本方案展示了在定制设计的电趋化室中建立二维和三维环境的方法，可用于追踪细胞 体内/离体 利用单细胞水平的时间延时记录，以研究趋电性（galvanotaxis/electrotaxis）及其他细胞对直流电场（DC EFs）的响应。
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方法文章
电场控制下神经前体细胞在二维和三维环境中的定向迁移
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
内源性电场（EFs）天然存在 体内 在组织/器官发育与再生过程中发挥关键作用，包括中枢神经系统的发育与再生1,2这些内源性电场由细胞对离子转运的调控以及细胞和组织的电阻共同产生。已有报道称，施加外源性电场治疗可促进动物和人类脊髓损伤的功能性修复。3,4特别是，已证明电场导向的细胞迁移存在于多种细胞类型中5,6，包括神经前体细胞（NPCs）7,8直流电场（DC EFs）的应用在大多数实验室中并非一种常见的技术。我们此前已描述过将直流电场应用于细胞和组织培养的详细实验方案。5,11在此，我们提供一段视频演示，展示基于计算电场强度的标准方法，用于建立神经前体细胞（NPCs）的二维（2D）和三维（3D）培养环境，并在2D单细胞生长条件以及3D脊髓组织切片环境中研究细胞对电场刺激的响应。脊髓组织切片是研究NPC的理想受体组织 离体 行为，移植后，因为这些培养物中的细胞构筑学组织结构得到了良好保存9,10。此外，这一 离体 该模型还能够对技术上难以实现的细胞追踪过程进行模拟 体内 在单细胞水平上使用延时成像记录。不仅需要在二维环境中评估细胞行为，还必须在模拟真实组织结构的三维类器官环境中进行评估 体内 环境。该系统能够在组织或器官培养中，利用基于盖玻片的培养皿实现高分辨率成像，并对单个细胞迁移进行三维追踪 体外 和 离体 在进入下一步之前，可作为中间步骤 体内 范式
方案
1. 神经前体细胞的分离
- 从 E14-16 天的小鼠中解剖出完整的大脑，并置于冰冷的 DMEM/F12 基础培养基中。在解剖显微镜下去除所有脑膜，并将大脑转移至 35 mm 的培养皿中。
- 使用精细镊子将大脑机械解离为组织碎片，并将其转移至 15 ml 离心管中，随后以 800 rpm 离心 3 分钟以去除碎片。
- 加入含有 bFGF 和 EGF 的 DMEM/F12 培养基，并用 1 ml 移液器吹打混匀。
- 将细胞悬液通过细胞滤器过滤，以获得单细胞悬液。
- 以 2-5 × 104 个细胞/ml 的密度将细胞接种至培养瓶中，每 3 天进行一次完全换液，并每 6 天传代一次。
- 经过至少 5 次传代后，使用胰蛋白酶和 EDTA 将神经球消化为单细胞，并接种于多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的电趋化室（按下方第 2 步所述方法制备）中进行培养。全程使用含 N2 补充剂、bFGF 和 EGF 的生长培养基，以维持神经前体细胞（NPCs）的特性。
2. 电趋化室的制备
- 使用金刚石笔将经高压灭菌的 22 × 22 mm、厚度为 1 号的盖玻片对半切割，制备 22 × 11 mm 的玻璃条。
- 将四条垂直竖立的 22 × 11 mm 玻璃条用高真空硅脂粘合，制成内部尺寸为 22 × 10 mm 的....
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讨论
我们所采用的实验方案基于以往的研究5,11. 通过这些方法，可在使用琼脂桥、Steinberg 溶液和 Ag/AgCl 电极向培养于定制设计、尺寸标准化且精确的电趋性培养 chamber 中的细胞或组织切片施加电场时，维持稳定的培养环境和电流条件。chamber 的深度可调节，以适应不同厚度的样品11，并且在细胞实验中，可根据所需细胞数量调整腔室大小（例如，蛋白质印迹分析需要大量细胞）。我们对这些方法进行了改进和优化，以实现对技术上难以追踪的细胞进行操作 体内 在单细胞水平上使用延时记录。以往关于细胞对电场（EFs）反应的大多数研究都是在二维（2D）环境中进行的。 体内 在单细胞水平上研究神经前体细胞（NPCs）的电趋化反应将为证实其任何生理相关性提供关键证据。然而，利用现有技术实现这一目标在技术上非常困难，尤其是在尝试获取细胞迁移实时记录时。我们已进一步采取措施建立一种 离体 类器官型脊髓切片培养模型，可高度模拟 体内 环境，表明细胞在三维环境中仍具有电趋向性反应，如图2所示。该方法也可适用于观察电场对类器官三维环境中多.......
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披露
我们无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了英国皇家学会大学研究员奖 UF051616 以及欧洲研究理事会青年研究者奖 243261（授予 BS）的资助。MZ 实验室的工作还获得了加州再生医学研究所资助 RB1-01417 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子 | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF 重组人 | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2补充剂（100倍浓缩液） | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 培养基（高糖） | Invitrogen | 31330-095 | |
| 聚-D-赖氨酸 | EMD Millipore | A-003-E | |
| 天然小鼠层粘连蛋白 | Invitrogen | 23017-015 | |
| 生长因子减少的基底膜基质（Matrigel） | BD生物科学 | 354230 | |
| HEPES缓冲液 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 15630 | |
| McIlwain组织切碎机 | 米克尔实验室工程有限公司 | TC752-PD | |
| 道康宁高真空硅脂 | Sigma-Aldrich | Z273554 |
参考文献
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- B....
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