我们介绍一种相对简单的经视网膜电图（ERG）记录方法，用于从完整的小鼠视网膜中获取视杆细胞和视锥细胞的光反应。该方法利用阻断感光细胞的突触传递，从而分离其光反应，并通过放置在离体平铺视网膜两侧的场电极进行记录。
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摘要
摘要
脊椎动物视网膜中存在两类不同的成像感光细胞：视杆细胞和视锥细胞。视杆细胞能够检测单个光子，而视锥细胞则能在快速变化的明亮光照条件下持续工作。当感光细胞外段中视杆或视锥特异性的视觉色素吸收光后，会触发光转导级联反应，最终导致细胞膜上的环核苷酸门控通道关闭，细胞发生超极化。这种光诱导的膜电流和膜电位变化可通过经典的吸管电极记录技术1,2或通过离体视网膜的视网膜全层视网膜电图记录（ERG）进行检测，后者需使用药物阻断突触后反应成分3-5。后一种方法可实现对小鼠感光细胞长期且便于施加药物的记录，尤其适用于从数量稀少且脆弱的小鼠视锥细胞中获得稳定的光反应。对于视锥细胞，此类实验既可在暗适应条件下进行，也可在强光照射后几乎完全漂白所有视觉色素的情况下进行，以监测暗适应过程中视锥细胞光敏感性的恢复6,7。在本视频中，我们将展示如何从小鼠暗适应视网膜中记录由视杆细胞和M/L型视锥细胞驱动的视网膜全层电反应。视杆细胞记录将使用野生型（C57Bl/6）小鼠的视网膜进行。为简化实验，视锥细胞记录将采用遗传修饰的视杆转导素α亚基基因敲除（Tα-/-）小鼠视网膜，此类小鼠缺乏视杆信号传导8。
方案
1. 制作电极
- 制备玻璃电极。称取 120 mg 琼脂，加入 10 mL 蒸馏水中混合（最终琼脂浓度为 1.2%）。将琼脂溶液置于热水浴中熔化。使用塑料注射器将琼脂溶液灌注至玻璃毛细管中（我们使用 World Precision Instruments TW100-4 型毛细管，其规格如下：长度 = 100 mm，外径/内径 = 1/0.75 mm，内体积 = 44 μL）。在室温下静置 10 分钟，使琼脂凝固。此方法可制备约 200 根毛细管（剩余琼脂混合物可储存于 -4 °C，可重复使用数次）。
- 使用金刚石刀片将毛细管切成两半。
- 将所得玻璃电极在小鼠电极溶液中浸泡至少 24 小时（4 °C）。电极储存于 4 °C，可在 3–4 个月内使用。
2. 实验设置
- 将小鼠在暗处适应过夜。用于视杆细胞驱动的视网膜跨层记录时，使用野生型小鼠（例如 C57Bl/6）；用于视锥细胞跨层记录时，使用缺乏视杆细胞信号传导的 Tα-/- 小鼠8。
- 配制 1 L 灌流液、100 mL 电极液和 20 mL 孵育液（见下文），并将灌流液经 Millipore 0.45 μm 或 0.22 μm 滤器过滤（可选）。
- 使用位于视网膜平面的光度计校准光源（505 nm LED 或卤素灯光学刺激器）。若使用 LED 光源，需使用光学扩散器以实现光照均匀性。
- 准备实验用灌流室（灌流室结构可能有所不同）。我们的灌流室由 3 mm 厚的有机玻璃制成，底部采用小型塑料培养皿的盖子加工而成，有效灌流体积约为 400 μL（长 = 25 mm，宽 = 8 mm，高 ≈ 2 mm）。将电极液（含 2 mM L-谷氨酸和 10 mM BaCl2）注入灌流室的下部电极腔。使用塑料管和玻璃毛细管，将下部电极腔（通过连接在室底部的塑料管接头）与电极 holder 相连。确保电极、连接管路及电极 holder 中无气泡（必要时可用塑料注射器排液）。
- 将记录室安装在显微镜载物台上（可选：可将显微镜置于防震台，并置于法拉第笼内，以最小化机械和电磁噪声）。将下部电极 holder 连接到差分放大器的正极输入端（例如 Warner Instruments DP-311 放大器）。将灌流室下部电极开口与刺激光斑居中对齐。将灌流管路连接至记录室并开启灌流。
- 在 40 °C 水浴中孵育灌流液的同时，用 95% O2/5% CO2 气体对其进行鼓泡。CO2 可将溶液 pH 调节至 7.2。溶液依靠重力从瓶中流经陶瓷电阻加热器，重新加热至 36–37 °C。为减少热量损失，加热器应尽可能靠近记录室，理想位置为显微镜载物台上。
- 通过流量调节器将流速调节至约 1 mL/min。
- 使用第二个电极 holder 将上部电极连接至放大器头级的第二个（负极）输入端。用 O 形圈将热电偶探头固定在上部电极上。确保电极和热电偶尖端彼此靠近，以便温度测量尽可能接近视网膜中心。将上部电极尖端浸入灌流液中，并置于灌流室中央。静置 10–15 分钟，使基线稳定。
- 调节加热器的直流电压，使溶液温度维持在 36–37 °C。
3. 分离小鼠视网膜
- 在红光下，使用 CO2 和颈椎脱位法处死已暗适应的小鼠。可选步骤：使用电灼笔或加热的解剖针在巩膜最背侧点灼烧，为每只小鼠眼球做参考标记。所有后续操作均在红外光下进行，并使用装配了红外图像转换器的解剖显微镜。
- 使用弯头剪刀通过轻压并拉伸眼球两侧皮肤的方式取出眼球。在红外光照下，使用显微剪刀或刀片将两个眼球沿中线切开成两半。
- 去除角膜和晶状体。尽可能彻底清除玻璃体。
- 从色素上皮层上剥离第一层视网膜，必要时用镊子仔细清理，以去除残留的色素上皮颗粒。我们通常使用完整的视网膜进行视杆细胞和视锥细胞的跨视网膜记录。然而，若希望专门记录小鼠视网膜背侧部分（该区域含有更多的 M/L 视锥细胞9），则在剥离视网膜前，以电灼标记为参考，使用刀片或显微剪刀切除眼杯的腹侧部分。
- 将第二个切开的眼球放入盛有孵育溶液的小培养皿中，并将制备好的组织置于充满纯氧的避光盒内孵育，直至使用。通常情况下，在室温下该小鼠眼杯可保存数小时并用于记录。
- 使用玻璃或塑料移液器将分离的视网膜转移至培养皿盖上的一滴灌流液（约 300 μl）中。加入 5–6 小滴含 BaCl2 的电极溶液，对视网膜进行 BaCl2 预孵育。在同一液滴中放置一片方形（约 5×5 mm）背面角落涂有润滑脂的 Millipore 滤纸（0.45 μm HARG 型，我们使用 Dow Corning 111 阀门润滑剂和密封剂），滤纸上预先打有直径为 2–2.5 mm 的孔。用镊子将视网膜置于滤纸上方（感光细胞面朝上），并压紧其边缘，使其平展固定。视网膜应居中覆盖在滤纸的开孔上。
- 用镊子将带有视网膜的滤纸转移至灌流室，并将其放置在与刺激光斑对齐的下电极位置上方。轻轻按压滤纸涂有润滑脂的边缘，使其与灌流室粘合。
- 将上电极置于视网膜中心上方（轻微接触感光细胞层）。将上电极居中放置可提高信号幅度（相比靠近视网膜边缘放置时提高约 20–40%）。尽管这种电极位置会导致小部分视网膜区域（约占总面积的 12–15%）接收到的有效光刺激强度略有畸变，但仍是电极放置的最佳方式。至此，样品已准备好进行跨视网膜记录。
4. 穿视网膜记录
- 根据小鼠品系的不同，使用校准的505 nm LED光源或光学刺激器，记录从弱到强光强的视杆细胞或M/L-视锥细胞驱动的测试闪光反应。对于本实验所用的LED光源，闪光强度通过计算机控制LED输入电压、可切换电阻器以及一组位于LED与视网膜之间的中性密度滤光片（我们使用Rosco Laboratories的E-Colour #211 0.9 ND滤光片）共同调节。LED测试闪光的持续时间（20 ms）由计算机控制。若使用卤素灯光学刺激器，则可通过一组中性密度滤光片调节测试闪光强度，通过窄带干涉滤光片调节波长，闪光持续时间则由计算机控制的快门调节。
- 可选：为维持 BaCl 对光反应中胶质成分的有效抑制2 每天不同时段，偶尔更换下部电极溶液（例如，每次检测视网膜前），使用装有新鲜溶液的塑料注射器冲洗置换。
5. 代表性结果
溶液
- 小鼠视网膜灌流液：112.5 mM NaCl、3.6 mM KCl、2.4 mM MgCl2、1.2 mM CaCl2、10 mM HEPES（pH 7.2）、20 mM NaHCO3、3 mM 琥珀酸钠、0.5 mM 谷氨酸钠、0.02 mM EDTA 和 10 mM 葡萄糖。此外，该溶液中添加 2 mM L-谷氨酸和 10 μM DL-AP-4 以阻断光反应的高级成分10,11，并加入 0.1% MEM 维生素和 MEM 氨基酸溶液（Sigma）以提高视网膜活性。
- 小鼠电极液：140 mM NaCl、3.6 mM KCl、2.4 mM MgCl2、1.2 mM CaCl2、3 mM HEPES（pH 7.4，用 NaOH 调节）。下电极腔室中的溶液还含有 2 mM L-谷氨酸以阻断突触传递10，以及额外添加的 10 mM BaCl2 以抑制光反应中的胶质成分3,12。
- 视网膜孵育液：将 272 mg L-15 培养基（Sigma）和 20 mg BSA 溶解于 20 mL 去离子水中。L-15 和 BSA 的终浓度分别为 13.6 mg/mL 和 1 mg/mL。用 1 M HCl 将 pH 调至 7.4。
图1. 示意图显示用于跨视网膜ERG记录的小鼠视网膜分离过程。
图 2。 灌流室及记录电极与其支架的照片。红色箭头指示灌流液的流动方向。
图 3。 视网膜电图（ERG）跨视网膜记录实验装置示意图。红色箭头表示灌流液流动方向。
图 4。 代表性结果：记录的小鼠视杆细胞驱动的跨视网膜反应家族。光反应在 30 Hz（8 极贝塞尔滤波器）进行低通滤波，以 1 kHz 采样并存储于计算机中以供进一步分析。图中曲线表示在弱光强度下 5–6 次反应的平均值，以及在饱和光强度下 2–3 次反应的平均值。
图 5。 代表性结果：记录的小鼠视锥细胞驱动的跨视网膜反应家族。光响应信号在30 Hz（8极贝塞尔滤波器）进行低通滤波，以1 kHz采样数字化，并存储于计算机中以供进一步分析。图中所示曲线为弱光强度下5-10次响应的平均值，以及饱和光强度下3-5次响应的平均值。
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讨论
上述视杆细胞和视锥细胞驱动的经视网膜ERG记录方法正成为研究野生型及基因修饰小鼠光感受器功能的有力工具。除了能够简便地表征基本的光反应特性外，该技术在接近完整的视网膜制备样本上进行长时间实验时，仍能提供极为稳定的数据响应。在野生型小鼠中，暗适应下的视杆细胞最大反应振幅和光敏感度在记录开始后至少1小时内保持稳定，而暗适应下的视锥细胞最大振幅和光敏感度在记录30至40分钟后通常下降不超过10%。该技术的其他优势还包括易于进行药理学干预，这一点是经典的小鼠光感受器单细胞吸管记录法难以实现的，同时无需使用活体动物ERG记录所必需的麻醉。利用Tα视网膜-/- 视杆细胞信号消除的小鼠品系8 用于视锥细胞经视网膜记录的技术显著简化了实验操作流程及结果解读，这在监测小鼠视锥细胞视觉色素在强光照射后的再生过程，或研究稳定背景光存在条件下视锥细胞功能的实验中尤为重要。因此，目前正涌现出令人振奋的新前景，可用于探究小鼠视杆细胞和视锥细胞的生理特性，包括与视杆细胞和视锥细胞相关视觉障碍的小鼠模型。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
由“防盲研究”职业发展奖、美国国立卫生研究院（NIH）基金 EY19312 和 EY19543（VJK）资助，以及由“防盲研究”提供的无限制资助和基金 EY02687（华盛顿大学眼科与视觉科学系）提供支持。
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