细胞在科研以及新疗法的发现与开发中发挥着关键且日益重要的作用。随着对细胞数量需求的不断增长，我们需要更高效、更有效的方法来培养和收获贴壁依赖性细胞。具有合适特性的多层培养瓶可满足这一需求。
本文内容
摘要
摘要
越来越多的细胞相关应用需要大量细胞。在小规模扩增过程中，单层T形培养瓶的使用是可行的，但当需要大量细胞时，使用单层T形培养瓶可能变得繁琐、费力且耗时。为满足这一需求，本文将讨论一种新型多层细胞培养容器的性能，该容器可方便地将细胞从小规模单层T形培养瓶中进行放大培养。测试的培养瓶有3层和5层两种规格，与T-175培养瓶相比，分别能够培养并完全回收3倍和5倍数量的细胞。BD Multi-Flask的一个关键特性是配备了一个混合/平衡口，可在容器内部实现快速混合，并使细胞和试剂在每一层内部以及各层之间均匀分布，从而稳定地获得可在与T-175培养瓶相似的环境中培养的细胞。
这些多孔培养瓶的设计还便于使用移液器直接向瓶内添加试剂和细胞，同时能够高效回收珍贵的细胞和试剂，并降低因倾倒操作带来的污染风险。对于倾向于采用倾倒方式而非移液操作的应用场景，该设计可最大限度减少残留液体的滞留，从而降低珍贵细胞和试剂的浪费。
方案
1. 使用多层培养瓶进行细胞培养的实验方案
- 血管的制备与细胞悬液的添加
- 根据需要配制细胞培养基。
- 将多联培养瓶垂直侧放于工作台面（无菌超净台）上，瓶盖朝上。
- 这些培养瓶有3层和5层两种规格，其操作流程与T-175培养瓶相似。
- 松开并取下瓶盖。使用50或100 mL移液器或直接倾倒，向瓶中加入所需体积的预热培养基。
- 容量小于等于10 ml的移液器可在Multi-Flask垂直放置且瓶盖朝上时触及容器底部。容量大于等于10 ml的移液器可越过Multi-Flask上的标识区域进入容器内部，从而为向容器中添加较大量的培养基提供便捷通道.
- 为避免培养基产生气泡，应使液体沿培养瓶盖内壁（有标识的一侧）流下。
- 使用10 mL移液管将浓缩细胞储备液中的细胞悬液通过上层加入培养基中，并盖紧瓶盖。
提示：
- 将多个培养瓶置于推车上运送至培养箱位置，并完成后续步骤。
- 接种细胞密度将根据细胞类型、培养基种类和培养时间而变化。初始接种密度和培养基体积可参照标准T-175培养瓶的使用参数，并根据所用多层培养瓶的规格乘以3或5。
- 细胞混合
- 混合位置： 将多功能烧瓶直立放置，使标签朝向您，逆时针旋转至45°角，使混合口朝向您。
- 保持相同角度，轻轻将多层烧瓶从前向后倾斜（瓶口朝向远离您的方向），直至顶层液体完全通过混液口向下排净。以混液口一侧为支点转动。
- 同样，轻轻前后摇动多层培养瓶（瓶口朝向操作者），使培养基通过混合口从底层完全流向上层。重复步骤1.2.2和1.2.3一次，以确保充分混合。
- 将多瓶装置移回混合位置（步骤 1.2.1），然后进入步骤 1.3
- 或者，可从多层培养瓶外部制备细胞悬液，并使用移液管或轻柔倾倒的方式将细胞悬液加入容器中。
- 混合端口可实现容器内细胞与培养基的混合，避免了在外部分批制备大量细胞悬液的需要.
- 它还允许培养基在多层培养瓶的各层之间均匀分布。
- 流体平衡
- 加入细胞悬液后，将多层培养瓶垂直放置于平坦的工作台面上，以使各层中的液体体积均匀分布。
- 将液体分层分配至各层
- 手持多层烧瓶，使标志朝向自己，顺时针旋转至45°角，以将液体分配至各层。
提示：
为获得最佳效果，步骤1.3至1.4应使用平整的工作台面
- 手持多层烧瓶，使标志朝向自己，顺时针旋转至45°角，以将液体分配至各层。
- 运输
- 将含有细胞悬液的培养基分装后，以与步骤1.4.1相同的角度（顺时针45°）转运Multi-Flask，确保培养基远离混合口，并将其放入培养箱中。此位置同样适用于从培养箱中取出培养瓶后在显微镜下观察。
- 将多瓶架放入培养箱搁板
- 将多瓶培养装置以45°角（顺时针方向，远离混合口一侧）握住，轻轻绕远离混合口的边角为支点，水平旋转并放置于培养箱表面。放置时确保多瓶培养装置的标识面朝上。
- Falcon 多层培养瓶的设计允许容器堆叠，并通过坚固的堆叠肋固定位置.
- 将多瓶培养装置以45°角（顺时针方向，远离混合口一侧）握住，轻轻绕远离混合口的边角为支点，水平旋转并放置于培养箱表面。放置时确保多瓶培养装置的标识面朝上。
- 细胞与试剂的分布
- 将多层培养瓶平放于工作台面后，轻轻前后左右摇晃，使细胞均匀分布于各层培养表面，注意避免液体溢出。随后叠放培养瓶。
- 该培养瓶由光学透明材料制成，可在显微镜下清晰观察最外层的细胞.
- 将多层培养瓶平放于工作台面后，轻轻前后左右摇晃，使细胞均匀分布于各层培养表面，注意避免液体溢出。随后叠放培养瓶。
- 培养基更换
- 吸液时将多口瓶向左侧（混合端口侧）倾斜，瓶身标签朝向操作者。
- 然后将多瓶装置向右倾斜，继续吸除所有残留的培养基。
- 加入适量培养基，并按照步骤操作 1.3-1.7
2. 从多层培养瓶中收获细胞
- 为解离细胞，将多层培养瓶垂直排列，并将每个培养瓶置于混合位置（步骤 1.2.1）。轻柔翻转培养瓶，使瓶口朝向操作者，使培养基流入多层培养瓶的顶层。
- 将5或10 mL吸头插入瓶口，直至到达混合口附近的液面，吸除废弃培养基。
- 加入解离试剂/洗涤缓冲液，并如步骤1.2.1所述将培养瓶置于混合位置，然后继续执行步骤1.3–1.7。用完全培养基/中和试剂中和后，将细胞悬液倒入接收管中；或者翻转培养瓶，使细胞流入容器的顶层，再用10 mL移液器收集细胞。
提示：为提高细胞或试剂的回收率，将多层培养瓶置于混合位置（步骤 1.2.1），翻转使瓶口朝向操作者，使各层中的培养基完全流入顶层。然后，在保持培养瓶倒置的状态下，顺时针倾斜培养瓶至45°角（远离混合口方向），使用1–10 mL移液器收集残留试剂。
3. Falcon 多层培养瓶的推荐工作体积
培养基
三层：每个多功能培养瓶 75-150 mL
五层：每个多功能培养瓶 125-250 mL
解离试剂
三层：每个多重培养瓶≥15 mL
五层：每个多重培养瓶≥25 mL
提示：从标准T-175培养瓶所用的培养基体积开始，根据所评估的多层培养瓶规格乘以3或5倍，以保持每单位表面积的毫升数相同。
4. 代表性结果：
1. Falcon 多层培养瓶的设计
图1.多瓶细胞培养容器提供3层和5层可堆叠型号，用于细胞扩增，培养面积分别为525 cm²和875 cm²2 生长表面积。移液操作便于向容器内添加或从中移除细胞和试剂。混合端口的设计可实现容器内快速混合，并使多层培养瓶各层之间的培养基迅速均一化。
2. 使用多层培养瓶的细胞产量：
这些培养容器有3层和5层两种规格，其表面积分别为T-175培养瓶的3倍和5倍。因此，与T-175培养瓶（43.2 ± 3.5 × 106 个细胞；图2A）相比，Multi-Flask培养容器中培养并收获的BHK-21（幼年仓鼠肾细胞）细胞数量分别达到≥3倍和5倍（分别为130 ± 6.8 × 106 和218 ± 23.6 × 106 个细胞）。在推荐的生长培养基（ATCC、Sigma和/或Clontech公司建议，每层35 ml）中培养48–96小时后，BHK-21、LnCAP（人前列腺腺癌细胞系）、Hep-G2（人肝癌细胞系）和EcoPack 2-293（人肾细胞系）在3层和5层Multi-Flask以及T-175培养瓶中单位表面积的细胞产量相当（图2B）。细胞计数使用自动Vi-CELL计数仪进行(1)。
图 2A： 与 T-175 烧瓶相比，从 3 层和 5 层多层烧瓶中培养并收获的 BHK-21 细胞数量分别为其 3 倍和 5 倍。预期产量是通过将对照组 T-175 烧瓶的平均细胞产量分别乘以 3 和 5 倍来确定的（每种规格 n=4 个烧瓶）。
图 2B：BHK-21、LnCAP、HepG2 和 EcoPack2-293 细胞在 3 层和 5 层多层培养瓶与 T-175 培养瓶中的每 cm2 细胞产量相当。每根柱代表 4 至 6 个培养瓶的平均值。BHK-21 细胞（11,000 个细胞/cm²）培养 72 小时，LnCAP 细胞（20,000 个细胞/cm²）和 EcoPack2-293 细胞（˜35,000 个细胞/cm²）培养 96 小时，HepG2 细胞（25,000 个细胞/cm2）在收获前培养 48 小时。
3. 多层烧瓶中培养基在各层间的分布
向5层多层培养瓶（250 mL/5层容器）中加入细胞培养基（DMEM；Invitrogen），并按照上述方案将其分配至各层。通过在每一层上钻孔并从各层单独泵出培养基来测量培养基的分布情况。从每层回收液体的重量显示各层之间相对均匀，如图3所示。具体数值如下：51.8 ± 0.73、50.3 ± 0.58、50.21 ± 0.13、49.88 ± 0.35、49.45 ± 0.37（gm）。
图3. 5层多层烧瓶中每层培养基的均匀分布。向多层烧瓶（250 ml/5层容器）中加入细胞培养基，平衡后分配至各独立层。通过在各层钻孔将培养基泵出，并记录每层液体的重量（n=6个烧瓶）。
4. 多层培养瓶中细胞在各层间的分布
可在多层培养瓶（Multi-Flask）中加入并混合细胞。我们使用与细胞大小相近的微珠（10μm；PolySciences Inc.）模拟细胞在多层培养瓶各层之间的分布情况。通过10 mL移液器将微珠悬浮液从顶层加入多层培养瓶容器中，并按照上述方案所述与容器中的培养基混合。通过在每一层上钻孔，将含有微珠悬浮液的液体从各层单独抽出并测定微珠分布。从每层回收的微珠浓度使用库尔特计数仪（Coulter Counter）测定并记录。下图显示了三层多层培养瓶中各层间等量的微珠分布情况（图4A）。混合口（mix-port）可实现细胞和试剂在多层培养瓶各层之间的均匀分布。
图 4A： 三层多层烧瓶各层中微珠的分布情况。将微珠悬液（3.6 × 106/ml）加入已装有培养基的多层烧瓶中（微珠悬液体积与培养基体积比为 1:10），混匀后，按照所述方案进行平衡和分层操作。通过 Coulter 计数器测定并记录从每层回收的微珠浓度（培养基经由各层钻孔泵出）。下图显示了 5 个三层多层烧瓶中各层间相似的微珠分布情况（n = 5 个烧瓶）
下图显示了在补充生长培养基中培养至>80% 汇合度的细胞在三层多层培养瓶（Multi-Flask）中的Ecopack 2-293染色模式的代表性图像。细胞单层经结晶紫固定染色后，将多层培养瓶各层切下并进行图像扫描(2)。注意，多层培养瓶所有层上的细胞分布均一（图4B）。在多种细胞类型中均获得类似结果（数据未显示）。
图4B： 本图展示了多层培养瓶各层之间均一的细胞生长情况。在三层多层培养瓶和T-175培养瓶中培养至>80%融合度的Ecopack-2-293细胞经固定后用结晶紫染色。多层培养瓶容器被切开，每层染色后的部分均进行扫描。
5. 多瓶装置中的空气供应：
使用BioProfile FLEX分析仪(3,4)（Nova Biomedical）对EcoPack2-293细胞培养96小时后的用后培养基进行分析，结果显示，在5层多层培养瓶与T-175培养瓶中培养的细胞其氧气饱和度无显著差异（81.03 ± 1.9 vs. 83.4 ± 5.8 %环境O2）。
图 5： 使用预混培养基的5层Multi-Flask与T-175培养瓶中，耗尽培养基的空气饱和度（%环境O2）相似。EcoPack2-293细胞以35,000个细胞/cm2的密度接种，并在培养96小时后进行培养基分析（n=3个培养瓶）。
讨论
本研究展示了多瓶设计为研究人员带来的生产力提升。在使用多瓶时，虽然遵循上述步骤对于实现最佳性能至关重要，但本方案中有几个关键步骤被认为最为重要。这些步骤包括：（i）通过容器内的混匀口混合细胞和试剂；（ii）在将液体分配至各层后，以顺时针方向将多瓶倾斜45°进行转移；（iii）液体分配完成后，将多瓶平放于培养箱中。
正确使用多瓶培养系统可使每个培养容器中产生均一的细胞群体，其培养环境与T-175培养瓶相一致 (5)这些培养容器在与T-175培养瓶相似的占用空间下，可分别提供3倍和5倍的细胞数量。3层和5层容器的培养面积分别为525 cm²和875 cm²。2 生长面积，分别为用户节省了空间和劳动力。组织培养表面处理与标准培养瓶相当，因此可在无需重新优化现有培养条件的情况下实现放大，同时不牺牲细胞的质量、均一性或性能 (6, 7)这也有利于与先前收集的数据进行比较。这些器皿还可包被胶原蛋白、纤连蛋白、多聚-D-赖氨酸等试剂，为某些细胞类型（如肝细胞）的贴附、生长和分化提供特化的基质。8角质形成细胞9，无血清培养基配方中培养的干细胞。包被溶液可被去除且残留液体极少，从而减少珍贵试剂的浪费，并在细胞培养前有效去除包被溶液。推荐用于多层培养瓶细胞培养的最适培养基体积范围为 0.142–0.287 ml/cm2 相当于每层25-50 ml。与其它多层培养瓶不同，该产品在瓶体内设有混合口，可在瓶内快速混合，并实现细胞和试剂在每层内部及各层之间的均匀分布。多种细胞系、原代培养细胞和干细胞均已通过Multi-Flask高效扩增。这些培养容器在需要大量细胞的应用中尤为有利，例如高通量筛选、疫苗生产、病毒载体转染以及细胞治疗。
在时间、空间、人力以及减少废弃物产生方面的节约，是多层培养瓶相较于传统单层容器培养的主要优势。使用3个5层多层培养瓶，在相同空间内可培养的细胞数量约为5个T-175培养瓶收获细胞数的三倍。这种空间节省的优势不仅限于T-175培养瓶，还可推广至其他容器：标准滚瓶装置可置于常规实验室培养箱中，容纳 ˜4个滚瓶（2200 ml），每个提供850 cm²培养面积2 表面积。在同一区域， ˜20个5层多层培养瓶可提供五倍于普通培养瓶的细胞培养表面积。此外，随着“绿色行动”意识的增强，减少废弃物产生的方案备受青睐。在这方面，与使用5个T-175培养瓶相比，废弃物重量减少了38%（5个T-175培养瓶的重量为 ˜640克，而一个5层的多层培养瓶重量为 ˜ 与T-175培养瓶相比，使用Multi-Flasks可减少400g废弃物产生，这些优势可降低废弃物储存和处理成本，为用户带来经济效益。
披露
所有作者均为BD公司生物科学部门发现实验室耗材单元的员工。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3层组织培养处理 525cm2 | BD Biosciences | 353143 | |
| 5层组织培养处理 875cm2 | BD Biosciences | 353144 | |
| 100 ml 移液管 | BD Biosciences | 357600 | |
| 10 ml 移液管 | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml 吸液移液管 | BD Biosciences | 357501 | |
| 50 ml 聚丙烯锥形管 | BD Biosciences | 352070 | |
| T-175 培养瓶（组织培养处理） | BD Biosciences | 353028 | |
| 结晶紫染料 | BD Biosciences | 212525 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| GMEM | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| MEM | ATCC | 30-2003 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 16000-044 | |
| 胰蛋白胨磷酸盐肉汤 | Sigma-Aldrich | T8159 | |
| BHK-21 细胞 | Sigma-Aldrich | 85011433 | |
| Hep-G2, LnCAP | ATCC | ||
| Ecopack 2-293 | Clontech Laboratories | ||
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 聚苯乙烯微球 | Polysciences, Inc. | 24628-20 | |
| Bio-Profile Flex 分析仪 | Nova BioMedical |
参考文献
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