RNAi 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的胚后表型

摘要

我们描述了一种增敏方法，利用基于RNAi的基因组筛选和整合的转基因，该转基因表达一种带有荧光标签的功能性蛋白质，以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）中调控蛋白质表达和定位的后胚胎期调节因子。

摘要

C. elegans 已被证明是发现和功能鉴定众多基因及基因通路的宝贵模式系统¹。日益完善的工具和资源正在推动该系统中对具有更细微表型或功能的基因的持续发现。

在此，我们介绍了一种经过改进的通用实验方案，用于鉴定 秀丽隐杆线虫 利用RNAi筛选具有特定 postembryonic 表型的基因²该步骤可根据需要轻松修改，以检测特定表型，无论是通过解剖显微镜还是复式显微镜的透射光或荧光光学系统进行观察。该筛选方案充分利用了生物体的物理特性以及现有的分子工具 秀丽隐杆线虫 科研界已取得的成果。例如，我们展示了一种整合型转基因的应用，该转基因表达一种荧光产物，用于RNAi筛选，以鉴定在幼虫晚期及成虫中维持该产物正常定位所必需的基因。首先，我们使用了一种市售的基因组RNAi文库，其含有全长cDNA插入片段。该文库可通过RNAi介导的候选基因产物下调，实现对多个候选基因的快速鉴定。其次，我们构建了一种整合型转基因，使其在对RNAi敏感的遗传背景下表达我们感兴趣的荧光标记蛋白。第三，通过对孵化后的动物进行RNAi处理，该筛选方法能够鉴定出在胚胎期具有重要功能的基因产物，从而避免其胚胎致死效应掩盖该基因在胚胎后发育阶段对目标蛋白的调控作用。最后，该筛选利用配备单细胞分辨率的复合显微镜进行观察。

方案

1. 筛选菌株的构建

筛选菌株的精心设计对于筛选的成功至关重要，相关描述见其他文献³对于某些研究人员而言，实验需要使用表达可见产物的转基因品系。许多携带整合转基因的品系可从秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）或个别研究人员处获得。如果筛选所需的转基因品系不可获取，则可通过已发表的方法（如基因枪轰击法）自行构建。⁴，UV/TMP⁵或 Mos 转座子插入⁶为了可视化我们的目标蛋白，我们插入了 gfp-编码序列与成熟的cDNA序列保持阅读框一致（我们使用了 dbl-1 序列）。由于这种GFP融合蛋白在解剖镜下不可见，我们使用了一种可见的共注射标记物，该标记物不会影响目标蛋白的观察（ttx-3p::rfp，有关其他几种标准标记物的综述，请参见 ⁷）。随后，我们从染色体外阵列构建了一个整合型转基因。我们发现，通过基因枪轰击法将该转基因整合后，获得的低拷贝数整合品系既不能挽救解剖显微镜下的表型，也无法产生可检测水平的GFP标记产物（Beifuss和Gumienny，未发表）。通过UV/TMP方法对最初由显微注射构建的多拷贝染色体外阵列进行整合^8,9 产生了可见的、具有挽救效应的转基因产物水平（图3A）。使用抗GFP抗体进行的Western blot证实了转基因（等位基因名称 texIs100) 的表达和加工正确（Beifuss 和 Gumienny，未发表）。无论来源如何，整合的转基因都应经过五次回交以去除无关的背景突变。

在我们的筛选实验中，我们希望唯一存在的目标蛋白是转基因的带标签形式。因此，我们通过引入一个功能丧失型的突变等位基因dbl-1来剔除内源性功能基因。

最后，我们使该品系对RNAi效应更加敏感。如果动物携带能够使其对RNAi效应敏感的突变，那么文库中的RNAi对许多基因的基因产物抑制作用会更为显著^10,11。在选择合适的RNAi敏感化遗传背景时，应考虑目标组织¹¹。我们使用经典的rrf-3(pk1426)等位基因构建了筛选品系。RRF-3是一种RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）同源物，通常抑制体细胞中的RNAi¹⁰。也可使用其他导致RNAi超敏感的基因（如eri-1或eri-1 lin-15b）的突变，以增强RNAi的效果^11-13。

我们构建的筛选菌株基因型为 rrf-3(pk1426); texIs100; dbl-1(nk3)。

2. 选择和准备RNAi文库

市售的 C. elegans cDNA 文库分别代表了 C. elegans 中约 55% 或 87% 的预测基因（分别为 Vidal 实验室或 Ahringer 实验室文库）。单个克隆可购买（Open Biosystems，Geneservice Ltd.）。我们选择由 Vidal 实验室构建的 ORF-RNAi 文库（Open Biosystems），因为其克隆大多为全长 cDNA，并通过 Gateway 克隆技术构建，可直接用于下游应用（Invitrogen Corporation，Carlsbad, CA）。原始的 Ahringer 实验室基因组 cDNA 文库包含的 cDNA 片段在下游表征实验中的适用性较窄^14,15。两个文库均使用含有两个 T7 启动子的载体，启动子位于插入片段两侧（图 1）。这些构建体在细菌菌株 HT115 中培养，该菌株在异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导下表达 T7 聚合酶。含有文库克隆的细菌通过 IPTG 诱导以产生 dsRNA（见步骤 3.4）。

收到文库后立即制作完整副本，并使用该副本来进行所有实验。原始文库和复制文库应分别储存在连接不同电路的-80°C冰箱中。

3. 含文库克隆菌株的制备

1. （实验前两个月内）从选定的喂食文库克隆以及阳性和阴性对照中挑取细菌，在标记好的LB-羧苄青霉素/四环素平板上划线（每个100 mm平板培养8个菌落），于37°C过夜培养（>16小时）（图1）。每块24孔板使用两个对照：阳性对照为bli-4（K04F10.4），可产生剂量依赖性的胚胎后表型^16,17；阴性对照C06C3.5是WormBase.org预测的一个假基因（WormBase.org），未观察到任何表型（Beifuss和Gumienny，未发表数据）。
2. （实验前两个月内，最好更早）制备含有25–50 μg/ml羧苄青霉素和1 mM IPTG的24孔线虫生长培养基（NGM）平板，4°C保存。
3. （第1天）针对每个克隆，使用无菌操作技术，从第3.1步划线平板上挑取单菌落，接种至2 ml含有50 μg/ml羧苄青霉素的LB液体培养基中。在37°C、220–240 rpm振荡条件下过夜培养（>16小时）（图1）。培养16小时后，溶液应呈浑浊状态。
4. （第2天）次日早晨，向各培养物中加入IPTG至终浓度1 mM，以诱导双链RNA（dsRNA）的产生。继续在37°C、220–240 rpm条件下振荡培养4–5小时。此步骤可比仅依赖NGM平板琼脂中的IPTG（见第3.5步）更稳定且有效地实现RNA干扰介导的基因产物敲低。
5. 将每种诱导后的细菌培养物各30 μl点样至24孔NGM RNAi平板的不同孔中，该平板含有25–50 μg/ml羧苄青霉素和1 mM IPTG（图1，RNAi实验追踪模板见图4）。将平板置于无菌超净台中，敞口放置20分钟或直至菌点滴干。切勿过度干燥，否则琼脂边缘会脱离平板，若线虫爬入由此形成的缝隙中将无法回收。

4. 线虫的制备

从经过分期的线虫群体开始实验。对动物进行分期可以降低对照组与实验组RNAi试验之间观察到的差异仅仅是由于动物发育阶段不同所致的可能性（然而，如果RNAi导致发育延迟，筛选者应予以注明（图2））。此外，使用L1幼虫起始RNAi实验可避免因基因在胚胎期致死效应而带来的混杂影响，从而更清晰地研究这些基因可能具有的胚胎后功能。

通过首先对筛选品系的混合发育阶段群体进行漂白处理来实现同步化，此过程中仅有卵壳保护的胚胎能够存活。该方法可使动物在20°C下同步至约12小时，或在16°C下同步至约18小时¹⁸。为了进一步提高发育阶段的同步性，可将胚胎置于不含食物的M9培养基中孵化，使其停滞在第一幼虫阶段（L1）。饥饿状态的L1期动物在添加食物后将从相同的起始年龄恢复生长¹⁹。

1. （第1天）使用三个含有成年 gravid 蠕虫和胚胎的清洁筛选品系动物培养皿（直径100 mm），动物应处于喂食状态。用无菌M9缓冲液冲洗培养皿，轻轻吹打液体使其流过皿表面，以松动动物和胚胎。将冲洗液转移至一个带螺旋盖的无菌15 ml离心管中。
2. 如果冲洗液体积超过3.5 ml，离心沉淀动物（约3000 rpm，30秒），并吸除上清液至剩余3.5 ml；若冲洗液体积少于3.5 ml，则向管中加入H₂O或M9缓冲液，使总体积达到3.5 ml。
3. 操作化学品时需穿戴适当的防护装备（实验服、手套和护目镜）。将0.5 ml 5 N NaOH与1 ml新鲜漂白剂（5%次氯酸钠，使用期限小于1年）混合，将此混合液加入含3.5 ml线虫冲洗液的离心管中。启动计时器开始计时。该过程不应超过10分钟；若超过此时间，胚胎将受到损害，导致产量降低，或表明漂白剂已失效，需更换。
4. 将离心管涡旋震荡约10秒，之后每2分钟重复震荡一次，持续4至10分钟。每次震荡后，在解剖显微镜下观察溶液中的动物残骸。
5. 当胚胎被释放且成虫组织已破碎（通常为6–8分钟）时，通过台式离心机离心收集胚胎（约3000 rpm，30秒）。
6. 尽可能吸除上清液，但注意不要扰动沉淀物。操作应谨慎，切勿贪多。
7. 加入无菌M9缓冲液至总体积约10 ml。短暂涡旋或充分振荡以重悬沉淀物。
8. 再次离心并去除上清液。若管中仍可闻到漂白剂气味，应重复洗涤步骤直至气味消失。
9. 将胚胎重悬于10–15 ml无菌M9缓冲液中，并转移至一个小的（25 ml）锥形瓶（用于通气）。在适合该品系和实验的温度下（15–25°C）振荡培养过夜（> 16小时，20°C）。在此期间，所有动物将孵化并停滞于L1休眠期。
10. （第2天）将L1期动物在15 ml离心管中离心沉淀，并重悬于0.5–1 ml M9缓冲液中（约3000 rpm，30秒）。取5 μL溶液滴加到单独的培养皿上，计数动物数量。根据需要调整体积，使每3–10 μL溶液中含有约30条蠕虫。
11. 将约30条经次氯酸盐同步化的L1期动物点样至已准备好的24孔板每个孔的细菌上。每孔动物数量超过30条可能导致种群在成熟前因食物不足而饥饿死亡。将平板盖子略微倾斜放置，使其自然干燥。随后盖紧盖子并用橡皮筋固定。将平板倒置，并置于适当温度下培养至目标发育阶段进行观察。由于rrf-3(pk1426)为温度敏感型等位基因，我们的筛选品系动物在15–17°C下培养三至四天，以观察L4至成虫阶段的个体（图1）。

5. 线虫的观察

（第5天）当线虫生长至所需阶段后（图2A），使用解剖显微镜检查阳性与阴性对照是否产生预期的表型。我们采用bli-4作为RNAi效率的对照，因其可产生剂量依赖性的胚胎后发育缺陷，表型范围从出现水疱的成虫（轻微RNAi表型，未展示）到发育停滞的微小幼虫（强烈且预期的RNAi表型）（图2B）。随后使用解剖显微镜观察每个实验孔中的线虫，并记录由RNAi诱导的明显异常表型（图2C）。在确认对照结果并记录显著表型后，对RNAi实验样本进行目标表型的筛选。我们使用配备荧光装置和63倍物镜的复式显微镜，从对照组开始，对每个RNAi实验至少观察五只个体（图3）。

1. 通过制备4%琼脂垫（4%琼脂溶于H₂O中）来准备载玻片（标准尺寸为75 × 25 mm）。为确保琼脂垫厚度均匀，将一块洁净的载玻片置于两个垫片之间（每个垫片由显微镜载玻片加两层实验室胶带构成）。用移液器吸取约100 μL熔融的4%琼脂（相当于玻璃巴斯德吸管滴加2至3滴），滴加到洁净载玻片中央。迅速但轻柔地将另一块载玻片盖在垫片和熔融琼脂之上，形成琼脂垫。轻轻滑动两块载玻片使其分离，使琼脂垫附着于其中一块载玻片上。
2. 在琼脂垫上滴加约5 μL麻醉剂（例如左旋咪唑或叠氮化钠）。将8–12只线虫置于麻醉剂液滴中，盖上22 × 22 mm、厚度为#1.5的盖玻片（或根据复式显微镜要求选择最合适的盖玻片厚度），使用复式显微镜观察线虫。
3. 记录每次RNAi实验所检测的基因、观察的线虫数量及表型结果。进行筛选实验时，应制作并使用标准模板（参见示例，图5）。
4. 若可能，应通过另一个次要表型以及重复实验来验证RNAi诱导的表型。（例如，图示示例筛选实验以GFP标记的DBL-1定位改变作为主要筛选指标，以体长作为次要筛选指标²⁰。）细菌菌株可在4°C保存条件下从同一划线平板使用长达两个月。较老的划线平板可能导致液体过夜培养物生长不良，应先重新划线培养。
5. 至少对cDNA插入片段的一端进行测序，以确认插入片段与文库标签一致（Ahringer文库已进行可靠性分析；详见http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/）²¹。推荐使用的引物（适用于任一文库的插入片段）结合于L4440衍生载体上的位点，并位于插入位点两侧：5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3' 和 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'（M13f20引物）。

采用该方法，单人每周可合理地进行并观察两到四组实验。例如，周一和周二进行处理的动物可分别在周四和周五进行观察，并可再次于周五和周六进行处理，以便在下周一和周二进行观察。根据每天筛选的表型不同，每组实验可能包含一个24孔板（用于复合显微镜观察），若表型能够快速识别，也可包含更多孔板。因此，考虑到阳性与阴性对照以及筛选速率，每周至少可完成88个不同的RNAi实验。若使用解剖显微镜进行筛选，则速度会更快，无需将动物固定在载玻片上进行观察。多人协作也可通过错开工作时间和/或使用多台显微镜的方式提高实验室的通量。另一种替代方法是将动物培养在薄层琼脂上，随后直接切取含有动物的琼脂片并转移至载玻片上进行观察，该方法可节省时间。该变体方法已成功用于在400倍放大倍数下筛选雄性尾部异常²²。

6. 代表性结果

GFP标记的DBL-1正常与异常定位的示例见图3。GFP标记的DBL-1正常表达包括腹神经索的细胞体以及一排点状结构（图3A）。当线虫饲喂可阻止dbl-1 mRNA翻译的RNA时，DBL-1表达显著减弱（图3B）。dbl-1(RNAi) 还会导致个体变小，在本示例中作为二次筛选指标（数据未显示）。利用专为此筛选构建的菌株，通过RNAi可快速鉴定影响DBL-1定位的基因（图3C）。

图1. 筛选细胞外DBL-1信号通路调控因子的实验方案。将喂养文库中的细菌在液体培养基中过夜培养后，用IPTG诱导，并在37°C下继续孵育4小时，以使细菌产生双链RNA（dsRNA）。取30 μl诱导后的菌液点样至含有25 μg/ml羧苄青霉素和1 mM IPTG的24孔NGM（线虫生长培养基）平板中，每孔一点，在无菌操作台中晾干。我们通过将次氯酸盐处理后的胚胎置于无食物的培养基中孵化，使其停滞在第一幼虫期（L1），从而获得同步化的L1期幼虫（发育停滞状态）。将约30条同步化的L1期线虫接种到含有RNAi文库细菌的各个孔中，使处于特定发育阶段的线虫恢复生长并摄取细菌所产生的dsRNA²³。在15°C培养72小时后，对年轻成虫期的线虫进行可见表型筛选。在此发育阶段，体型异常表型清晰可辨，且texIs100转基因表达产生的荧光信号较强。

图2. 筛选前需识别的表型示例。所有孔中动物的图像均使用解剖显微镜在相同放大倍数下拍摄。所有动物均在以饥饿L1幼虫形式接种后约72小时进行成像。所有图像均经过相同处理。A) 敲低一个不引起明显形态缺陷的基因。动物表现为野生型。B) bli-4基因的RNA干扰。动物发育停滞，体型较A图中的动物显著缩小。C) dpy-13基因的RNA干扰。动物发育阶段与A图中的动物相同，但呈现“短胖（dumpy）”的体形表型。

图3. 荧光标记蛋白的示例，以及特定基因的RNAi如何改变其定位模式。所有图像均使用旋转盘共聚焦显微镜在630倍放大下拍摄，曝光时间为5秒。比例尺 = 10 μm。所有图像均经过相同处理。空心箭头指示细胞体。箭头标记成串的点状结构。实心箭头指示部分异常定位的GFP标记DBL-1蛋白。A) 饲喂伪基因C06C3.5的线虫（“野生型”）。B) dbl-1(RNAi) 对照。C) RNAi干扰一个对GFP标记DBL-1正常定位必需的基因。

图 4. 在 24 孔板中追踪 RNAi 实验（文库克隆）的模板示例。该模板可用于创建实验的永久记录，不同于直接标记培养板的方法。

图5. 记录RNAi表型的模板示例。可根据需要扩展。

讨论

本文介绍的RNAi筛选方法能够灵敏且快速地分析正常（或转基因）胚胎后表型所需的基因产物。示例展示的是针对影响荧光标记蛋白亚细胞定位相关基因的筛选。然而，该方案可经修改用于鉴定影响其他特定胚胎后表型的基因。

该方法利用RNAi文库，基于候选基因策略进行研究。采用诱变技术的正向遗传学筛选能够鉴定随机诱导产生的新等位基因，但鉴定这些等位基因通常需要大量时间、人力和/或资金²⁴。相比之下，使用cDNA文库时，只需对导致特定RNAi表型的cDNA插入片段进行测序，即可快速确认候选基因。此外，适用于克隆的cDNA插入片段有利于对鉴定出的候选基因进行后续分析。同时，对于突变后致死的基因，也可通过RNAi技术实现鉴定与分析。通过将孵化后的动物置于诱导表达的细菌上，该方法可实现对同时具有重要胚胎功能的基因进行幼体后发育缺陷的观察。

务必确认所观察的动物未处于饥饿状态。饥饿会影响动物的表型。若在饥饿动物中鉴定出新的RNAi表型，应重复实验以确认该表型是由RNAi引起，而非由饥饿所致。为防止饥饿，应使用已生长至稳定期的新鲜细菌...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NGM 琼脂	线虫生长培养基	IPM Scientific, Inc	可按照 NGM 琼脂方案制备25
M9 培养基			22 mM KH2PO4、 42 mM Na2HPO4、 86 mM NaCl、 1 mM MgSO4
琼脂粉	EMD Millipore	1.01614.1000	用于 NGM 平板时为 2% 水溶液；用于显微镜载玻片垫片时为 4% 水溶液（首次需高压灭菌，之后可用微波炉熔化）。
胰蛋白胨	BD Biosciences	211677	0.25%
IPTG	Research Products International Corp.	I56000-5.0	终浓度为 1 mM
羧苄青霉素	Research Products International Corp.	C46000-5.0	工作稀释液浓度为 50 μg/ml
LB 肉汤（Lennox 配方）	BD Biosciences	240230	20 g/升
四环素	Sigma-Aldrich	268054	工作稀释液浓度为 12.5 μg/ml
次氯酸钠	任意供应商	5% 家用漂白剂	使用新鲜漂白剂。
氢氧化钠	任意供应商	CAS 1310-73-2	5 N 储存液
M9 培养基	Wormlab 食谱手册	http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab	26
左旋咪唑	Sigma-Aldrich	31742	工作稀释液浓度为 100 μM 至 1 mM
叠氮化钠	Fisher Scientific	S227	在 M9 中的工作稀释液浓度为 10 mM
24 孔板	Greiner Bio-One	662160	VWR 分销商
显微镜载玻片	任意供应商	75 × 25 × 1 mm
显微镜盖玻片	任意供应商	22 × 22 mm，No.1.5	应使用显微镜制造商推荐的厚度。
复式显微镜	Carl Zeiss, Inc.	A1m	使用符合实验需求的物镜和滤光片。
培养基泵	Manostat 可调速蠕动泵	Kate 型号 #72-620-000	使用适用于该设备的管路和设置。