢流下并接触滤器底部；切勿将精子悬液直接吹打到滤膜上。
6. 小心地用移液枪将50 μl趋化因子试剂加入孔中滤器与孔壁之间的空隙处。必须注意将液滴沉积在孔壁与底部交界处，并在不扰动系统的情况下撤出移液枪。具体操作时，移液枪的活塞应仅压至第一停点，以完全排出样品而不引入气泡。
7. 重复上述步骤2.5和2.6，以启动所需数量的实验，然后孵育培养板，直至第一个开始的实验已孵育50分钟。通常每隔45至60秒可启动一次实验。请注意，有经验的操作者或两人协作可使实验流程更高效。在此情况下，只要每次激活后1至2分钟内使用精子，即可利用更多活动精子储备并加快移液速度，从而同时启动一排或两排实验。
8. 按启动顺序逐一终止各次实验。首先，一手稳住滤器插入物，另一手小心地用移液枪或巴斯德吸管吸除上室中大部分或全部精子悬液。立即使用精细镊子取出滤器插入物并丢弃。此步骤需格外小心，以免残留精子被人为带过滤膜，导致精子穿过滤膜的数据虚高。
9. 从每孔中将全部精子悬液转移至微量离心管中。在吸取前充分混匀孔内悬液非常重要，因为精子容易沉降至孔底。加入15 μl 25%甲醛，使其终浓度为0.5%（v/v），若当天不进行精子计数，则应冷藏保存。
10. 使用最大转速为2000 × g的微型离心机，以“瞬时离心”模式离心10秒，使各管中的精子沉淀。每管中弃去上清液，仅保留100 μl，然后将沉淀在此体积中重新悬浮。取20 μl精子悬液，用蒸馏水按1:10稀释，在直立式显微镜下使用40×物镜在血细胞计数板上计数精子。根据计数结果和稀释倍数，计算每次实验中穿过滤膜的精子总数。

3. 使用Zigmond小室进行蛙类精子追踪实验

1. 准备用于录像的倒置显微镜工作站。我们使用配备 Sony DXC-390 三芯片彩色模拟视频相机或 Hamamatsu ORCA-03G 单色数字相机的 Nikon Elipse TE300 倒置显微镜。Zigmond 小室载玻片必须倒置放置在载物台上，且载物台板需留有足够空间以容纳 22×40 mm 的盖玻片。这种设置是必要的，因为蛙类精子无法逆重力游动。将 4× 或 10× 物镜对焦于两个槽之间的观察平台。
2. 测试以确保相机对观察平台对焦准确且居中。若使用 Sony 相机，其输出信号将传送至视频监视器和一个 A/D 转换器（图像采集卡），该转换器能够从视频信号中每秒采集 7 帧图像。数字信号由运行频率为 3 GHz 或更高、最好配备 4 GB 或以上内存的计算机进行处理。尽管我们曾使用 Scion Image 软件（NIH Image 的定制 Windows 版本）控制 Scion CG-7 图像采集卡，但这些产品现已不再提供。目前可采用 Image J 软件配合 VirtualDub 插件来捕获模拟视频相机的信号。若使用 Hamamatsu 相机，其数字输出由 Olympus cellSens 软件处理，并在计算机显示器上显示。在两种情况下，数据均以 8 位 TIFF 图像序列的形式保存在内部或外部硬盘驱动器上。使用 Scion Image 软件时，需通过 Image J 将 TIFF 图像序列转换为图像栈。
3. 显微视野应包含观察平台宽度的大部分或全部。为获得最佳效果，请使用相差或暗场光学系统。通过分别对两个表面进行差分对焦，确定观察平台表面与盖玻片底部之间的距离应为 15 至 20 μm。
4. 在 F1 缓冲液中配制适当浓度的趋化因子。按照先前所述方法制备 Xenopus laevis 精子，并将其保存在冰上的 1.5 × OR2 缓冲液中，直至使用。
5. 组装 Zigmond 小室。从一个干燥洁净的小室开始。使用微量移液器在每个槽外侧边缘约 5 mm 处平行地滴加一条硅油（4 μl）。将一块 22×40 mm 的盖玻片放置在小室上，使硅油均匀扩散至每个槽的外缘。如果初步实验表明精子粘附是一个问题，可按照 Fabro 等人³的建议，用硝酸纤维素对盖玻片进行包被。或者，在缓冲液中添加蛋白质（如 1% BSA）也可减少精子粘附。
6. 将小室倒置，并小心地放置在显微镜载物台的圆形切口上，确保盖玻片不与载物台接触。这种倒置构型对于将 Xenopus 精子从槽中带至观察平台是必要的。与哺乳动物精子不同，Xenopus 精子无法逆重力游动以到达平台。
7. 在室温下，通过将 20 μl Xenopus 精子与 F1 缓冲液按 1:10 混合，在 1.5 × OR2 缓冲液中激活精子。使用剪去尖端的微量移液器，立即将 70 μl 激活后的运动精子转移至槽中。操作时将移液器保持低角度，并将尖端置于槽的侧向开口处。细胞悬液通过毛细作用充满槽和桥区。随后，以相同方式用趋化因子溶液填充对侧的槽。
8. 在 3 分钟内开始录像（Xenopus 精子的运动寿命有限），并持续录像 5 分钟。录像结束后，拆卸小室，先用喷瓶中的加压水流清洗槽和观察平台，再用乙醇冲洗。用纸巾擦拭上表面的硅油，注意避免污染观察平台和槽区。
9. 如有需要，使用 Image J 软件将采集的视频数据转换为 TIFF 图像序列或图像栈。然后在 Image J 中打开文件，在前 21 帧（3 秒）中选择最多 50 个精子进行追踪。为避免偏差，应从观察视野的所有区域随机选择精子，且在选择时不预知其轨迹数据。使用 Image J 的 MtrackJ 插件模块，通过鼠标点击方式逐点记录每个精子在 x-y 平面上随时间变化的二维细胞轨迹（xyt 数据集）。在 MtrackJ 中可视化轨迹，并计算轨迹距离、坐标轴分量和速度。或者，可将 xyt 数据集导入 Microsoft Excel，进行上述操作及进一步的数值分析（如方向性、趋化参数及参数直方图）。
10. 在 Excel 中绘制每个精子的轨迹图，以识别整体运动模式，包括直线、曲线和环形运动模式，以及转弯等特征。利用 xyt 数据集计算平均曲线速度、沿 X（梯度）轴和 Y 轴的净位移，以及相对于梯度轴的平均运动角度等方向性参数。

4. 代表性结果：

双室实验中的重要技术参数包括室的大小和形状、膜的孔隙率以及孵育时间。盛放精子的上室直径不宜过大，以免需要大量精液（最好不超过0.5 ml）；上室也不宜过深，以避免形成较高的细胞悬液液柱（<1 cm）。下室缓冲液的体积应与上室插入物内的细胞悬液液面完全齐平，以避免产生跨膜静水压力，从而人为地迫使精子穿过膜。操作时应先将空插入物放入底部孔中，再加入精子，这样可在加样初期形成向上的静水压力，防止精子在加样过程中穿过膜。膜孔径的选择取决于精子的大小以及市售多孔膜插入物的可获得性。我们发现，蛙类精子实验可使用8或12 μm直径的孔径，但12 μm孔径可使更多精子通过，有利于更准确计数。大于12 μm孔径的膜目前似乎无商品化产品。除组织培养插入物外，另一种选择是使用Neuroprobe公司专为96孔板趋化实验设计的膜。这类膜具有更高的通量潜力，并提供更广泛的孔径选择。尽管较大的哺乳动物精子似乎需要更大的孔径，但我们已成功使用12 μm孔径插入物检测小鼠精子的趋化性（Burnett，未发表观察结果）。相反，对于较小的精子（如海胆精子），较小的孔径可能已足够，尽管我们尚未对此进行验证。

所述双室实验的一个缺点是，精子被放置在上室中，因此不可避免地会因重力作用导致部分精子通过，从而降低信号与背景的比值。这一局限性是由于Xenopus精子的运动能力不够强，无法像哺乳动物精子那样逆重力游动所致。检测Xenopus精子的另一个困难在于其运动寿命较短——激活后仅能维持5至15分钟。这一限制要求在进行多个实验时，每2至3分钟必须重新激活一批新的精子。因此，时间进程研究表明，大多数精子通过发生在实验开始后的前20分钟内⁵。尽管我们采用了50分钟的孵育时间，但该时间很可能可缩短至20或30分钟。相比之下，小鼠精子可维持数小时的运动能力，因此我们已成功使用长达2小时的实验周期（Burnett，未发表观察结果）。

在使用蛙类精子的双室实验中，通常有1万至2万条精子穿过微孔膜，约占置于上室插入物中精子总数的1%至2%。当下室存在趋化因子梯度时，精子穿膜数量可增加4到10倍。图2展示的是本实验中典型的剂量-反应曲线。在下室中加入一系列稀释梯度的非洲爪蟾（Xenopus）卵胶提取物（“卵水”，含已知趋化蛋白allurin，红色圆圈），每个实验中的总卵水蛋白量以微克/实验表示——即原始50 μl体积所提供的蛋白量。由于所加入的蛋白会形成扩散梯度，精子实际响应的蛋白浓度范围尚不明确，但估计比所加入液滴的蛋白浓度低5至10倍。因此，我们以加入的蛋白量表示，而非浓度。通常，每个剂量组进行两次或三次重复实验，并取平均值；随后使用来自不同雄性个体的精子重复整个实验3至4次。对每个剂量组计算均值及均值的标准误，标准误通常为均值的5%至10%。需要注意的是，缺乏已知趋化活性的蛋白（如牛血清白蛋白，空心圆圈，图2）也可能导致精子穿膜数量出现轻微的非特异性增加。一个有趣的观察结果是，“卵水”的剂量-反应曲线呈多相性——具有上升相和下降相。此类多相关系在精子趋化因子中较为常见；人精子对卵泡液的反应也表现出类似的双相关系⁶，这被认为具有生物学意义：卵子附近高浓度的趋化因子可能有助于减弱精子的进一步搜索行为。

有时我们会发现该实验的对照值高于正常水平，从而降低了趋化因子所引起的倍数增加。通常，这种情况可归因于实验过程中滤膜小室的机械性损伤。因此，在加样精子或趋化因子时、实验孵育过程中以及取出小室时，均应避免扰动小室。尤其关键的是，在将小室从孔板中取出之前，必须先用移液器或抽吸法移除小室内储存的精子悬液。这样可以确保在取出小室时，精子不会随着小室的移动而被带入底部腔室穿过微孔膜。

Zigmond小室实验中的重要技术参数包括盖玻片与观察平台之间的距离、视频观察的放大倍数、所用光学器件的类型以及帧率。观察平台之间的距离通常为10至15 μm，但该距离可通过用于连接盖玻片与小室载玻片之间的硅油量进行调节——硅油越多，距离越大。较薄的液体层会延长浓度梯度形成所需的时间，但梯度一旦形成后维持时间更长。较厚的液体层可加快浓度梯度的形成速度，但形成的梯度寿命较短且稳定性较差。可通过在趋化剂孔中使用荧光染料或荧光葡聚糖，并结合荧光显微镜观察，来可视化浓度梯度形成的动态过程。测试试剂的分子量应与所用趋化剂相匹配，并根据所测定的动态结果判断应预留多少分钟用于浓度梯度的形成及精子运动的记录。

如果需要观察整个观测平台（如我们所描述的实验条件），总体应使用较低的放大倍数（4x 或 10x 物镜）。另一方面，若需监测较短的运动轨迹片段或解析鞭毛运动，则可采用较高放大倍数（40x 或 63x 物镜）。追踪可通过本文所述的半手动方法进行，也可通过更复杂的软件（如 MetaMorph 或 Imaris Track）中常用的自动追踪方法完成。无论采用哪种方式，追踪的难易程度都高度依赖于图像对比度，无论是由操作者还是由软件辅助的物体识别来判断。尽管在某些情况下可使用明场光学成像，但通常需要采用相差光学成像或暗场光学成像。最后，帧率取决于追踪所需的时间分辨率。若采用本实验方案中的半手动方法，由于数据记录过程劳动强度较大，帧率可能受限于较低水平——每秒 4 至 8 帧。相反，对于鞭毛波形等快速响应过程，可能需要视频速率的观测。通常，为了实现最佳实验目标，应分别进行低帧率和高帧率的实验，因为在此过程中还可能需要调整其他参数，如放大倍数、光学模式或数字图像处理方式。

Zigmond小室追踪实验的典型结果是一组轨迹，如视频片段Movie 1中所示的50个蛙类精子的轨迹。在观察平台图像上，对照实验（无趋化因子梯度存在）中单个精子的轨迹以红色标出。每个精子在x-y平面内随时间变化的二维细胞轨迹可通过MtrackJ软件进行绘制和记录，并导入Microsoft Excel。在轨迹分析中，我们将趋化因子梯度方向定义为X轴，Y轴则为正交方向，这一设定与Fabro等人³最初建立的惯例一致。如图3所示，实际行进轨迹由若干步组成，各步长度之和等于轨迹中行进的曲线距离（蓝/金箭头）。每个精子行进的净距离和方向由轨迹起始点与终点之间的矢量连接表示（红色斜向箭头）。净位移可分解为X轴分量和Y轴分量（红色虚线箭头；也分别称为净ΔX和净ΔY）。

由于脊椎动物精子的趋化性可能涉及相对细微的运动方向变化，通常需要对大量精子（100至300个）进行随机分析，每种条件往往需要合并4到6次独立实验的数据。然而，为了便于说明，本文仅使用50个蛙类精子的数据。表1列出了用于检测精子运动变化的常见参数。如果在趋化因子存在的情况下，整个精子群体的运动轨迹更趋向于与浓度梯度方向一致，则沿X轴的平均净位移将显著增加。在本示例中，加入卵水后，精子沿X轴的平均净位移增加了三倍以上。此外，还可以绘制精子群体X轴净位移的直方图，这种方法的优势在于能够检测到较小的响应亚群。Fabro等人提出的两个参数³也有助于识别此类亚群。若整个精子群体对趋化因子敏感，或仅有部分亚群敏感但效应仍较显著，则表现出正向X轴净位移的精子百分比（% ΔX>0）以及净运动方向与梯度轴夹角不超过45度的精子百分比（%ΔX/|ΔY|> 1）均可能显著上升。表1中的示例显示，在卵水梯度作用下，50个蛙类精子的这两个参数均有所提高。需要注意的是，完全随机且无方向性的运动将使这两个参数分别产生50%和25%的非零值；对照组中高于此值的结果（如表1所示）可能源于样本量较小或实验设计中特有的精子定向偏倚。

精子在趋化因子作用下运动方向性的评估可直接通过theta角进行，即每条精子净运动矢量与梯度（X轴）之间的夹角。表1中的示例显示，在卵水梯度中游动的精子其平均theta角减小，表明精子群体的运动轨迹与梯度方向更趋于一致。与净X轴位移（见上文）类似，精子群体的theta角也可表示为分布形式，这种方法同样能够敏感地检测出响应性精子亚群，最近Gakamsky等人⁷对此进行了研究。

最后，还可以从描述精子在x-y平面内随时间变化的二维细胞运动轨迹的数据中提取单个精子的曲线速度和瞬时速度。人们可能会发现，精子的运动速度增加，同时运动方向发生改变，从而提示存在化学动力响应以及化学趋向性响应。

这些数据为精子轨迹分析提供了起点。进一步的分析可包括对轨迹直线性和曲率进行逐时刻测量（如Bohmer等人⁸和Shiba等人⁹所开展的工作）、由Burnett等人¹⁰实现的转向自动检测，以及通过分形分析评估的非线性特征^11,12。若以更高倍率监测沿这些轨迹游动的精子，则还可对鞭毛运动及实时钙信号进行成像，多个实验室已实现此类研究^{8,9,13,14,15,16}。这些研究表明，无论是无脊椎动物还是哺乳动物的精子，均能通过朝向化学引诱物源的上梯度急剧转向来响应化学引诱物。这些转向伴随着鞭毛的弯曲，从而改变精子的方向，其作用机制类似于船舵；这些弯曲似乎由特定的、呈波状传播通过鞭毛的钙信号所触发。因此，精子追踪的最终目标是将信号系统的动态变化与鞭毛推进方式的改变相关联，而后者正是精子在化学趋化梯度中实现定向运动的基础。然而，对于以螺旋方式运动¹⁷、轨迹曲率较低¹⁰且尚未实现钙信号监测的非洲爪蟾（Xenopus）精子而言，上述目标尚未达成。

尽管本文重点详述了我们用于Xenopus laevis精子的检测方法，但只要进行适当修改，双室精子聚集检测法和Zigmond室追踪检测法也可用于哺乳动物精子。如果需要，这两种检测均可在37 °C下进行，可通过使用载玻片加热器，以及在Zigmond室检测中配合正置显微镜载物台加热器来实现。通常，哺乳动物精子需使用适当的哺乳动物缓冲液和趋化因子进行分离、获能和孵育，但数据分析方法将与本文所述两栖类物种的方法类似。另一个不同之处在于，Zigmond室通常需垂直放置在正置显微镜的载物台上，因为哺乳动物精子能够向上游动至观察平台，而Xenopus精子则不能。这两种检测方法尚未在其他物种精子中进行测试，但未来研究中可能应用于多种物种的精子分析。

图1. 双室实验的示意图。将精子置于插入物中，其底部为带有12 μm孔径的聚碳酸酯滤膜。将趋化引诱剂溶液小心地加入孔板中，以启动浓度梯度的形成。

图2. 利用双室精子趋化性检测法获得的青蛙精子代表性数据。X. laevis 卵子制备的卵水显示出多相剂量-活性曲线，这是精子趋化剂的典型特征。牛血清白蛋白仅轻微增加精子通过率——属于蛋白质的非特异性效应。该图修改自 Al-Anzi & Chandler⁵。

视频 1. 一段视频片段，显示在Zigmond小室的观察平台上绘制的青蛙精子轨迹（红色）。平台宽度为1 mm。点击此处观看视频片段。

图3. 在Zigmond小室观察平台上绘制了坐标轴规定、精子的曲线运动轨迹以及净直线运动的矢量。所获得的数据包括三种类型。第一，精子轨迹本身（蓝色/金色箭头）可揭示特定模式，如环形和转向（星号标记）。可对轨迹路径测量曲线距离和曲线速度。第二，可计算每条轨迹的净直线运动距离、沿X轴（浓度梯度方向）的净位移分量、沿Y轴的净位移分量，以及X轴与净运动矢量之间夹角θ，并对所有追踪精子的分布情况进行比较。第三，可对单个轨迹中各片段的瞬时速度和运动方向变化进行个体或群体水平的研究。上方为小室的侧面示意图。

表1. 分析Zigmond小室数据时常用的参数。

讨论

在多种生物学背景下，通过变形运动或鞭毛驱动游动的细胞均表现出趋化性，而研究这一现象需要具备实用且可靠的检测方法。该现象的一些实例，例如精子向海胆卵细胞的趋化吸引，或黏菌细胞聚集形成子实体，具有直观的视觉效果。如Eisenbach¹⁸所述，对此现象的定量分析已通过多种方法实现，包括使用充满趋化因子的毛细管吸引精子、利用连接储液池的毛细管建立浓度梯度，以及使用Makler计数板，其上设有分别放置精子和趋化因子的小孔。本文描述了两种目前使用更为广泛的“第二代”检测方法。尽管这些方法仍依赖于浓度梯度的建立，但引入了若干新特性。首先，双室检测法的优势在于，大量膜孔可同时供精子穿越梯度，而非仅通过单个毛细管开口，从而在单次实验中允许更多精子对浓度梯度进行测试。

定向细胞运动的模式是趋化性中的一个关键特征，因此人们自然开发出了新的细胞追踪方法。其中一种新方法是对精子接近卵子时的三维轨迹进行扫描。Zimmer 及其同事利用移动的红外光平面来检测精子位置，提供了卵子位于中心的腔室中的精子轨迹数据——该装置采用天然化学趋化因子源，并具有相对较远的腔壁，从而避免干扰精子的自然运动...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔板	BD Biosciences	35/1147
外径12 mm、孔径12 μm 的插入式培养小室	EMD Millipore	PIXP01250	我们此前使用的是 Costar-Corning Transwell 板 #3403，现已停产
Zigmond 迁移小室	Neuroprobe	Z02
硅油	GE Healthcare	SF1154	相当于 Dow Corning 550 Fluid
Image J 软件	Wayne Rasband，美国国家心理健康研究所研究服务部	可从 http://rsbweb.nih.gov/ij 免费下载	可在 Windows、Linux 和 Mac 系统上运行的 Java 程序
MtrackJ 软件	生物医学成像小组	可从 http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ 免费下载	可在 Windows、Linux 和 Mac 系统上运行的 Java 程序
Virtual Dub 软件	GNU 通用公共许可证	可通过 http://www.virtualdub.org/index.html 免费下载	安装说明位于 Image J 网站插件部分；仅适用于 Windows 系统
cellSens 软件	Olympus Corporation	详见网站：http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070	可控制多种相机并采集图像，同时具备图像处理功能