通过活细胞成像和可裂解荧光染料底物监测永生化少突胶质细胞在钾离子诱导膜去极化后的活化半胱天冬酶-3活性及细胞凋亡 活化半胱天冬酶-3, 细胞凋亡, 永生化少突胶质细胞, 活细胞成像, 可裂解荧光底物, 膜去极化

摘要

利用 NucView 488 caspase-3 底物对永生化 N19-少突胶质细胞培养物中 caspase-3 介导的细胞凋亡进行活细胞成像。该技术适用于多种细胞类型和组织中的程序性细胞死亡实时检测。

摘要

中枢神经系统可能经历多种应激和神经损伤，这些因素可导致多种不利影响，最终引起神经元数量减少和功能下降。受损的轴突可将兴奋性分子（如钾离子或谷氨酸）释放到细胞外基质中，进而对支持性胶质细胞（包括星形胶质细胞和少突胶质细胞）造成进一步的损伤和伤害^{8, 16}。如果损伤持续存在，细胞将发生程序性细胞死亡（凋亡），这一过程由多个已明确的信号转导级联通路进行调控和激活¹⁴。在创伤性脑损伤、脑缺血和癫痫发作后，均可出现细胞凋亡和组织坏死。经典的凋亡调控因子是半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶家族，即caspases。已被激活的蛋白酶（如caspases）还被发现参与了阿尔茨海默病、亨廷顿病和多发性硬化等慢性神经退行性疾病中的细胞死亡过程^{4, 14, 3, 11, 7}。

在本实验方案中，我们描述了使用NucView 488 caspase-3底物来检测永生化N19-少突胶质细胞（OLG）培养物中caspase-3介导的细胞凋亡速率^{15, 5}，这些细胞在暴露于不同细胞外应激因素（如高浓度钾离子或谷氨酸）后发生凋亡。条件性永生化的N19-OLG细胞系（代表O2A前体细胞）由Anthony Campagnoni博士（加州大学洛杉矶分校神经科学Semel研究所）提供^{15, 5}，此前已被用于研究髓鞘基因表达的分子机制以及导致少突胶质细胞分化的信号转导通路（例如^{6, 10}）。我们发现该细胞系在转染外源性髓鞘碱性蛋白（MBP）构建体（与RFP或GFP，即红色或绿色荧光蛋白融合）方面具有良好的稳定性^{13, 12}。在本实验中，N19-OLG细胞培养物分别用80 mM氯化钾或100 mM谷氨酸钠处理，以模拟轴突内容物泄漏至细胞外基质从而诱导细胞凋亡⁹。我们使用了一种双功能caspase-3底物，其包含一个DEVD（Asp-Glu-Val-Asp）caspase-3识别亚单位和一个DNA结合染料²。该底物可快速进入细胞质，并被细胞内的caspase-3切割。染料NucView 488被释放后进入细胞核，与DNA结合并在488 nm处发出绿色荧光，从而标记细胞凋亡的发生。使用NucView 488 caspase-3底物可实现对活细胞的实时成像^{1, 10}。在本视频中，我们还介绍了永生化N19-OLG细胞的培养与转染方法，以及活细胞成像技术。

方案

1. 解冻与培养细胞

1. 从长期液氮储存中获取冻存的永生化 N19-少突胶质细胞株。
2. 将含有细胞的冻存管浸入 37 °C 水浴中，直至细胞悬液完全解冻。
3. 向一个 10 cm 培养皿中加入 7 mL 高糖 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基），并添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素。
4. 将细胞悬液逐滴加入培养皿中，并轻轻晃动和摇动培养皿，使细胞均匀分散。
5. 将细胞置于 34 °C、5% CO₂ 的培养箱中进行培养。
6. 4 小时后，吸除培养皿中的培养基，以去除用作冷冻保护剂的残留 DMSO（二甲基亚砜），并更换为新鲜培养基（7 mL 高糖 DMEM 培养基，添加 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素）。

2. 细胞传代

1. 当细胞生长至70-80%融合度（培养4-7天）时，吸除培养基。
2. 向培养板中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，用移液器吹打使细胞脱落（约5分钟）。
3. 根据实验条件进行相应稀释，并以不低于0.1 × 10⁶ 个细胞/mL的细胞密度传代接种另一块10 cm培养板，用于后续实验。

注意： 细胞复苏后，应在用于实验前至少传代两次。

3. 细胞计数与接种

1. 进行活细胞成像的细胞接种时，按先前所述方法进行胰酶消化。
2. 取约 30 μL 细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。
3. 将未包被的玻璃盖玻片放入 6 孔板中。每孔加入 2 mL 无酚红高糖 DMEM 培养基，其中含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素，细胞接种密度为 0.1 × 10⁶ 个细胞/mL，在 34 °C、5% CO₂ 条件下培养。
4. 转染前，在 34 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞过夜（16–20 小时）。

4. 转染

1. 将100 μL无血清培养基、0.5–4 μg纯化的质粒DNA和4 μL FuGENE HD（Roche）混合。轻轻涡旋混匀。
2. 再次短暂涡旋，室温孵育5分钟使DNA形成复合物，然后将FuGENE HD-DNA混合物直接加入培养的细胞中。轻轻倾斜培养板以混匀。
3. 在处理或进行实验前，将细胞在34 °C、5% CO₂条件下继续培养48小时。

5. 活细胞成像（LCI）的细胞准备

1. 在开始实验前至少1小时打开LCI Chamlide活细胞成像系统控制箱。该控制箱还可调节LCI Chamlide内的温度和湿度，并控制预混5% CO₂气体的流速。

注意： 建议在开始实验前最多提前 3 小时打开控制箱，以确保整个载物台达到 34 °C。此步骤可减少成像过程中因金属载物台受热导致的流动和热膨胀所引起 的焦平面漂移。

2. 在超净工作台内，用70%乙醇喷洒Chamlide磁性培养室和镊子，并静置5分钟使其干燥。
3. 从培养箱中取出细胞，确认细胞状态良好。健康的细胞应贴附在玻璃盖玻片上，形态铺展充分，具有丰富的膜突起。因转染而受到应激的细胞不适合进行实验，这类细胞的突起数量减少，细胞核常呈不规则形状。
4. 倾斜6孔板，用镊子取出盖玻片，迅速将细胞面朝上放入培养室的底板中。注意避免盖玻片干燥。
5. 将培养室的磁性主体部分安装到位，并从原6孔板中吸取500 μL培养基，加至盖玻片表面。重复使用该培养基可减少因环境变化对细胞造成的应激，同时也有助于评估细胞外分泌因子。
6. 将玻璃盖盖在培养室上。
7. 使用经70%乙醇喷洒过的KimWipe擦拭盖玻片底部残留物，以免影响显微镜观察。
8. 将培养室置于34 °C/5% CO₂培养箱中孵育30分钟。此步骤可确保培养室本身升温至34 °C，从而减少金属部件升温过程中引起的盖玻片位移。

6. 显微镜设置

此处使用配备定制中继透镜和发射滤光片轮盒的Leica DMIRE2倒置显微镜进行图像采集，该滤光片轮盒可支持多个滤光片轮（Quorum Technologies Inc.，加拿大安大略省贵湖市）的盒式装载。

1. 明场成像——灯电压设置为 2.5 V，曝光时间为 240 ms。
2. 红色荧光蛋白（RFP）——增益设置为 140，曝光时间为 200 ms。
3. 绿色荧光蛋白（GFP）——增益设置为 140，曝光时间为 500 ms。
4. 我们的显微镜采用可调光光源，而非转盘装置来控制照射到细胞的光量。实验中光源强度设置为最大亮度的 90%。

7. 使用凋亡诱导剂和NucView 488 Caspase-3 底物处理细胞

1. 提前配制大量细胞凋亡诱导剂并分装冻存非常重要，以确保不同实验间诱导剂浓度的一致性。
2. NucView 488 底物对光敏感。建议将底物分装为每管 15 μL，以减少冻融次数，并将管子用铝箔包裹后于 -20 °C 保存。在使用前，应尽可能降低实验室环境光照强度，以减少 NucView 488 底物的光照暴露。
3. 从培养箱中快速取出培养腔，避免细胞因温度下降而受影响。将培养腔置于显微镜的环境培养箱上，并使用夹具固定，防止其移动。此时也应调暗室内灯光。
4. 打开带有双级调节阀的 5% 预混 CO₂ 气瓶。
5. 使用 10x 物镜，通过明场显微镜在计算机显示器上聚焦以找到细胞。注意：应选择在所需放大倍数下具有最大数值孔径的物镜，以缩短曝光时间。
6. 向细胞中加入细胞凋亡诱导剂（在本实验中为 80 mM 钾离子或 100 mM 谷氨酸），可采用以下任一方法。此处以使用 KCl 溶于常规培养基配制成 10 倍浓缩液来递送 80 mM 钾离子为例进行说明。
   1. 通过缓慢局部灌流进行培养基更换：
      - 使用蠕动泵将培养腔中的培养基更换为含有 80 mM 钾离子的新培养基。
      - 管路一端向腔内输送 10 mL 溶于无酚 DMEM 的 80 mM 钾离子储备液，另一端则从腔内移除原有培养基。
      - 应至少实现 10 倍体积的培养基更换，以确保腔内残留培养基中的钾离子浓度准确。
      - 培养基更换完成后，在腔内加入 3 μL NucView 488 底物，用移液器吹打混匀。
   2. 直接向培养腔内的培养基中添加 80 mM K⁺ 和 NucView 488 底物：
      - 配制溶于无酚 DMEM 的 80 mM 钾离子 10 倍储备液。
      - 将 3 μL NucView 488 底物加入 50 μL 10 倍浓度的 80 mM 钾溶液中，吹打混匀后，加入至含有 500 μL 无酚 DMEM 的培养腔中。
      注意：若需维持或评估原始培养基中可能存在的细胞生长或其他分泌因子，推荐使用此方法。我们发现 NucView 488 底物在细胞培养环境中稳定性良好，适用于长达 36 小时的实验。

8. 活细胞成像

1. 点击红色通道以显示转染的细胞。
2. 选择并保存大约十几个含有多个转染细胞的视野，并保存这些“X-Y 载物台位置”。根据计算机内存的大小，您可获取的载物台位置数量可能受限。
3. 让显微镜每隔 6 分钟在这些已保存的位置自动采集图像（明场、红色通道和绿色通道）。
4. 在实验早期阶段可见的任何绿色染色，通常表明细胞已开始发生凋亡，这通常是由于转染和/或环境应激所致。由实验处理引起的细胞凋亡将在实验的后期时间点被检测到。

9. 统计分析

1. 
   
   每次实验中，我们对显微镜进行编程，以采集多个X-Y位点，从而高效地获取大量数据。每次实验均设置重复两次或三次，并整合在不同日期进行的独立实验数据。对于每组数据集，我们分析最多15个视野，计算caspase阴性细胞与caspase阳性细胞的比例（视野中细胞总数 / caspase阳性细胞总数）。
   
   
2. 将每组数据集中记录的测量值归入更大的样本集，随后使用方差分析表（ANOVA，p = 0.05）进行相互比较。我们展示各实验的均值标准误（SEM），并通过Tukey均值比较检验（p = 0.05）分析均值间的差异，以确定不同处理组之间是否存在显著差异。

10. 代表性结果

我们描述了一项实验，用于说明NucView 488底物如何在高细胞外钾浓度处理后，指示N19-OLG细胞培养物凋亡速率的增加。N19细胞被转染了RFP，分别用3 μL NucView 488底物（对照组）或3 μL NucView 488底物加80 mM [K⁺]（处理组）进行处理。细胞被持续监测，并在12小时的时间过程中采集图像，该时长足以用于涉及神经损伤的研究（图1A）。在对照条件下，我们未观察到明显的凋亡现象，而80 mM [K⁺]处理的培养物（带斜线框）在12小时后显示出约45%的细胞死亡（图1B）。对照条件下观察到的背景绿色信号，代表在未添加细胞外钾的情况下发生凋亡的细胞。在对照实验中，几乎没有任何细胞在12小时时间点出现凋亡，尽管在其他情况下实验可能需要更长时间。图像使用10倍物镜采集。标尺 = 100 μm。

图1. (A) 转染后48小时的N19 OLG细胞培养物在表达RFP-MBP（红色通道）的同时加入3 μL NucView 488 底物（绿色通道），进行为期12小时的时间序列实验。细胞培养物分别接受终浓度为80 mM [K⁺]的处理（左图），或不作处理作为对照（右图）。图像以每6分钟采集一次，与对照组相比，经80 mM [K⁺]处理的培养物中可在细胞核内（虚线框）观察到显著的活化型caspase-3（绿色信号）。(B) 活化型caspase-3阳性细胞所占百分比（通过视野中总细胞数除以caspase阳性细胞总数计算得出）。与对照条件相比，我们在K⁺处理12小时后观察到约45%的细胞死亡。

视频1. 转染后48小时的N19-OLG细胞在80 mM [K⁺]处理下，表达RFP-MBP（红色通道）并加入3 μL NucView 488底物（绿色通道）的12小时时间序列实验，包含明场图像及三通道合并图像。请点击此处查看或下载该视频文件。

s视频 2. 转染后 48 小时的 N19-OLG 培养物表达 RFP-MBP（红色通道），并加入 3 μL NucView 488 底物（绿色通道）的 12 小时时间序列实验，同时展示明场图像及三通道合并图像。该培养物未施加任何处理，可见 N19-OLG 在显微镜视野中迁移，与经 80 mM [K⁺] 处理的细胞培养物形成对比（可参见 s视频 1）。请点击此处查看或下载该视频文件。

讨论

尽管这不是唯一可用于凋亡检测的荧光生成型产物，但使用NucView 488底物具有多个显著优势。其中一个主要优点是能够实时动态监测活细胞中的细胞凋亡过程，而大多数其他替代产品则需要裂解细胞或细胞通透性较差。其他优点包括对caspase-3的高度敏感性、良好的细胞通透性、低细胞毒性，以及不会干扰细胞凋亡进程。该底物在被切割并进入细胞核之前具有很低的背景荧光，从而消除了背景信号。caspase-3识别序列含有3个负电荷，而DNA结合染料带有1个正电荷²。因此，DEVD-NucView 488分子整体带负电荷，这可防止染料在caspase未激活的细胞中发生活化并结合DNA。

为了能够在重复实验之间进行有意义的比较，必须保持实验间的一致性。其中需要保持一致的主要参数之一是细胞密度，因为其会影响转染效率。根据我们的经验，与HeLa或HEK293等其他常见细胞系相比，在永生化的N19-OLG细胞培养中实现高转染率更为困难，且转染效率高度依赖于细胞密度^{12, 13}。对于这些细胞，我们使用Fugene HD（Roche）获得了最佳的转染效率，通常约为15%，但根据所用质粒的不同，有时可超过30%。精确的细胞计数有助于获得稳定的转染效率。此外，在检测细胞凋亡率等指标时，还应确保不同处理组的细胞所经历的环境应激程度相同。具体而言，细胞暴露于转染试剂的时间长短或光照暴露量等环境变量均需加以考虑，并在不同实验间保持恒定。就我们的应用而言，发现采集大量视野图像可提供足够大的样本量，从而进行具有统计学意义的比较[ibid]。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
特定试剂与设备清单
NucView 488 活细胞Caspase-3 检测试剂盒	Biotium, Inc.	30029
FuGENE HD 转染试剂	罗氏集团	04709705001
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基	GIBCO，隶属于 Life Technologies	31053-028
0.25% 胰蛋白酶	GIBCO，隶属于 Life Technologies	15050-065
胎牛血清	GIBCO，隶属于 Life Technologies	12483-020
青霉素/链霉素	GIBCO，隶属于 Life Technologies	15140122
#1.5-25 毫米玻璃盖玻片	Warner Instruments	64-0715
Chamlide CMB 25 mm 磁力培养皿 盖玻片	Quorum Technologies	CM-B-40
Cellstart 细胞培养 10 厘米培养皿	VWR 国际公司	82050-576
BD Falcon 6 孔细胞培养板	VWR 国际公司	CA62406-161