小鼠视网膜经视网膜电图记录：视杆细胞与视锥细胞的光反应

摘要

我们介绍一种相对简单的经视网膜电图（ERG）记录方法，用于从完整的小鼠视网膜中获取视杆细胞和视锥细胞的光反应。该方法利用阻断感光细胞的突触传递，从而分离其光反应，并通过放置在离体平铺视网膜两侧的场电极进行记录。

摘要

脊椎动物视网膜中存在两类不同的成像感光细胞：视杆细胞和视锥细胞。视杆细胞能够检测单个光子，而视锥细胞则能在快速变化的明亮光照条件下持续工作。当感光细胞外段中视杆或视锥特异性的视觉色素吸收光后，会触发光转导级联反应，最终导致细胞膜上的环核苷酸门控通道关闭，细胞发生超极化。这种光诱导的膜电流和膜电位变化可通过经典的吸管电极记录技术^1,2或通过离体视网膜的视网膜全层视网膜电图记录（ERG）进行检测，后者需使用药物阻断突触后反应成分^3-5。后一种方法可实现对小鼠感光细胞长期且便于施加药物的记录，尤其适用于从数量稀少且脆弱的小鼠视锥细胞中获得稳定的光反应。对于视锥细胞，此类实验既可在暗适应条件下进行，也可在强光照射后几乎完全漂白所有视觉色素的情况下进行，以监测暗适应过程中视锥细胞光敏感性的恢复^6,7。在本视频中，我们将展示如何从小鼠暗适应视网膜中记录由视杆细胞和M/L型视锥细胞驱动的视网膜全层电反应。视杆细胞记录将使用野生型（C57Bl/6）小鼠的视网膜进行。为简化实验，视锥细胞记录将采用遗传修饰的视杆转导素α亚基基因敲除（Tα^-/-）小鼠视网膜，此类小鼠缺乏视杆信号传导⁸。

方案

1. 制作电极

1. 制备玻璃电极。称取 120 mg 琼脂，加入 10 mL 蒸馏水中混合（最终琼脂浓度为 1.2%）。将琼脂溶液置于热水浴中熔化。使用塑料注射器将琼脂溶液灌注至玻璃毛细管中（我们使用 World Precision Instruments TW100-4 型毛细管，其规格如下：长度 = 100 mm，外径/内径 = 1/0.75 mm，内体积 = 44 μL）。在室温下静置 10 分钟，使琼脂凝固。此方法可制备约 200 根毛细管（剩余琼脂混合物可储存于 -4 °C，可重复使用数次）。
2. 使用金刚石刀片将毛细管切成两半。
3. 将所得玻璃电极在小鼠电极溶液中浸泡至少 24 小时（4 °C）。电极储存于 4 °C，可在 3–4 个月内使用。

2. 实验设置

1. 将小鼠在暗处适应过夜。用于视杆细胞驱动的视网膜跨层记录时，使用野生型小鼠（例如 C57Bl/6）；用于视锥细胞跨层记录时，使用缺乏视杆细胞信号传导的 Tα^-/- 小鼠⁸。
2. 配制 1 L 灌流液、100 mL 电极液和 20 mL 孵育液（见下文），并将灌流液经 Millipore 0.45 μm 或 0.22 μm 滤器过滤（可选）。
3. 使用位于视网膜平面的光度计校准光源（505 nm LED 或卤素灯....

讨论

上述视杆细胞和视锥细胞驱动的经视网膜ERG记录方法正成为研究野生型及基因修饰小鼠光感受器功能的有力工具。除了能够简便地表征基本的光反应特性外，该技术在接近完整的视网膜制备样本上进行长时间实验时，仍能提供极为稳定的数据响应。在野生型小鼠中，暗适应下的视杆细胞最大反应振幅和光敏感度在记录开始后至少1小时内保持稳定，而暗适应下的视锥细胞最大振幅和光敏感度在记录30至40分钟后通常下降不超过10%。该技术的其他优势还包括易于进行药理学干预，这一点是经典的小鼠光感受器单细胞吸管记录法难以实现的，同时无需使用活体动物ERG记录所必需的麻醉。利用Tα视网膜^-/- 视杆细胞信号消除的小鼠品系⁸ 用于视锥细胞经视网膜记录的技术显著简化了实验操作流程及结果解读，这在监测小鼠视锥细胞视觉色素在强光照射后的再生过程，或研究稳定背景光存在条件下视锥细胞功能的实验中尤为重要。因此，目前正涌现出令人振奋的新前景，可用于探究小鼠视杆细胞和视锥细胞的生理特性，包括与视杆细胞和视锥细胞相关视觉障碍的小鼠模型。

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