检测蛙类精子趋化性的两种测定方法

摘要

卵子及其周围的胞外包被常会释放多肽、蛋白质和小分子，这些物质可与精子进行通讯，引导精子趋向卵子，从而促进受精。本文利用蛙类精子，描述并比较了两类用于检测精子趋化性吸引的实验方法——精子聚集实验和精子追踪实验。

摘要

在无脊椎动物中，精子的化学趋向性可能足够显著，以至于可以将含有趋化肽的移液管插入精子悬液中，通过显微镜直接观察到精子在移液管周围的聚集现象¹。而在脊椎动物（如青蛙、啮齿类动物和人类）中，精子化学趋向性的检测更为困难，需要采用定量分析方法。这类分析方法主要分为两类：一类是量化精子向趋化因子源移动情况的实验，即所谓的精子聚集实验；另一类则是实际追踪单个精子游动轨迹的实验。

精子聚集实验相对快速，可在一天内完成数十甚至数百次实验，从而能够较快地开展剂量反应曲线和时间过程的研究。这类实验已被广泛用于表征许多已建立的化学趋化系统——例如，中性粒细胞对细菌肽类的趋化作用以及精子对卵泡液的趋化作用。精子追踪实验则更为耗时，但能提供化学趋化物如何实际改变精子游动路径的额外数据。此类实验对于证明精子运动方向相对于化学趋化梯度轴的定向性，以及观察使精子更接近卵子的特征性转向或方向变化至关重要。

本文描述了上述两种类型实验所使用的方法。其中精子趋化聚集实验采用的是“双室”实验法。将两栖动物的精子置于带有聚碳酸酯滤膜底部的组织培养板小室中，滤膜孔径为12 μm。将含有精子的小室插入含有缓冲液的组织培养板孔中，并用移液器将趋化因子小心加入底部孔中，使其位于滤膜底部与孔壁交界处（见图1）。孵育一段时间后，小心移除上层含有精子储存液的小室，收集穿过滤膜进入下室的精子，经离心形成沉淀后，使用血细胞计数板或流式细胞仪进行计数。

精子追踪实验采用Zigmond小室，该装置最初用于观察中性粒细胞趋化性，后由Giojalas及其同事加以改进，用于精子观察^2,3。该小室由一块厚玻璃载片制成，其上加工出两条垂直的槽，中间由一条宽1 mm的观察平台隔开。盖上盖玻片后，将精子加入其中一条槽，化学趋化剂加入另一条槽，通过视频显微镜观察单个精子的运动。随后利用软件分析视频影像，获取精子在x-y平面内随时间变化的二维细胞运动轨迹（即xyt数据集），从而形成每条精子的运动轨迹。

方案

1. 使用的材料和缓冲液

1. 卵母细胞林格氏缓冲液（1.5 × OR2）含有 124 mM NaCl、3.75 mM KCl、1.5 mM CaCl₂₂，1.5 mM MgCl₂，1.5 mM Na₂HPO₄，10 mM Hepes， pH 7.8。受精缓冲液（F-1）含有 41.25 mM NaCl、1.25 mM KCl、0.25 mM CaCl₂，0.06 mM MgCl₂，0.5 mM Na₂HPO₄，2.5 mM Hepes，pH 7.8。
2. 非洲爪蟾 根据Sugiyama等人的方法制备卵水。⁴简要描述如下：将 freshly spawned 的带胶质青蛙卵在少量 F-1 缓冲液中轻轻旋转孵育 30 分钟，随后用微量移液器移除孵育后的上清液。该上清液称为“卵水”，也可用于制备纯化的 allurin，即该胶质提取物中的主要趋化因子。精子取自商业养殖的 Xenopus laevis 或 Xenopus tropicalis.
3. 参见材料表以获取实验所需的特定物品。

2. 蛙精子趋化性的双室检测法

1. 将青蛙浸入含有0.07%苯佐卡因的水中进行麻醉，使用碳化硅刃剪刀断头，并进行双次穿刺以确保安乐死。剪除腹部皮肤以暴露肌肉，沿中线及两侧切开腹肌并牵开。轻柔地牵开肠道和脂肪组织，暴露出白色、豆状的睾丸。使用精细剪刀修剪掉结缔组织，注意避免损伤血管。取出一个睾丸，用1.5 × OR2缓冲液洗去血液，然后在滤纸上滚动睾丸以去除多余缓冲液及附着的小血管，随后将睾丸置于盛有0.2 ml 1.5 × OR2缓冲液的塑料培养皿中。用5 ml注射器吸取2 ml 1.5 × OR2缓冲液，轻轻在睾丸一端表面多处刺10–20个孔，从另一端插入针头并缓慢注入缓冲液以冲出精子。或者，也可在刺出出口孔的同时注入缓冲液以冲洗精子。使用剪去尖端的移液枪头（避免剪切精子）将精子悬液转移至微量离心管中，并置于冰上。
2. 通过将精子以1:100比例稀释于1.5 × OR-2缓冲液中，取混合后的精子悬液20 μl样本，使用血细胞计数板在1 mm²大方格区域内计数细胞数量，估算所获青蛙精子数目。根据血细胞计数结果和稀释比例计算精子密度及总收获量。当使用双侧睾丸时，总体积约为2 ml，通常可获得2–6 × 10⁷个精子。用1.5 × OR2缓冲液稀释原液精子悬液，使最终精子密度达到2 × 10⁷/ml。制备后2–3小时内用于实验。取5 μl精子与F-1缓冲液按1:10稀释，利用相差显微镜观察运动情况以评估精子活力。至少应有40%–50%的精子具有活动能力。即使合格的制备样本中也会含有大量不活动精子，其中多数为未成熟精子。
3. 使用移液枪向新的24孔塑料组织培养板每孔加入700 μl F1缓冲液以完成准备。每孔底部直径约为15 mm。
4. 在微量离心管中将100 μl精子悬液与900 μl F1缓冲液在室温（约21–23°C）下混合，通过渗透压休克激活精子运动能力，开始一系列实验。每次以该方式激活的新鲜精子必须在1–2分钟内使用完毕。
5. 将一个孔径为12 μm、外径为12 mm的插入式滤器放入已加满缓冲液的孔中；确保滤器偏心放置，在一侧留出空隙。立即使用剪去尖端的移液枪头将400 μl已激活运动的精子悬液转移至孔中。将精子悬液加至滤器插入环的壁面，使其沿壁缓慢流下并接触滤器底部；切勿将悬液直接加至滤膜表面。
6. 小心地使用移液枪将50 μl趋化因子试剂加入孔内滤器与孔壁之间的空隙区域。操作时需将液滴准确加至孔壁与底部交界处，并在退出移液枪头时避免扰动体系。特别注意：移液枪的推杆仅应压至第一停点，以完全排出液体而不引入气泡。
7. 重复上述第2.5和2.6步，启动所需数量的实验，随后孵育整块板，直至第一个开始的实验已孵育50分钟。通常每45–60秒可启动一个实验。经验丰富的操作者或两人协作时可优化流程，在保证每次激活后1–2分钟内使用精子的前提下，利用更多活动精子储备并加快移液速度，从而同时启动一至两行实验。
8. 按启动顺序依次终止各实验。首先，一手稳住滤器插入环，另一手小心用移液枪或巴斯德吸管吸除上室中大部分或全部精子悬液。立即使用精细镊子取出滤器并丢弃。此步骤需格外小心，以免残留精子被人为带过滤膜，导致精子穿过滤膜的数值虚高。
9. 从每个孔中将全部精子悬液转移至微量离心管中。在吸取前充分混匀孔内悬液至关重要，因为精子易沉降至孔底。向每管中加入15 μl 25%甲醛，使终浓度为0.5%（v/v）。若当天不进行计数，应将样本冷藏保存。
10. 使用最大转速为2000 × g的微型离心机，以按钮瞬时离心10秒，使各管中的精子沉淀。每管弃去上清液，仅保留100 μl，再将沉淀在此体积中重悬。取20 μl精子悬液，以蒸馏水1:10稀释，使用直立显微镜配备40倍物镜在血细胞计数板上计数精子。根据计数结果和稀释倍数，计算每次实验中穿过滤膜的精子总数。

3. 使用Zigmond小室进行蛙类精子追踪实验

1. 准备用于录像的倒置显微镜工作站。我们使用配备 Sony DXC-390 三芯片彩色模拟视频相机或 Hamamatsu ORCA-03G 黑白数字相机的 Nikon Elipse TE300 倒置显微镜。Zigmond 小室载玻片必须倒置放置在载物台上，且载物台板需留有足够空间以容纳 22×40 mm 的盖玻片。这种设置是必要的，因为蛙类精子无法逆重力游动。将 4× 或 10× 物镜聚焦于两个槽之间的观察平台。
2. 测试以确保相机对观察平台对焦准确且居中。若使用 Sony 相机，其输出信号传送至视频监视器和 A/D 转换器（图像采集卡），该转换器可从视频信号中每秒采集 7 帧图像。数字图像流由运行频率为 3 GHz 或更高、最好配备 4 GB 或以上内存的计算机进行处理。尽管我们曾使用 Scion Image 软件（NIH Image 的定制 Windows 版本）控制 Scion CG-7 图像采集卡，但这些产品现已停售。目前可采用 Image J 软件配合 VirtualDub 插件来采集模拟视频相机的图像。若使用 Hamamatsu 相机，其数字输出由 Olympus cellSens 软件处理，并在计算机显示器上显示。在两种情况下，数据均以 8 位 TIFF 图像序列的形式保存至内部或外部硬盘。若使用 Scion Image 软件，需通过 Image J 将 TIFF 图像序列转换为图像栈。
3. 显微视野应包含观察平台宽度的大部分或全部。为获得最佳效果，建议使用相差或暗场光学系统。通过分别对两个表面进行调焦，确定观察平台表面与盖玻片底面之间的距离应为 15 至 20 μm。
4. 在 F1 缓冲液中配制适当浓度的趋化引诱剂。按先前所述方法制备 Xenopus laevis 精子，并将其保存在冰上的 1.5× OR2 缓冲液中，待用。
5. 组装 Zigmond 小室。从一个干燥洁净的小室开始。使用移液器在每个槽外侧边缘约 5 mm 处平行点加一圈硅油（4 μl）。将一块 22×40 mm 的盖玻片置于小室上，使硅油均匀扩散至每个槽的外缘。若预实验显示精子粘附问题严重，可参考 Fabro 等人³的建议，用硝酸纤维素对盖玻片进行包被。或者，在缓冲液中添加蛋白质（如 1% BSA）也可减少精子粘附。
6. 将小室倒置，并小心地放置在显微镜载物台的圆形切口上，确保盖玻片不与载物台接触。这种倒置构型是将 Xenopus 精子从小槽转移至观察平台所必需的。与哺乳动物精子不同，Xenopus 精子游动能力较弱，无法逆重力游至平台。
7. 在室温下，通过将 20 μl Xenopus 精子与 F1 缓冲液以 1:10 比例混合，激活其运动能力。使用剪去尖端的移液器头，立即将 70 μl 激活后的运动精子转移至小槽中。操作时将移液器保持低角度，将尖端置于槽的侧孔处。细胞悬液依靠毛细作用填充小槽及中间桥区。随后，以相同方式用趋化引诱剂溶液填充对侧小槽。
8. 在激活后 3 分钟内开始录像（Xenopus 精子的运动寿命有限），持续录像 5 分钟。录像结束后，拆卸小室，先用喷瓶中的加压水流清洗槽和观察平台，再用乙醇冲洗。用纸巾小心擦除上表面的硅油，避免污染观察平台和槽区。
9. 如有需要，使用 Image J 软件将采集的视频数据转换为 TIFF 图像序列或图像栈。随后在 Image J 中打开文件，在前 21 帧（3 秒）内选择最多 50 个精子进行追踪。为避免偏差，应从观察视野的各个区域随机选取精子，且不预先知晓其轨迹数据。使用 Image J 的 MtrackJ 插件模块，通过鼠标点击逐帧记录每个精子在 x-y 平面上随时间变化的二维细胞轨迹（xyt 数据集）。在 MtrackJ 中可视化轨迹，并计算轨迹距离、坐标轴分量和速度。或者，可将 xyt 数据集导入 Microsoft Excel，进行上述操作及进一步的数值分析（如方向性、趋化参数及参数直方图）。
10. 在 Excel 中绘制每个精子的轨迹图，识别整体运动模式，包括直线、曲线和环形运动模式，以及转弯等特征。利用 xyt 数据集计算平均曲线速度、沿 X 轴（浓度梯度方向）和 Y 轴的净位移，以及相对于浓度梯度轴的平均运动角度等取向参数。

4. 典型结果：

双室实验中的重要技术参数包括室的大小和形状、膜的孔隙率以及孵育时间。上室（容纳精子）的直径不宜过大，以免需要大量精液（最好为0.5 ml或更少），也不宜过深，以避免形成较高的细胞悬液液柱（<1 cm）。下室缓冲液体积应与上室插入物内的细胞悬液液面完全齐平，以避免产生跨膜静水压力，从而人为地迫使精子穿过膜。应先将空插入物放入底部孔中，再加入精子，这样可在加样过程中产生初始向上的静水压力，防止精子在加样时即穿过膜。膜孔径的选择取决于精子的大小以及市售多孔膜插入物的可获得性。我们发现，蛙类精子实验可使用8或12 μm直径的孔径，但12 μm孔径可使更多精子通过，便于更准确计数。大于12 μm孔径的膜目前似乎无商品化产品。除使用组织培养插入物外，另一种选择是使用Neuroprobe公司生产的专用于96孔板趋化实验的膜。此类膜具有更高的通量潜力以及更广泛的孔径选择范围。尽管较大的哺乳动物精子似乎需要更大的孔径，但我们已成功使用12 μm孔径插入物检测小鼠精子的趋化性（Burnett，未发表观察结果）。相比之下，较小的精子（如海胆精子）可能适合更小的孔径，但此可能性尚未进行测试。

所述双室实验的一个缺点是，精子被放置在上室中，因此不可避免地会因重力作用导致部分精子通过，从而降低信号与背景的比值。这一限制的原因在于，Xenopus 精子的运动能力不够强，无法像哺乳动物精子那样逆重力游动。检测 Xenopus 精子的另一个困难是其运动寿命较短——激活后仅能维持 5 至 15 分钟。这一限制要求在进行多个实验时，必须每 2 至 3 分钟激活一批新的精子。因此，时间进程研究表明，大多数精子通过发生在实验开始后的前 20 分钟内⁵。尽管我们采用了 50 分钟的孵育时间，但该时间可能可缩短至 20 或 30 分钟。相比之下，小鼠精子可保持数小时的运动能力，因此我们曾使用长达 2 小时的实验周期并获得良好结果（Burnett，未发表观察）。

在使用蛙类精子的双室实验中，穿过微孔膜的精子总数通常为1万至2万个，约占置于上室插入物中精子数量的1%至2%。当下室存在趋化因子梯度时，精子穿过膜的数量可增加4到10倍。图2展示了本实验中典型的剂量-反应曲线。将含有已知趋化蛋白allurin的非洲爪蟾（Xenopus）卵胶提取物（“卵水”，红色圆圈）以一系列稀释浓度加入下室。每次实验所用“卵水”总蛋白量以微克/实验（μg/assay）表示——即原始50 μl体积所提供的蛋白量。由于加入的蛋白会形成扩散梯度，精子实际响应的蛋白浓度范围尚不明确，但估计比所加入液滴的蛋白浓度低5至10倍。因此，我们以引入的蛋白量而非浓度来表示。通常，每个剂量组进行两次或三次重复实验，并取平均值；随后，利用来自不同雄性个体的精子重复整个实验3至4次。对每个剂量组计算均值及均值的标准误，标准误通常为均值的5%至10%。需要注意的是，缺乏已知趋化活性的蛋白质（如牛血清白蛋白，空心圆圈，图2）也可能导致精子穿过膜的数量出现轻微的非特异性增加。一个有趣的观察结果是，“卵水”的剂量-反应曲线呈多相性——包括上升相和下降相。此类多相关系在精子趋化因子中较为常见；人精子对卵泡液的反应也表现出类似的双相关系⁶，这被认为具有生物学意义：卵子周围高浓度的趋化因子可能有助于减弱精子的进一步搜寻行为。

有时我们会发现该实验的对照值高于正常水平，从而降低了趋化剂所引起的倍数增加。通常，这种情况可归因于实验过程中滤膜小室的机械性损伤。因此，在加样精子或趋化剂时、实验孵育期间以及取出小室时，均应避免扰动小室。尤其关键的是，在将小室从孔中取出之前，必须先用微量移液器或抽吸法移除小室内储存的精子悬液。这样可确保在取出小室时，精子不会随着小室的移动而被带入底部腔室穿过微孔膜。

Zigmond小室实验中的重要技术参数包括盖玻片与观察平台之间的距离、视频观察的放大倍数、所用光学元件的类型以及帧率。观察平台之间的距离通常为10至15 μm，但该距离可通过用于连接盖玻片与小室载玻片的硅油量进行调节——硅油越多，距离越大。较薄的液层会延长浓度梯度形成所需的时间，但梯度一旦形成后维持时间更长。较厚的液层可使浓度梯度更快形成，但梯度寿命较短且稳定性较差。可通过在趋化因子孔中使用荧光染料或荧光葡聚糖，并结合荧光显微镜观察，来可视化浓度梯度形成的动态过程。测试试剂的分子量应与所用趋化因子相匹配，并根据测定的动态过程判断应预留多少分钟用于浓度梯度的形成及精子运动的记录。

如果需要观察整个观测平台（如我们所描述的实验条件），总体应使用较低的放大倍数（4x 或 10x 物镜）。另一方面，若需监测较短的运动轨迹或解析鞭毛运动，则可采用较高放大倍数（40x 或 63x 物镜）。轨迹追踪既可通过本文所述的半手动方法进行，也可通过更复杂的软件（如 MetaMorph 或 Imaris Track）中的自动追踪实现。无论采用哪种方式，追踪的难易程度在很大程度上取决于图像对比度，无论是由操作者还是由软件辅助的目标识别所决定。尽管在某些情况下可使用明场光学成像，但通常需要采用相差光学成像或暗场光学成像。最后，帧率取决于追踪所需的时间分辨率。若采用本实验方案中的半手动方法，由于数据记录过程劳动强度较大，帧率可能受限于较低水平——每秒 4 至 8 帧。相反，对于鞭毛波动等快速反应，可能需要视频速率的观测。通常情况下，为了达到最佳实验目的，应分别进行低帧率和高帧率实验，因为实验中还可能需要调整其他参数，如放大倍数、光学模式或数字图像处理方式。

Zigmond小室追踪实验的典型结果包括一组轨迹，如视频片段Movie 1中所示的50个蛙类精子的轨迹。在观察平台图像上，对照实验（无趋化因子梯度）中单个精子的轨迹以红色标出。每个精子在x-y平面内随时间变化的二维细胞轨迹可通过MtrackJ软件绘制并记录，随后导入Microsoft Excel。在轨迹分析中，我们将趋化因子梯度方向定义为X轴，正交方向定义为Y轴，此定义方式与Fabro等人最初建立的惯例一致³。如图3所示，实际行进轨迹由若干步组成，各步长度之和等于轨迹中的曲线行进距离（蓝色/金色箭头）。每个精子的净位移及其运动方向由轨迹起点与终点之间的矢量表示（红色斜向箭头）。净位移可分解为X轴分量和Y轴分量（红色虚线箭头；亦分别称为净ΔX和净ΔY）。

由于脊椎动物精子的趋化性可能涉及相对细微的运动方向变化，通常需要对大量精子（100至300个）进行随机分析，每种条件往往需要汇总4到6次独立实验的数据。然而，为了便于说明，本文仅使用50个蛙类精子的数据。表1列出了用于检测精子运动变化的常用参数。如果在趋化因子存在的情况下，整个精子群体的运动轨迹更趋向于与浓度梯度方向一致，则沿X轴的平均净位移将显著增加。在本示例中，加入卵水后，精子沿X轴的平均净位移增加了三倍以上。此外，还可以绘制精子群体X轴净位移的直方图，这种方法的优势在于能够检测到较小的响应亚群。Fabro等人提出的两个参数³也有助于识别此类亚群。当整个精子群体对趋化因子敏感时，表现出正向X轴净位移的精子百分比（% ΔX>0），以及净运动方向与梯度轴夹角不超过45度的精子百分比（%ΔX/|ΔY|> 1），均可能显著上升；若仅有部分亚群敏感，则这两个参数仍可能出现较小但具有显著性的升高。表1中的示例显示，在卵水梯度作用下，50个蛙类精子的这两个参数均有所增加。需要注意的是，随机无定向运动情况下，这两个参数的理论值分别为50%和25%；对照组中高于此值的结果（如表1所示）可能源于样本量较小，或实验设计中精子定向存在的固有偏差。

精子在趋化因子作用下的运动方向性可通过角度θ直接评估，该角度为每个精子的净运动矢量与梯度（X轴）之间的夹角。表1中的示例显示，在卵水梯度中游动的精子其平均θ角减小，表明精子群体的运动轨迹更趋向于与梯度方向对齐。类似于X轴方向的净位移（见上文），精子群体的θ角也可表示为分布形式，这种方法同样能够反映对趋化刺激有响应的亚群精子，最近Gakamsky等人的研究对此进行了探讨⁷。

最后，还可以从描述精子在 x-y 平面内随时间变化的二维细胞运动轨迹的数据中，提取单个精子的曲线速度和瞬时速度。人们可能会发现，精子的运动速度增加，同时其运动方向发生改变，这表明精子可能同时存在趋化运动反应和化学趋向性反应。

这些数据为精子运动轨迹的分析提供了起点。进一步的分析可包括对轨迹直线性和弯曲度进行逐时刻测量，如Bohmer等人⁸和Shiba等人⁹所开展的工作，以及如Burnett等人¹⁰实现的转向行为的自动检测，还可通过分形分析评估其非线性特征^11,12。若以更高倍率观察沿此类轨迹游动的精子，则还可对鞭毛运动及实时钙信号进行成像，多个实验室已成功实现这一技术^{8,9,13,14,15,16}。这些研究已证实，无论是无脊椎动物还是哺乳动物的精子，均可通过朝向化学引诱物源的方向发生急剧转向，从而响应趋化因子。这些转向伴随着鞭毛的弯曲，从而改变精子的运动方向，其作用机制类似于船舵；而这些弯曲似乎由特定的、波状传播的钙信号引发，并沿鞭毛传导。因此，精子追踪的最终目标是将信号系统的动态变化与鞭毛推进方式的改变相关联，从而揭示精子在趋化梯度中定向运动的基础机制。然而，上述目标尚未在Xenopus精子中实现，因其运动呈螺旋形¹⁷，轨迹弯曲度较低¹⁰，且其钙信号尚未被成功监测。

尽管我们在此重点详述了所使用的检测方法 非洲爪蟾 非洲爪蟾精子，若进行某些修改，两种室精子聚集实验和Zigmond室追踪实验均可用于哺乳动物精子。两种实验均可在 37 °C 如有需要，可使用载片加热器，以及在齐格蒙德小室实验中使用显微镜载物台加热装置。通常，哺乳动物精子将使用适当的哺乳动物缓冲液和趋化因子进行分离、获能和孵育，但数据分析将与本文所述两栖类物种的方法相似。另一个不同之处在于，齐格蒙德小室通常垂直放置在直立式显微镜的载物台上，因为哺乳动物精子与两栖类不同， 非洲爪蟾 精子能够游上观察平台。这两种检测方法尚未经过测试，但未来可能应用于多种物种的精子研究。

图 1. 双室实验的示意图。将精子置于插入室中，其底部为带有12 μm孔径的聚碳酸酯滤膜。将趋化因子溶液小心地加入孔板中，以启动浓度梯度的形成。

图 2. 使用双室精子趋化实验测定青蛙精子的代表性数据。X. laevis 卵子制备的卵水显示出多相的剂量-活性曲线，这是精子趋化剂的典型特征。牛血清白蛋白仅轻微增加精子通过率——这是蛋白质的非特异性效应。该图改编自 Al-Anzi & Chandler⁵。

视频 1. 一段视频，显示在Zigmond小室的观察平台上绘制的青蛙精子轨迹（红色）。平台宽度为1 mm。点击此处观看视频片段。

图 3. 在 Zigmond 小室观察平台上绘制了坐标轴方向约定、精子的曲线运动轨迹以及净直线位移的矢量。所获取的数据包括三种类型。第一，精子的运动轨迹本身（蓝色/金色箭头）可揭示特定模式，如环形运动和转向（星号标记）。可对轨迹路径计算曲线距离和曲线速度。第二，可计算每条轨迹的净直线位移、沿 X 轴（梯度方向）的净位移分量、沿 Y 轴的净位移分量，以及净位移矢量与 X 轴之间的夹角 theta，并将这些参数在所有被追踪精子中的分布进行比较。第三，可对单个轨迹中各运动片段的瞬时速度和方向变化进行个体或群体水平的分析。上方为该小室的侧视结构示意图。

表 1。 分析 Zigmond 小室实验数据时常用的参数。

讨论

在多种生物学背景下，通过变形运动或鞭毛驱动游动的细胞均表现出趋化性，而研究这一现象需要具备实用且可靠的检测方法。该现象的一些实例，例如精子向海胆卵细胞的趋化吸引，或黏菌细胞聚集形成子实体，具有直观的视觉效果。如Eisenbach¹⁸所述，对此现象的定量分析已通过多种方法实现，包括使用充满趋化因子的毛细管吸引精子、利用连接储液池的毛细管建立浓度梯度，以及使用Makler计数板，其上设有分别放置精子和趋化因子的小孔。本文描述了两种目前使用更为广泛的“第二代”检测方法。尽管这些方法仍依赖于浓度梯度的建立，但引入了若干新特性。首先，双室检测法的优势在于，大量膜孔可同时供精子穿越梯度，而非仅通过单个毛细管开口，从而在单次实验中允许更多精子对浓度梯度进行测试。

定向细胞运动的模式是趋化性中的一个关键特征，因此人们自然开发出了新的细胞追踪方法。其中一种新方法是对精子接近卵子时的三维轨迹进行扫描。Zimmer 及其同事利用移动的红外光平面来检测精子位置，提供了卵子位于中心的腔室中的精子轨迹数据——该装置采用天然化学趋化因子源，并具有相对较远的腔壁，从而避免干扰精子的自然运动...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔板	BD Biosciences	35/1147
外径12 mm、孔径12 μm的插件	EMD Millipore	PIXP01250	我们此前使用的是Costar-Corning transwell板#3403——现已停产
Zigmond小室	Neuroprobe	Z02
硅油	GE Healthcare	SF1154	等效于Dow Corning 550 Fluid
Image J软件	Wayne Rasband，美国国家心理健康研究所研究服务部	可从 http://rsbweb.nih.gov/ij 免费下载	可在Windows、Linux和Mac系统上运行的Java程序
MtrackJ软件	生物医学成像小组	可从 http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ 免费下载	可在Windows、Linux和Mac系统上运行的Java程序
Virtual Dub软件	GNU通用公共许可证	可通过 http://www.virtualdub.org/index.html 免费下载	安装说明见Image J网站插件部分；仅适用于Windows系统
cellSens软件	Olympus Corporation	详见网站：http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070	可控制多种相机并采集图像，同时具备图像处理功能