通过比率型FRET监测细胞周期中的激酶与磷酸酶活性

摘要

基于FRET的报告分子正越来越多地用于监测活细胞中激酶和磷酸酶的活性。本文介绍了一种利用基于FRET的报告分子评估细胞周期依赖性靶蛋白磷酸化变化的方法。

摘要

基于荧光共振能量转移（FRET）的报告分子¹可用于评估活细胞内源性激酶和磷酸酶的活性。这类探针通常由CFP和YFP的变体构成，中间插入一个可磷酸化的序列和一个磷酸结合结构域。当发生磷酸化时，探针构象发生变化，导致CFP与YFP之间的距离或相对取向改变，从而引起FRET效率的变化（图1）。过去十年中已有多篇文献报道了此类探针，用于监测多种激酶与磷酸酶的活性平衡，包括PKA²、PKB³、PKC⁴、PKD⁵、ERK⁶、JNK⁷、Cdk¹⁸、Aurora B⁹和Plk1⁹的报告探针。鉴于其模块化设计，预计在不久的将来还将出现更多类似的探针¹⁰。

细胞周期的进程受到应激信号通路的影响¹¹。值得注意的是，细胞在正常生长状态下与在应激后恢复过程中，其细胞周期的调控机制存在差异¹²。因此，对细胞周期全过程进行延时成像时需格外谨慎。这一问题在进行比率成像时尤为突出，因为正确解读结果需要获得两个具有高信噪比的图像。目前，利用比率荧光共振能量转移（FRET）成像技术研究激酶和磷酸酶活性在细胞周期依赖性变化的应用，主要局限于细胞周期的某些特定阶段^8,9,13,14。

本文介绍了一种利用比率成像技术在整个人类细胞周期中监测基于荧光共振能量转移（FRET）探针的方法。该方法依赖于生命科学领域许多研究人员可获得的常规设备，且无需显微镜或图像处理方面的专业知识。

方案

1. 将探针引入细胞

1. 使用基于FRET的探针和赋予抗性的质粒共转染细胞。选择一种在目标细胞类型中高效的转染方法。对于U2OS细胞，标准的磷酸钙转染方法即可获得足够理想的结果¹⁵。
2. 使用适当的抗生素筛选细胞至少七天。此步骤可富集表达探针的细胞，并减少表达水平具有毒性或严重影响细胞周期的细胞数量。
3. （可选）筛选稳定克隆。
4. 利用固定细胞或活细胞，验证所有细胞中CFP与YFP均以大致相同的比例存在。
5. 若部分细胞仅含有CFP或YFP，则可能发生重组。重组可能发生在细菌扩增期间，也可能在探针转染后发生，后者可能与质粒质量有关。若问题持续存在，应重新制备质粒，并在转染前将质粒线性化。

2. 监测比率型FRET

1. 将细胞接种于玻璃底培养皿或用于腔室固定的盖玻片上，确保培养皿或盖玻片为1.5号（厚度170 μm）。
2. 将细胞置于含无酚红培养基的腔室中，在配备温控系统（设定为37 °C）的电动倒置荧光显微镜上进行观察。通过CO₂调节或使用不含CO₂的培养基（如Liebowitz-15培养基）确保培养基的pH稳定。
3. 使用透射光对细胞进行聚焦。避免使用荧光照明观察细胞。
4. 首先使用YFP激发（YFPex）和YFP发射（YFPem）滤光片以及合适的二向色镜，采集12位或16位图像。选择尽可能高的像素合并（binning）模式，同时仍能保证所需的亚细胞分辨率。采用高像素合并以缩短曝光时间或降低光照强度，对避免光毒性至关重要。
5. 通过测量无细胞区域的像素值，估算背景强度及大致噪声水平，包括粗略的平均值、最小值和最大值。调整曝光时间及中性密度滤光片，使细胞内的平均信号强度约为背景强度加上5至10倍的背景最大值与最小值之差。
6. 确认图像未接近饱和状态。图像中的最大强度应低于动态范围的一半（例如，在12位图像中最大值不超过2000），以便在细胞进入有丝分裂时仍能分辨强度变化。
7. 重复步骤2.4至2.6，改用CFP激发和YFP发射滤光片组合，并搭配合适的二向色镜。
8. 选择多个转染细胞区域（排除步骤2.4至2.7中使用的区域），并确保所有细胞中的最大强度均低于动态范围的一半。
9. 开始延时成像实验，每45分钟使用YFPex-YFPem和CFPex-YFPem滤光片组合各采集两幅图像。

3. 验证并优化条件

1. 打开获取的图像，监测表达转染探针的细胞从一次有丝分裂到下一次有丝分裂的细胞周期时间。
2. 将测得的细胞周期时间与所用细胞类型的已发表数据进行比较。或者，通过每小时仅获取一次透射光图像（例如微分干涉差（DIC）或相差图像）来拍摄未转染细胞，以获得参考用的细胞周期时间。
3. 如果从有丝分裂到有丝分裂的时间与参考细胞周期时间相符，则进入步骤4。否则，采用更强的曝光条件、增加时间点数量或多个z轴层面重新获取图像，并重复步骤3。
4. 如果从有丝分裂到有丝分裂的时间仍与参考细胞周期时间不符，则通过每小时仅获取一次透射光图像（例如微分干涉差（DIC）或相差图像），并在实验结束时再获取一次图像，以识别转染细胞。
5. 如果转染细胞仍表现出更长的细胞周期时间，则重复步骤1，但减少探针的转染量，或筛选探针含量极低的稳定克隆。
6. 如果转染细胞在无荧光光照条件下表现出正常的细胞周期时间，则重复步骤2，但通过调整像素合并（binning）、中性密度滤光片、曝光时间以及图像间的时间间隔来降低曝光强度。

4. 分析FRET

1. 该分析可由大多数专用于显微镜图像处理的软件完成。本文介绍如何使用免费软件 ImageJ（http://rsb.info.nih.gov/ij）及其插件 Ratio Plus（http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html）进行分析。
2. 在 ImageJ 中打开图像。若图像为多色堆叠格式（例如 Deltavision），需先将其转换为超堆叠格式：图像-超堆叠-堆叠转超堆叠，然后使用以下命令将其拆分为单通道堆叠：图像-超堆叠-降低维度。
3. 使用处理-数学-乘法命令，将 YFPex - YFPem 堆叠乘以 3。此步骤为可选，仅用于增强图像的视觉清晰度，避免比值落在 0 到 1 的范围内。
4. 在 YFPex - YFPem 堆叠中，于无细胞但靠近待测细胞的区域绘制一个感兴趣区域（ROI）。同一图像中的不同细胞可能需要不同的背景区域，因为背景和信号强度通常在图像中心最强。
5. 将该 ROI 添加至 ROI 管理器：分析-工具-ROI 管理器。
6. 在 YFPex - YFPem 和 CFPex - YFPem 堆叠中测量该 ROI 的平均强度：分析-测量。
7. 在多个时间点重复上述操作，并确认靠近目标细胞的背景强度在整个影片中保持一致。
8. 设置测量参数以包含最小强度：分析-设置测量-最小与最大灰度值。
9. 绘制覆盖细胞大部分区域的感兴趣区域（ROI），并测量 YFPex - YFPem 和 CFPex - YFPem 堆叠中的最小强度。将测得的最小强度与步骤 4.6 中获得的背景强度相减，再将差值除以 2，由此获得一个初始的裁剪值估计。
10. 打开 Ratio Plus 插件。选择 YFPex - YFPem 和 CFPex - YFPem 堆叠。对于 FRET 比值，选择 CFPex - YFPem 作为堆叠 1；对于反向 FRET 比值（用于可视化磷酸化后 FRET 效率降低的探针），选择 YFPex - YFPem 作为堆叠 1。
11. 输入测得的背景强度和裁剪值。
12. 设置结果比值堆叠的缩放比例，并应用合适的查找表（LUT）以可视化比值变化。

5. 代表性结果

Plk1 的活性最早在 G2 期的细胞核中可见，并在有丝分裂期间达到峰值。图 3 展示了一项使用如第 2 节所述的最低光毒性条件进行的实验。请注意，这是一个代表性的初步结果，图像之间的曝光条件或时间间隔可进行调整，以提高信噪比或时间分辨率。图 3D 显示，大多数表达探针的细胞增殖时细胞周期时间为 20 至 25 小时，表明成像条件和探针表达水平不影响细胞周期时程。尽管存在明显的噪声，Plk1 活性在 G2 期上升并在有丝分裂期达到峰值的趋势仍清晰可见¹⁴（图 3A）。对原始数据进行处理，例如通过均值滤波以显影图形式呈现（图 3B），或对平均倒数比率进行定量分析（图 3C），可增强结果的清晰度。

图1. 基于FRET的探针监测激酶与磷酸酶活性的原理。两个荧光团（通常为CFP（蓝色）和YFP（绿色））通过一个磷酸结合结构域（橙色）和一个可磷酸化序列（黄色）连接。磷酸化（红色）介导与磷酸结合结构域的结合，从而诱导探针发生构象变化。该构象变化导致两个荧光团之间的距离或取向发生变化，进而影响CFP与YFP之间的FRET效率。FRET可通过激发CFP并检测YFP的发射信号（虚线）来观察。

图2. 实验流程示意图。

图 3. Plk1 活性在 G2 期的细胞核中首次可见，并在有丝分裂期间达到峰值。表达基于 FRET 的 Plk1 活性探针^9,14的 U2OS 细胞使用配备 20x NA 0.7 空气物镜和汞灯的 Deltavision Spectris 成像系统拍摄 60 小时。成像条件按照第 2 节所述，选择以引起最小光毒性，采用 4x 二项式合并（binning）及可阻挡 99% 入射光的中性密度滤光片。A，经过 4 次分裂的一个细胞的反向 FRET 比值的伪彩图像。B，对 A 中所示细胞应用均值滤波后的线状图（kymograph）。C，A 中所示细胞的反向 FRET 比值的定量分析。D，50 个表达 FRET 探针细胞的累计有丝分裂进入情况，包括子代细胞的分裂事件。

讨论

在整个细胞周期中监测FRET时，需要考虑一些因素，而这些因素在评估对外部刺激的短期反应时则不那么重要。首先，细胞周期进程容易受到应激信号通路的干扰，因此必须将光毒性降至最低。其次，所有报告分子都可能通过结合并消耗激酶、磷酸酶或相互作用结构域而影响细胞内的正常过程。评估实验条件是否合适的最直接方法，可能是测量从一次有丝分裂到下一次有丝分裂的细胞周期时长，并将其与不依赖荧光成像和探针表达的实验结果进行比较。

在整个细胞周期中监测FRET比率时，一个关键因素是抵制获取高分辨率精美图像的诱惑。尽管具体设置取决于显微镜系统的灵敏度以及特定探针的表达水平和性质，但重要的是使用刚好足以观察所需的最低 binning 水平。虽然 CFP激发–YFP发射 与 YFP激发–YFP发射 图像之间的时间应尽可能短，以避免细胞形态发生变化，但在实际操作中，最好将曝光时间保持在0.1秒以上，并通过中性密度滤光片降低荧光光源的强度。

光毒性对细胞周期的影响在很大程度上取决于探针的表达水平及其在细胞内的定位。例如，与组蛋白融合而定位于染色质的探针会使细胞对荧...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leibovitz L-15，不含酚红	GIBCO, by Life Technologies	21083-027
DMEM+Glutamax-I	GIBCO, by Life Technologies	31966
胎牛血清 (FBS)	Hyclone	SV30160.03
0.05% 胰蛋白酶 EDTA	Hyclone	SH30236.01
青霉素-链霉素	Hyclone	SV30010
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14287
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P8833