可通过荧光Ca2+指示剂来监测库容性Ca2+内流（SOCE）的程度。利用Mn2+淬灭此类指示剂的方法，可检测培养细胞和骨骼肌纤维中的SOCE。本文还描述了一种通过共聚焦成像技术对机械去膜肌纤维进行成像，以实现SOCE时空分辨率分析的技术。
本文内容
摘要
摘要
储存操纵性Ca2+内流（SOCE），早期称为电容性Ca2+内流，是一种严格调控的机制，介导细胞外Ca2+进入细胞内，以补充耗竭的内质网（ER）或肌浆网（SR）Ca2+储存1,2。由于Ca2+是一种普遍存在的第二信使，SOCE在多种细胞过程中发挥重要作用也就不足为奇，这些过程包括增殖、凋亡、基因转录和细胞运动。由于该通路几乎存在于所有细胞类型中，包括上皮细胞和骨骼肌细胞，因此受到广泛关注3,4。然而，不同细胞类型中SOCE特性的异质性及其生理功能仍不明确5-7。
通过膜片钳研究可以揭示SOCE的功能性通道特性，但由于基于荧光的细胞内Ca2+检测方法操作简便且适用于高通量筛选，目前关于该通路的大量知识均由此类方法获得。本报告的目的是总结几种基于荧光的方法，用于检测单层细胞、悬浮细胞和肌纤维中SOCE的激活5,8-10。其中最常用的方法是利用比率型Ca2+荧光探针Fura-2，在发射波长510 nm条件下，通过F340nm与F380nm的荧光强度比值直接监测细胞内Ca2+的动态变化。为了将单向SOCE活动与细胞内Ca2+释放及Ca2+外排过程区分开来，常采用Mn2+淬灭实验。已知Mn2+可通过SOCE进入细胞，但由于其与Fura-2具有极高的亲和力，无法被质膜上的外排机制排出，也不能被内质网上的Ca2+泵摄取。因此，细胞外Mn2+进入细胞后引起的Fura-2荧光淬灭可作为SOCE活性的测量指标9。比率荧光测定和Mn2+淬灭实验既可在基于比色皿的分光荧光仪上以细胞群体模式进行，也可在基于显微镜的系统中实现单细胞水平的可视化检测。单细胞检测的优势在于，可通过GFP或RFP报告基因筛选出经过基因操作的单个细胞，从而实现对基因修饰或突变细胞的研究。在结构特化的骨骼肌中，SOCE的时间-空间特性可通过去膜肌纤维实验获得，方法是同时监测两种低亲和力Ca2+指示剂在肌纤维特定区室中的荧光信号，例如将Fluo-5N靶向至肌浆网（SR），Rhod-5N靶向至横管系统9,11,12。
方案
1. 单个细胞内 Ca2+ 浓度的测定
- KYSE-150 是一种人食管鳞状细胞癌（ECSS）细胞系，在 37°C、5% CO2 条件下，使用含 5% 胎牛血清的 RPMI 1640/Ham's F-12 混合培养基（1:1）进行培养。
- 将含有特异性靶向 Orai1 的 shRNA 或随机序列的质粒转染至 KYSE-150 细胞中。这些质粒还包含一个编码红色荧光蛋白（RFP）的基因作为报告基因，该基因由独立的启动子驱动表达。
- 将细胞在玻璃底培养皿（No. 1.5 盖玻片，MatTek，MA）中培养 48 小时。
- 移除培养基，并用平衡盐溶液（BSS）（140 mM NaCl，2.8 mM KCl，2 mM CaCl2，2 mM MgCl2，10 mM HEPES，pH 7.2）清洗细胞。
- 向培养皿中加入 1 ml 含 2 μM Fura-2 乙酰甲酯（Molecular Probes）的 BSS 溶液，并用铝箔包裹整个培养皿以避光。
- 在 37°C 下孵育 40 分钟，随后在室温下继续放置 15 分钟，以完成酯键的水解反应。用 BSS 溶液清洗细胞两次。
- 将培养皿置于 Nikon TE200 倒置显微镜载物台上，该显微镜连接 PTI 荧光分光光度计，激发波长分别为 350 和 390 nm，发射波长为 510 nm。实际使用的激发波长可能因不同系统的光学特性而略有差异。通过扫描含有 0 至 39.8 μM（或更高至 Fura-2 荧光饱和浓度）Ca2+ 溶液中 Fura-2 盐的激发光谱，确定具有最佳比率动态响应的两个激发波长。
- 建立重力灌流系统，使用四种不同的 BSS 溶液：含 Ca2+（2 mM）、EGTA（0.5 mM）、EGTA-TG（毒胡萝卜素，5 μM）和 Ca2+-2-APB（一种 SOCE 抑制剂，75 μM）。也可使用计算机控制的自动灌流系统。
- 在可视化模式下选择表达 RFP 的细胞。
- 在 10 倍物镜放大下调整灌流系统出口端的位置，使管口以 45 度角正对目标区域上方。
- 同时记录荧光信号 F350nm 和 F390nm。比值（F350nm/F390nm）在第三个窗口中显示。按以下顺序切换灌流溶液：Ca2+；EGTA；Ca2+；EGTA-TG；Ca2+；Ca2+-2-APB。
上述方案可进行修改，用于测定细胞悬液系统中的细胞内 Ca2+。
- 在T25培养瓶中，以与上述相同的培养条件培养KYSE-150细胞。
- 当细胞达到 90% 汇合度时，移除培养基，并用 BSS 溶液冲洗细胞。
- 加入含有2.5 ml BSS溶液 2 μM Fura-2 AM 并将细胞在 37 °C 下孵育 40 分钟 37°C 随后进行去酯化。
- 移除BSS，向培养瓶中加入2.5 ml胰蛋白酶，并于37℃孵育 37°C 待细胞脱落，加入2.5 ml培养基终止消化，800 rpm离心5 min收集细胞。
- 用培养基再通过离心洗涤细胞一次，然后将细胞沉淀重悬于BSS溶液中（不添加2 mM CaCl₂）。2，含有 μM 钙离子浓度范围2+）并使用血球计数板对细胞数量进行计数。
- 加入约106 将细胞加入石英比色皿（10 mm，Starna Cells）中，并用BSS定容至2 ml。
- 将比色皿（内置磁力搅拌子）放入荧光分光光度计中。
- 同时记录荧光信号 F340 nm 和 F380 nm 发射波长为510 nm。运行程序为：BSS，添加 0.5 μl EGTA（0.25 M 储存液），添加 1 μl 毒胡萝卜素（thapsigargin，TG，10 mM 储存液），添加 4 μl Ca2+（1 M 储存液）
2. 培养细胞中的锰淬灭实验
- 对含不同 Ca 浓度的溶液中的 Fura-2 进行激发波长扫描2+ 浓度范围从 0 到 39.8 μM 以确定与钙离子浓度无关的波长作为等吸收点。通常，等吸收点位于或接近360 nm。
- KYSE-150 细胞在玻璃底培养皿中培养，并负载 Fura-2 AM。
- 设置灌注系统，使用5种不同的BSS溶液：Ca2+ （2 mM）、EGTA/TG（0.5 mM 和 5 μM，分别），Mn2+ （0.5 mM，不添加 EGTA 或 Ca2+，含有游离 Ca2+ 在 μM 范围），Mn2+2-APB75 μM)，EGTA/Triton X-100（0.1%）
- 将培养皿置于显微镜载物台上，选择激发波长为360 nm和390 nm、发射波长为510 nm的“激发比值”模式。
- 同时记录荧光信号 F360 nm 和 F390 nm 比率（F360 nm/390 nm）显示在第三个窗口中。正在运行的方案为：Ca2+ 1 分钟以稳定荧光，Mn2+ 30 秒，EGTA/TG 作用 10 分钟，Mn2+ 2分钟，EGTA-Triton X-100（0.1%）1分钟，以获得背景读数。Mn2+/2-APB 溶液可替代 Mn 使用2+ 以检测荧光猝灭的消失，这表明 Mn2+ 通过SOCE途径进入。
3. 肌肉细胞中的锰淬灭实验
- C2C12 是一种小鼠成肌细胞系，在含有 10% 胎牛血清和 10% 马血清的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO2 的环境下，在玻璃底培养皿中进行培养。
- 当细胞达到融合状态后，更换为分化培养基（去除胎牛血清，并将马血清浓度降至 2.5%）。C2C12 成肌细胞将在 4 天后分化为肌管。
- 按照 1.4–1.6 步骤所述，用终浓度为 5 μM 的 Fura-2 AM 对 C2C12 肌管进行负载。
- 加入终浓度为 20 μM 的 N-苄基-对甲苯磺酰胺（BTS），以抑制肌肉收缩及其引起的运动伪影，并在开始实验前孵育 15 分钟。
- 将培养皿置于连接 PTI 设备的显微镜载物台上，并向灌流系统中加入以下 BSS 溶液：含 2 mM Ca2+ 的溶液、无 Ca2+ 溶液、含 0.5 mM Mn2+ 的溶液；以及分别含 0.5 mM Mn2+ 和 20 μM TG 的溶液。
- 按照上述方法设置灌流系统。
- 同时记录荧光信号 F360nm 和 F390nm，并在第三个窗口中显示比值（F360nm/F390nm）。运行程序如下：先用含 2 mM Ca2+ 的溶液灌流 1 分钟，接着用无 Ca2+ 溶液灌流 1 分钟以清除 Ca2+，然后用含 Mn2+ 溶液灌流 0.5 分钟，再用含 Mn2+/TG 溶液灌流 10 分钟，最后使用含 0.1% Mn2+/EGTA-Triton X-100 的溶液。
4. 去膜肌纤维中时空分辨的SOCE
- 配制以下溶液。
等渗Tyrode缓冲液： 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, pH 7.2, 290 mosm
培养基： DMEM，含2%马血清和1%青霉素-链霉素
洗涤液#1： 109.6 mM K-谷氨酸盐, 2 mM EGTA-KOH, 6.7 mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM 磷酸肌酸（CP）, 20 mM N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸（BES）-KOH, pH 7.0
洗涤液#2： 140 mM K-谷氨酸盐, 5 mM EGTA-KOH, 6.5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7.0
去膜溶液： 140 mM K-谷氨酸盐, 6.5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7.0
横管（TT）加载溶液： 90.6 mM K-谷氨酸盐, 18 mM Na-谷氨酸盐, 0.55 mM CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6.7 mM MgCl2, 5.4 mM ATP, 15 mM CP, 0.0025 mg/ml 肌酸激酶（CK）, 20 mM BES-KOH, 5 μM 羰基氰化对三氟甲氧基苯腙（FCCP）, pH 7.0, pCa 7.0
肌浆网（SR）加载溶液： 107.8 mM K-谷氨酸盐, 0.98 mM CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6.6 mM MgCl2, 5.4 mM ATP, 15 mM CP, 0.0025 mg/ml CK, 20 mM BES-KOH, 5 μM FCCP, pH 7.0, pCa 6.6
肌浆网（SR）耗竭溶液： 100 mM K-谷氨酸盐, 40 mM Na-谷氨酸盐, 10 mM EGTA-KOH, 10 mM 1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸（BAPTA）, 0.35 mM MgCl2, 0.5 mM ATP, 1 mM CP, 20 mM BES-KOH, 5 μM FCCP, pH 7.0。实验前加入25 mM 咖啡因/20 μM 毒胡萝卜素（TG）。 - 为分离趾长伸肌（Extensor digitorum longus, EDL），先将小鼠仰卧固定，腿部置于侧位，从踝部至膝部去除皮肤，切开浅层肌肉组织以暴露EDL，切断其上下两端的肌腱以完整取出EDL肌肉；操作中应尽可能保留较长的肌腱。将EDL转移至含0 Ca2+ 和0.1 mM EGTA的Tyrode溶液中，以防止任何收缩发生。
- 在体视显微镜下，使用两把镊子夹住下端止点肌腱，将EDL肌肉分成两个肌束。重复此过程，获得4个，然后8个肌束。关键是在整个操作结束时，每个8个肌束均需保留肌腱。若部分肌束丢失肌腱，则应弃用。
- 在体视显微镜下，将每个EDL肌束的两端肌腱夹住并小心拉伸，直至形成3~4根完整保留两端肌腱的单根肌纤维。
- 在玻璃底培养皿中央滴加一滴无Ca2+ Tyrode缓冲液，将EDL肌条平直放置于皿中，迅速尽可能吸除多余液体，然后使用防水胶带固定两端肌腱，并确保胶带绷紧。先用无Ca2+溶液洗涤一次，再用含2.5 mM Ca2+的溶液洗涤两次。若肌纤维出现过度收缩或损伤迹象，应弃用。
- 如需进行遗传操作，肌纤维可培养长达96小时。用完全培养基洗涤肌纤维三次，加入2 ml培养基，置于5% CO2、37°C培养箱中。每次实验前，检查肌纤维状态，弃用无清晰横纹、有污染迹象或出现损伤（如肌膜收缩）的纤维。良好的肌纤维应对KCl、电刺激和咖啡因刺激产生反应。
- 单根肌纤维用洗涤液#1洗涤三次，然后浸入含500 μM Rhod-5N和0.5 mM Ca2+的类细胞内去膜溶液中，孵育5分钟。
- 使用连接于针夹持器的钨针，在体视显微镜下对肌纤维进行机械去膜，使横管（TT）自动重新封闭，从而将与Ca2+结合的Rhod-5N封入横管内。去膜后，用洗涤液#2洗涤两次。机械去膜过程中，去除的细胞宽度应小于25%，以达到最佳效果。
- 为加载肌浆网（SR），将去膜肌纤维在室温下用含20 μM Fluo-5N AM的去膜溶液孵育1小时，随后用洗涤液#2充分洗涤，并继续孵育30分钟，以确保染料完全去酯化。
- 30分钟后，在共聚焦显微镜下使用60倍物镜观察去膜肌纤维。采集相应染料的荧光图像（Rhod-5N：激发波长543 nm，发射波长>570 nm；Fluo-5N：激发波长488 nm，发射波长530–560 nm）。为每种染料标记的区域选择感兴趣区域（ROIs）。
- 实验流程如下：先用TT加载溶液孵育120秒，再用SR加载溶液孵育120秒，最后用SR耗竭溶液孵育400–750秒以耗尽肌浆网Ca2+储存。在此过程中，记录Rhod-5N荧光强度变化（反映横管Ca2+）和Fluo-5N荧光强度变化（反映肌浆网Ca2+），从而获得横管和肌浆网相对荧光强度随时间变化的曲线。对多根肌纤维的平均荧光强度进行进一步分析，并将TT/SR加载结束时的最大荧光强度归一化为100%。
5. 典型结果
我们通过细胞内 Ca2+ 测定检测了 KYSE-150 细胞中的 SOCE 活性（图 2）。利用 RFP 作为报告基因，我们可以筛选出转染了含有针对 orai1 基因的特异性 shRNA 质粒的单个细胞，该基因编码 SOCE 通道。与转染了含乱序 shRNA 质粒的细胞（黑色轨迹）相比，Orai1 蛋白的敲低导致 SOCE 活性降低（红色轨迹）。
使用Mn2+淬灭实验也证实了KYSE-150细胞中的SOCE（图3）。360 nm的激发波长对应Fura-2的等吸收点，在该波长下荧光强度不受Ca2+浓度影响。在TG完全耗竭内质网Ca2+储存后，灌注Mn2+导致荧光显著下降。SOCE的整体活性可通过Fura-2荧光强度下降速率来衡量，斜率越陡表明SOCE活性越高，而斜率越平缓则表明SOCE活性越低。经2-APB处理的细胞中，荧光下降的斜率明显更为平缓，表明该化合物抑制了SOCE活性。Mn2+淬灭速率由前10秒的记录数据确定，此时淬灭过程仍处于线性范围，尚未达到饱和。
在肌肉组织中也进行了类似的Mn2+淬灭实验（图4）。在此实验中，Mn2+与TG同时施加。当TG耗竭肌浆网（SR）中的Ca2+储存时，荧光淬灭的斜率逐渐变化，直至达到最大速率。该S形曲线表明在此实验条件下，SOCE呈梯度激活。
培养条件下健康的完整单根肌纤维显示出清晰且均匀的横纹，无污染迹象，也无收缩诱导的损伤迹象。这些纤维能够对电刺激或去极化溶液产生收缩反应。在共聚焦成像下，去膜纤维中Rhod-5N染料在横管（TT）区室的滞留呈现出典型的哺乳动物双峰模式（在红色通道中可见）。在用Fluo-5N AM负载肌浆网（SR）后，典型的点状SR分布模式可见（在绿色通道中）。当用TT/SR负载溶液灌流去膜纤维时，Rhod-5N和Fluo-5N的荧光强度均增加；当用SR耗竭溶液灌流时，SR区室和TT区室的荧光水平开始下降，分别表明SR Ca2+ 储存库耗竭与SOCE激活之间存在紧密偶联（图5）。
图1. 钙库操纵性Ca2+ 进入（SOCE）。 Orai1 是一种位于质膜（PM）上的通道孔形成亚基，而 STIM1 是一种 Ca2+ 传感器位于内质网或肌浆网（ER/SR）膜上。当ER/SR中的Ca2+ 由于内质网/肌浆网钙离子通道被阻断，导致钙库减少2+ 泵（SERCA）或Ca2+ 通过免疫沉淀释放3 受体或兰尼碱受体激活后，STIM1被激活。活化的STIM1分子形成簇状结构，诱导Orai1聚集，进而导致SOCE的激活。
图 2. KYSE-150 细胞内 Ca2+ 的测定。 将细胞外溶液从无 Ca2+（含 0.5 mM EGTA）更换为含 2 mM Ca2+ 的溶液，未引起细胞内 Ca2+ 的任何变化。在无 Ca2+ 灌流液中加入 5 μM TG 可诱导内质网被动释放 Ca2+。当内质网 Ca2+ 储存耗竭（>10 分钟）后，加入细胞外 Ca2+（2 mM）通过 SOCE 途径引发持续性的细胞内 Ca2+ 升高，该过程可被 SOCE 抑制剂（如 skf-96365 和 2-APB）阻断（数据未显示）。转染含有针对 orai1 的特异性 shRNA 质粒的细胞（红色曲线）表现出显著低于转染随机序列（黑色曲线）细胞的 SOCE 水平。
图3. KYSE-150细胞中SOCE的Mn2+淬灭实验。 在Fura-2的Ca2+非依赖性激发波长（360 nm）下检测Mn2+（0.5 mM）对Fura-2荧光的淬灭作用。细胞经5 μM TG处理10分钟，以完全耗尽内质网Ca2+储存。加入Mn2+后Fura-2荧光衰减速率（虚线，前10秒内）代表SOCE的激活程度，以单位时间内荧光强度的百分比下降表示（初始值设为100%）。实验结束时通过添加0.1% Triton X-100裂解细胞，获得荧光信号的最小值（定义为0%）。经2-APB（75 μM）处理的细胞显示出更平缓的衰减斜率，表明该化合物可阻断KYSE-150细胞中的SOCE。
图 4. 通过 Mn2+ 淬灭实验揭示肌细胞中 SOCE 的梯度激活。 在 TG 耗竭肌浆网（SR）Ca2+ 储存的同时，可记录到 SOCE 的激活。同时加入 Mn2+（0.5 mM）和 TG（20 μM）后，细胞内 Fura-2 荧光呈梯度且呈S形下降（青色虚线表示最快淬灭点），与初始 Mn2+ 淬灭速率（蓝色虚线）明显不同。在经 2-APB（75 μM）处理的细胞中，Mn2+ 淬灭斜率几乎与基础水平相同，表明 SOCE 被抑制。
图 5. 剥离肌纤维中时空分辨的钙库操纵性钙内流（SOCE）。(A) 将 Rhod-5N 盐负载至横管（TT），将 Fluo-5N AM 负载至肌浆网（SR）。(B) 施加 Ca2+ 耗竭溶液后，TT 和 SR 区室中的荧光均下降。Fluo-5N 荧光的减弱表明肌浆网 Ca2+ 含量快速释放，而 Rhod-5N 荧光的减弱提示 SOCE 的激活。
讨论
尽管Fura-2在结合Ca2+和游离Ca2+状态下的激发波长分别为340 nm和380 nm，但在特定显微镜系统中，Fura-2用于Ca2+浓度测定的最佳比率动态范围可能出现在其他波长处。这种波长的偏移通常是由于添加各种光学元件后光路发生变化所致。在本研究中，通过进行Fura-2荧光的光谱分析，确定其激发波长为350 nm和390 nm。
细胞质内 Ca2+ 浓度水平由多种来源共同调节，包括细胞内 Ca2+ 释放、细胞外 Ca2+ 内流，以及内质网和质膜上的 Ca2+ 排除机制。为了将 SOC 介导的单向 Ca2+ 内流与细胞内 Ca2+ 释放及 Ca2+ 外排过程区分开来，可采用 Mn2+ 淬灭实验。已知 Mn2+ 可通过 SOCE 途径进入细胞，但不会被质膜上的外排机制或内质网 Ca2+ 泵摄取。因此，荧光淬灭程度可反映 Mn2+ 单向流入细胞的情况，从而估算 SOCE 的激活程度。Mn2+ 淬灭实验应在等吸收点（isosbestic point）波长下进行，在该波长下，Fura-2 的荧光强度不受 Ca2+ 浓度影响。每个系统的等吸收点应通过光谱扫描确定。或者，也可通过调节任意两个波长下的荧光信号，使最终计算值不受 Ca2+ 浓度影响，从而记录 Mn2+ 淬灭过程13。
为了获取骨骼肌中SOCE活性的空间和时间信息，我们采用了一种双染料方法，可在剥离的成年哺乳动物EDL肌纤维中同时测量SOCE活性和肌浆网（SR）Ca2+含量。通过绘制SR Ca2+含量变化与SOCE活性之间的相关性，可以揭示SOCE对SR Ca2+储存耗竭的激活阈值和敏感性。T管加载液经过优化，可将Ca2+额外加载至横管系统（T-tubules），并用于横管系统的预处理；而SR加载液则设计用于促进SR最大程度地加载Ca2+，并同时将约500 μM的Ca2+额外加载至横管系统。在T管/SR加载液及SR耗竭液中均添加了FCCP，以消除线粒体带来的影响。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢诺亚·韦斯莱德博士（Dr. Noah Weisleder）对本文稿的审阅与编辑。本研究由新泽西医科大学基金会研究资助项目（UMDNJ Foundation 62-09）资助，项目负责人：ZP；美国心脏协会学者发展奖（SDG2630086）资助，项目负责人：XZ；美国心脏协会资助项目（0535555N）资助，项目负责人：MB；以及美国国立卫生研究院（National Institutes of Health RC2AR058962-01）资助，项目负责人：MB。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Mediatech | 10-040-CV | |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | |
| 玻璃底培养皿 | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Fura-2 AM | 英吉特（Molecular Probes） | F1221 | -20 °C，密封，避光，溶于DMSO |
| Fluo-5N AM | Invitrogen（Molecular Probes） | F14204 | -20 °C，密封，避光保存 |
| Rhod-5N | 英杰公司（分子探针） | R14207 | -20 °C，密封，避光保存 |
| 石英比色皿 | Starna 细胞 | 3-Q-10 | |
| 毒胡萝卜素 | Tocris | 1138 | |
| 2-氨基–2-氨基苯基硼酸（2-APB） | Tocris | 1224 | |
| N-苄基对甲苯磺酰胺（BTS） | Sigma-Aldrich | 435600 | |
| I型胶原酶 | Sigma | C0130 | |
设备： | |||
|
参考文献
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