单层的合成，装配和表征蛋白质单分子膜的电化学保护的金纳米粒子薄膜

摘要

Alkanethiolate稳定的黄金被称为单层保护集群（储值卡）胶体合成，特点，并组装成薄膜作为一个简单的氧化还原蛋白的蛋白质单层的电化学像吸附接口绿脓杆菌阿苏林（AZ）和细胞色素 C（CYT C）。

摘要

纳米胶体金alkanethiolate配体称为单层保护金团簇（储值卡），合成和蛋白质单层电化学（PME）的吸附平台服务的电影集会，随后被纳入保护。 PME是利用模型系统研究氧化还原蛋白质的电化学性能，限制了他们吸附在修饰电极，这也为电子转移（ET）反应的氧化还原合作伙伴的平台。有研究表明，这种性质的金纳米粒子薄膜组件提供更均匀的蛋白质吸附环境，促进无距离的依赖相比，更为传统的醇自组装单分子膜（SAM）修改系统的^ET。1-3在本文中，储值卡官能与hexanethiolate配体合成使用修改Brust反应⁴与紫外可见（UV - VIS）光谱，透射电子显微镜（TEM），和质子^（1H）核磁共振（NMR）的表征。 MPC电影组装SAM修饰的金电极接口使用的是"浸周期"交替MPC层和二硫连接分子的方法。通过测量充电电流的系统更改双层薄膜生长在金电极是电化学跟踪。硅烷改性玻片上组装的类似电影让光学薄膜生长和横截面TEM分析监测，提供了一个估计的薄膜厚度。电影大会期间，MPC配体保护的操纵以及间的联动机制，让网络电影，容易适应，界面氧化还原蛋白具有不同的吸附机理。例如， 绿脓杆菌阿苏林（AZ）可吸附疏水hexanethiolate储值卡和细胞色素 C（ 细胞色素c）静电可以固定在修改MPC界面层羧酸二硫联片。在这份报告中，我们完全专注于电影的AZ系统协议。调查涉及蛋白质合成MPC修改的平台上的吸附作用，可进一步了解生物分子和人造材料之间的相互作用，因此援助的生物传感器的计划，ET建模系统^，合成生物相容性材料发展。5-8

方案

1。 Hexanethiolate单​​层保护金团簇合成

Hexanethiolate官能单层保护金团簇（储值卡）是合成2:1 1 hexanethiol（C6）的摩尔比黄金生产的平均坳_{225（C6），75}结构^。4-9 Brust反应具体的修改，如配体类型，具体的巯基金的比例，温度，反应分娩率，或^后期合成处理，9-11可以产生各种各样的不同核心的大小和功能的保护群体的^多用途储值卡，分别为4。MPC近似（平均）与各硫醇团体功能的多用途储值卡的组成可以由质子^（1H）核磁共振（NMR）的碘分解样品的分析。

1. 在30毫升的甲苯溶解1.1克四辛基溴化铵（TOABr）与适当的通风柜通气。
2. 溶解0.38克硼氢化钠（硼氢化钠_4）〜20毫升18MΩultrapurified的水（向上H _{2 O），}并允许在冰上冷却至少30分钟。
3. 〜20毫升的H _{2 O}溶解0.31克氢tetrachloroaurate（HAuCl _4）和TOABr甲苯溶液定量转移溶液混合使用额外的H _{2 O〜5}毫升，以相转移水金非水溶液的解决方案。搅拌严格而掉以轻心，使焦橙色的水和明确非水​​相混合以及上限为30分钟。
4. 明确水和烧毁橙色非水相转移至分液漏斗。倒掉水（底）层和倒出的非水层（顶部）到一个干净的瓶中。
5. 添加HAuCl ₄的比例为2:1的非水溶液C6 。搅拌30分钟，形成一个凹（一）聚合物，从红橙色的颜色变化，淡黄色，近无色的解决方案检测。
6. 反应混合物转移到一个绝缘的冰浴和冷却至0 ° C带搅拌至少30分钟。
7. 定量，迅速 ​​补充冷冻硼氢化钠反应混合物_溶液 ，为了减少金属黄金AU（一）在硫醇的存在，瞬间形成了厚厚的黑色的多用途储值卡的解决方案后，除了。搅拌反应过夜在0 ° C。
8. 将反应混合物转移至分液漏斗，丢弃到一个废物烧杯中的水（底）层，旋转蒸发接近完成干燥烧瓶中留下一个沉重的黑色污泥的非水（顶部）甲苯层。
9. 沉淀加入乙腈和允许坐通宵的储值卡。
10. 收集真空过滤使用橡胶配件和侧武装烧瓶与抽吸的介质孔隙度的玻璃粉的储值卡，并具有丰富的乙腈冲洗。
11. 允许多用途储值卡的空气干燥，称重产品，特点是透射电子显微镜（TEM）和核磁共振分析，并储存供日后使用上限。获得溶解在甲苯下降到formvar /碳支持膜的铜网（400目）和经营80-100千伏TEM仪器铸造的多用途储值卡的TEM照片。可以预计的平均核心大小，使用图像分析软件，如图像J（免费）。

2。电影大会:二硫联蛋白单分子膜的电化学的MPC电影大会

第一黄金基板电化学清理和修改与C6 SAM沉浸在交替二硫连接分子和C6修改储值卡的解决方案，以弥补"浸周期"，这是反复几次，最终形成一个二硫联MPC电影大会之前。正如在以前的研究中所述，绿脓杆菌阿苏林（AZ）蛋白的质粒客客气气科里博士威尔逊莱斯大学和AZ里士满大学教授，博士乔纳森提供的纯化和冻干粉Dattelbaum，水化，后来用4.4毫米的磷酸钾缓冲液（KPB，pH值= 7.0，μ= 10毫米），创建一个5-10μM解决方案，紫外可见（UV - VIS）分析核实。

1. 聚集在以下顺序从底部到顶部的电化学（echem）夹心细胞:第一个有机玻璃固定板，金基底作为工作电极，黄铜金工作电极的电接触，第一橡胶垫片，氟橡胶O形圈，它定义电极面积（0.32厘米^2），玻璃细胞体，第二个橡胶垫圈，第二有机玻璃固定板。整个单元一起举行螺纹杆和仔细拧紧蝶形螺母。细胞是装有一个商业购买的参考电极，房屋1米饱和KCl，银/氯化银参考线，和铂辅助电极丝玻璃桶。
2. 电化学清洁日E的金基底潜在的Windows执行中的循环伏安法（CV）从0.2到0.9 V，0.2至1.2 V和0.2至1.35 V（相对于Ag / AgCl电极，氯化钾）100 mV / s的_0.1氢2 SO ₄和0.01 M氯化钾。
3. 通过执行"标准条件"，包括潜在的窗口，从0.1到0.4 V（相对于Ag / AgCl电极，氯化钾）扫描在100 mV / s的在^KPB 1丢弃KPB CV测量的清洁的裸金基板的充电电流和冲洗先后与UP H _{2 O，}乙醇（EtOH）的H _{2 O}和乙醇。
4. 公开已清理的金基底〜300μL5毫米酒精C6解决方案，并允许坐过夜，以形成一个有序的C6的SAM。丢弃从细胞C6解决方案和冲洗先后与乙醇UP乙醇，H ₂ O的_{H 2} O ，
5. 在标准条件下测量充电电流的SAM。丢弃KPB，先后向上乙醇，H _{2 O}的H _{2 O，}和乙醇冲洗。充电电流应明显减少裸金测量（步骤^2.3）1。
6. 公开的SAM修饰的金基板5毫米〜300μL乙醇1,9 - nonanedithiol（NDT）的解决方案，允许坐1小时interdisperse无损检测分子内C6 SAM联系起来。丢弃的无损检测解决方案，并先后与彻底冲洗UP乙醇，H ₂ O的_{H 2} O，和二氯甲烷_{（CH 2 CL} 2），与乙醇。
7. 公开金基板MPC解决方案的CH ₂氯_2（〜1毫克/毫升），搅拌1小时慢慢地_与 N 2气体鼓泡。如有必要，更换蒸发与CH ₂ CL ₂ MPC解决方案。这是电影大会MPC层锚固。丢弃MPC解决方案，并先后与_{CH 2 CL} 2，H _{2 O}的向上，并KPB再次冲洗。
8. 在标准条件下测量的MPC层的充电电流。丢弃KPB和冲洗的H ₂ O和CH ₂ Cl _2等先后。
9. 20分钟慢慢地_与 N 2气体鼓泡公开金基底_〜300μLCH 2 Cl与_搅拌 2 5毫米的无损检测解决方案。
10. 放弃无损检测并彻底冲洗CH _{2 CL 2。}重复步骤2.7和2.8存第二MPC的一层薄膜大会。
11. 存入额外MPC层，步骤2.9和2.10是重复的。随着每个额外的MPC层，在充电电流相应增加。
12. 网络MPC电影完成后，冲洗与KPB膜修饰的基板。排列的蛋白质被吸附在MPC电影大会echem夹心细胞注入〜150μL〜5-10μM的AZ的KPB解决方案，并允许坐封顶，冷藏至少1小时。
13. 从冰箱中取出的echem细胞，并允许它返回到接近室温。与N ₂气体彻底冲洗10分钟KPB，笔芯echem KPB细胞和泡沫KPB。
14. 蛋白质单层的电化学研究简历，从-0.25 V至0.25 V的电位窗（相对于Ag / AgCl电极，氯化钾）100扫描在KPB毫伏/秒。

3。电影大会:二硫联MPC光学跟踪电影大会

增长光学评价MPC电影之前，载玻片部分预清洗食人鱼解决方案（CAUTION! 2:1浓H ₂ SO ₄和H _{2 O 2）}和（3 -巯基）丙基三甲氧基硅烷（3 - MPTMS处理然后组装这些修改后的玻璃上^）。1-2 MPC电影幻灯片使用"浸循环"技术，如前所述。

1. 冲洗与CH _{2 CL 2} 3 MPTMS的修改后的玻片上，MPC解决方案_中的_CH 2氯2（〜1毫克/毫升），1小时，在低速搅拌，而在振动筛。这就完成了电影大会第一锚多用途储值卡硅烷硫醇endgroups MPC层。彻底冲洗幻灯片与CH _{2 CL 2，}干与N ₂气体。紫外光谱的幻灯片（从400至1000 nm），并再次冲洗CH _{2 CL 2。}
2. 放置1小时的幻灯片，在低速搅拌，而在振动筛_{在CH 2} CL 2 5毫米的无损检测解决方案。与CH _{2 CL 2}冲洗的幻灯片。
3. 在MPC解决方案的幻灯片，而在低速上摇床搅拌，放置1小时。这就完成了电影大会的货币政策委员会第二层。彻底冲洗幻灯片与CH _{2 CL 2，}干与N ₂气体，并采取一个紫外光谱的幻灯片（从400至1000 nm）。在整个频谱的吸光度应增加额外MPC层吸附到电影大会。
4. 存款额外MPC层，STEPS 3.2-3.3是重复的。

4。横截面透射电子显微镜表征单层保护金集群电影大会

的TEM横截面是准备重新嵌入EN面对嵌入式电影^2，12，这是由第一附加MPC电影3 - MPTMS修改后的载玻片上组装到一个干净的，标准的显微镜幻灯片使用嵌入812环氧树脂，以便改善在下面的程序处理。谨慎使用与应用的热量，为更高的温度下会分解电影内的储值卡。

1. 混合嵌入812环氧树脂，并允许增厚至少12小时。
2. 填充环氧树脂与"00"BEEM胶囊和反转MPC薄膜样品的顶部（第3条编制）。胶囊，使气泡上升胶囊顶部，创造之间的环氧树脂和MPC薄膜样品密封处的压力。允许聚合至少18小时在60 ° C，然后冷却至室温安装幻灯片。
3. 热装在200 ° C，以便去除块附有MPC EN面对电影，持续20秒的幻灯片上铸铝热板。
4. 切割样品含有BEEM囊块使用一个珠宝商的看到电影。
5. 重新嵌入了面临的硅内部的MPC片方在硅平面模具拆除部分。环氧树脂填充硅在室温下使聚合至少18小时，在60 ° C。样品冷却至室温。
6. 使用钻石刀垂直切割部分在刀刃上获得一个莱卡UCT ultramicrotome 60-80 nm的薄样品的部分。
7. 切片formvar /碳支持膜的铜网（400目）的部分路段和MPC的薄膜组件的准备截面的TEM照片。

5。代表性的成果:

图1双层充电电流监测共5浸渍周期（交替暴露MPC和无损检测解决方案）MPC的薄膜生长。充电电流增加系统与每个浸渍周期，加入MPC的"层"的电影（图2）。循环伏安收集使用一个潜在的窗口，从0.1到0.4 V（相对Ag / AgCl电极，氯化钾）扫描100 mV / s的4.4毫米磷酸钾缓冲液（pH值= 7.0，μ= 10毫米）。 ML瓦戈，CP Gulka，JK Gerig，招商Manieri，JD Dattelbaum，CB标志，NT劳伦斯，ML Trawick，和MC利奥波德， 兰米尔26（1），560-569许可重印。 2010年美国化学学会版权所有。

图2（A）示意图排列蛋白吸附到二硫联MPC电影大会。 （二）排列的典型循环伏安吸附MPC电影大会收集的一个潜在的窗口从-0.25至+0.25 V（相对于Ag / AgCl电极，氯化钾）100 mV / s的扫描4.4 mM磷酸钾缓冲液（pH = 7.0， μ= 10毫米）。

图3代表一个二硫联MPC 3 MPTMS修改后的载玻片上的薄膜生长的紫外-可见光谱监测。浸周期由载玻片无损检测连接器解决方案，MPC解决方案曝光的曝光。每个随后浸在增长中膜厚度和并发吸收增加的结果。由于浸周期的数量增加，表面等离子体带正逐渐被定义在〜520 nm。 ML瓦戈，CP Gulka，JK Gerig，招商Manieri，JD Dattelbaum，CB标志，NT劳伦斯，ML Trawick，和MC利奥波德， 兰米尔26（1），560-569许可重印。 2010年美国化学学会版权所有。

图4透射电子显微镜（TEM）跨一个二硫联MPC电影大会的断层图像分析。插图:在电影大会hexanethiolate官能多用途储值卡的典型TEM图像。 TEM分析确定的储值卡〜2纳米，使用图像J分析平均黄金核心直径。 ML瓦戈，CP Gulka，JK Gerig，招商Manieri，JD Dattelbaum，CB标志，NT劳伦斯，ML Trawick，和MC利奥波德， 兰米尔26（1），560-569许可重印。 2010年美国化学学会版权所有。

讨论

蛋白质单层的电化学是一种有效的的技术，用于研究氧化还原蛋白质和合成吸附平台之间的相互作用。然而，这一战略的有效性依赖于工程师的能力与高度的分子水平上控制的吸附接口。本协议产生的平台MPC为基础的代表专门设计的平台，能够提供更均匀的^蛋白质吸附环境和促进对较大的距离相比传统PME系统alkanethiolate地空导弹ET。实力作为一种电化学接口MPC电影大会是它的多功能性和适应性，以不同的尺寸和表面化学/功能，各种不同的纳米材料，和备用电极配置以及其他氧化还原蛋白质。例如，描述的过程是很容易适应细胞色素 C（细胞色素c）ET研究纳入大会的多用途储值卡的最外层层通过使用简单的地方^交换 反应 。11细胞色素c是阳离子，能够绑定到基板静电，可以羧酸终止硫醇硫醇的地方包括修饰电极界面的多用途储值卡的外围配体交换，以方便后续的电化学分析相同，这里描述的静电驱动的蛋白质^固定， 1调整多用途储值卡的大小，以适应不同大小的蛋白质，如巯基金比率的变化，调整Brust合成，反应温度/分娩率，收益率的货币政策委员会直径范围广泛，将匹配的直径大约有针对性的蛋白质...

材料

试剂和设备的名称	公司	目录编号
四辛基溴化铵	Sigma - Aldrich公司	294136
硼氢化钠	Sigma - Aldrich公司	213462
氢tetrachloroaurate	Sigma - Aldrich公司	254169 - 5G
1，Hexanethiol	Sigma - Aldrich公司	234192
透射电子显微镜	JEOL	1010
核磁共振波谱仪	布鲁克AVANCE	300兆赫
Formvar /碳支持膜的铜网（400目）	电子显微镜科学	FCF400 -铜
金基底	蒸发金属Films公司	自定义
银/氯化银参比电极	微电极，公司	MI - 401F
恒电位	CH仪器公司	CHI650A，CHI610B
1,9 - Nonanedithiol	Sigma - Aldrich公司	N29805
（3 - 巯基）-三甲氧基硅烷	Sigma - Aldrich公司	175617
紫外可见分光光度计	安捷伦	8453
嵌入812环氧树脂	电子显微镜科学	14120
"00"BEEM胶囊	电子显微镜科学	70000 - B
硅平面模具	电子显微镜科学	70900
钻石刀	Diatome	21模块，S12801