电场控制下神经前体细胞在二维和三维环境中的定向迁移

摘要

本方案展示了在定制设计的电趋化室中建立二维和三维环境的方法，可用于追踪细胞 体内/离体 利用单细胞水平的时间延时记录，以研究趋电性（galvanotaxis/electrotaxis）及其他细胞对直流电场（DC EFs）的响应。

摘要

内源性电场（EFs）天然存在 体内 在组织/器官发育与再生过程中发挥关键作用，包括中枢神经系统的发育与再生^1,2这些内源性电场由细胞对离子转运的调控以及细胞和组织的电阻共同产生。已有报道称，施加外源性电场治疗可促进动物和人类脊髓损伤的功能性修复。^3,4特别是，已证明电场导向的细胞迁移存在于多种细胞类型中^5,6，包括神经前体细胞（NPCs）^7,8直流电场（DC EFs）的应用在大多数实验室中并非一种常见的技术。我们此前已描述过将直流电场应用于细胞和组织培养的详细实验方案。^5,11在此，我们提供一段视频演示，展示基于计算电场强度的标准方法，用于建立神经前体细胞（NPCs）的二维（2D）和三维（3D）培养环境，并在2D单细胞生长条件以及3D脊髓组织切片环境中研究细胞对电场刺激的响应。脊髓组织切片是研究NPC的理想受体组织 离体 行为，移植后，因为这些培养物中的细胞构筑学组织结构得到了良好保存^9,10。此外，这一 离体 该模型还能够对技术上难以实现的细胞追踪过程进行模拟 体内 在单细胞水平上使用延时成像记录。不仅需要在二维环境中评估细胞行为，还必须在模拟真实组织结构的三维类器官环境中进行评估 体内 环境。该系统能够在组织或器官培养中，利用基于盖玻片的培养皿实现高分辨率成像，并对单个细胞迁移进行三维追踪 体外 和 离体 在进入下一步之前，可作为中间步骤 体内 范式

方案

1. 神经前体细胞的分离

1. 从 E14-16 天的小鼠中解剖出完整脑组织，并置于冰冷的 DMEM/F12 基础培养基中。在解剖显微镜下彻底去除所有脑膜，然后将脑组织转移至 35 mm 的培养皿中。
2. 使用精细镊子将脑组织机械解离成组织碎片，转移至 15 ml 离心管中，随后以 800 rpm 离心 3 分钟以去除碎片。
3. 加入含有 bFGF 和 EGF 的 DMEM/F12 培养基，并用 1 ml 移液器反复吹打混匀。
4. 将细胞悬液通过细胞滤网过滤，以获得单细胞悬液。
5. 以每毫升 2–5 × 10⁴ 个细胞的密度将细胞接种至培养瓶中，每 3 天完全更换一次培养基，每 6 天传代一次。
6. 经过至少 5 次传代后，使用胰蛋白酶和 EDTA 将神经球消化为单细胞，并接种于多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的电趋化室（按下方第 2 步所述方法制备）中进行培养。全程使用含 N2 添加剂、bFGF 和 EGF 的生长培养基，以维持神经前体细胞（NPCs）的特性。

2. 电趋性小室的制备

1. 使用金刚石笔将经高压灭菌的 22 × 22 mm、厚度为 1 号的盖玻片对半切割，制备 22 × 11 mm 的玻璃条。
2. 用高真空硅脂将四条竖直放置的 22 × 11 mm 玻璃条粘合，形成一个内径尺寸为 22 × 10 mm 的自立式玻璃小室。让小室在室温下过夜完全干燥并固化。
3. 次日，用硅脂将两条 22 × 11 mm 玻璃条平行固定于 100 mm 培养皿底部，两玻璃条之间留出 10 mm 的间隙。在该间隙两端各放置一片 22 × 22 mm 盖玻片，用硅脂将盖玻片粘附于培养皿底部的三个边，但靠近培养皿中心的一侧不密封，以封闭该区域。
4. 将步骤 2.2 中制备的玻璃小室置于盖玻片上，使其内壁形成一个限定空间，用于在培养皿底部接种细胞。所有接缝处均用硅脂进行防水密封。依次用聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白对限定区域进行包被：向腔室内加入 1 ml 聚-D-赖氨酸，静置 5 分钟使其充分结合至培养皿底部；用无菌 PBS 洗涤两次，然后将层粘连蛋白用无菌 PBS 稀释至 20 μg/ml，并加入腔室以覆盖培养皿底部。室温下静置过夜。
5. 次日，收集细胞并制备含 1 × 10⁴ 个细胞的 1 ml 细胞悬液。从玻璃小室中移除层粘连蛋白，使其完全自然干燥，然后加入 1 ml 细胞悬液。将培养皿置于 37°C 培养箱中至少培养 4 小时，以促进细胞贴壁。
6. 待细胞达到足够汇合度后，从腔室中移除全部培养基。小心取下玻璃小室。用硅脂将一片经高压灭菌的 22 × 22 mm 玻璃盖玻片小心地固定在两条 22 × 11 mm 玻璃条之间，跨接其上，形成覆盖细胞的“屋顶”。向细胞表面滴加数滴培养基，防止干燥。
7. 在腔室两端各形成一个独立的培养基储液区：通过在培养皿边缘之间、跨越腔室顶部涂布防水硅脂，构建两条密封的硅脂屏障。向腔室中加入新鲜培养基，确保培养基从一端储液区流至另一端。将培养皿放回培养箱中培养 12 小时，以促进细胞恢复。

3. 向电趋性室施加电场

1. 通过在迁移室的每个储液槽正上方各钻一个孔，制备用于覆盖培养皿的盖子。
2. 将迁移室中的所有培养基更换为含有25 mM HEPES缓冲液的新鲜培养基，并将培养皿转移至温控成像系统。设置延时成像和多点记录的实验参数。调整迁移室的方向，使阴极和阳极分别位于左侧和右侧，以确保在显微镜下观察及成像系统记录时，电场（EF）矢量呈水平方向。
3. 取两个烧杯，装入Steinberg's溶液（58 mM NaCl，0.67 mM KCl，0.44 mM Ca(NO₃)₂·4H₂O，1.3 mM MgSO₄·7H₂O 和 4.6 mM Trizma base，pH 7.4）。使用预先制备的玻璃盐桥（长约13 cm、直径约3 mm的玻璃管，在本生灯火焰中加热弯成U形），将每个烧杯分别连接到迁移室的两个储液槽，盐桥中填充2%（w/v）的Steinberg's-琼脂溶液，并穿过盖子上的孔。将连接至直流电源的Ag/AgCl电极插入盛有Steinberg's溶液的两个烧杯中，以完成电路连接。
4. 将电源的电压调节旋钮调至0，然后打开电源。使用电压表测量电趋性室两端的电压，同时缓慢调节电压旋钮，直至达到实验所需的电压值。
5. 开始延时成像记录。根据需要每小时进行一次培养基更换并重新调整电压。可根据实验需求向储液槽中添加新鲜培养基、药物或化学试剂。进行培养基更换时，可考虑以下两种方案：
   1. 方案一：暂时暂停延时记录，小心地将玻璃盐桥从迁移室上取下，注意避免扰动盖子；使用灭菌的巴斯德移液管轻柔地更换全部培养基，随后重新插入玻璃盐桥，再恢复成像记录。
   2. 方案二：也可使用定制的带四个孔的盖子（两个孔位于迁移室每个储液槽上方）进行培养基更换，其中两个孔用于连接玻璃盐桥，另两个孔用于更换培养基。该方案可在更换培养基过程中实现连续记录，避免干扰实验过程。

4. 器官型脊髓切片的制备

1. 解剖2周龄C57 BL/6小鼠的腰段脊髓。
2. 使用McIlwain组织切片器将脊髓切成500 μm厚的切片。
3. 在解剖显微镜下分离切片，并选择具有完整矢状面/轴向脊髓结构的切片。
4. 将切片接种于含有30 μl Matrigel的35 mm培养皿中，尽量将其置于培养皿中央，并在37 °C、5 % CO₂的培养箱中孵育至少30分钟，直至Matrigel蛋白自组装形成覆盖脊髓切片表面的薄层。确保Matrigel完全聚合至关重要；如有必要，可将培养皿在37 °C下再孵育30分钟。
5. 非常轻柔地加入4–6 ml含有25 mM HEPES缓冲液和15–20%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，避免培养基直接冲刷到组织切片上。确保切片未完全浸没于培养基中，使外植体表面充分暴露于空气中。每周更换培养基两次。

5. 将Hoechst 33342标记的神经前体细胞注入脊髓组织切片

1. 将NPC悬液配制为1 × 10⁶ 个细胞/μl。
2. 在培养基中加入5 μM Hoechst 33342，将细胞悬液预孵育30分钟。
3. 使用毛细玻璃管在显微镜下缓慢将2 μl悬液微量注射至脊髓切片中。确保毛细玻璃管穿过Matrigel（显微镜下呈粉红色部分），并进入脊髓切片内部（显微镜下呈灰色组织），在切片内停留至少30秒，以避免细胞悬液溢出。将含有脊髓切片的培养皿放入培养箱（37°C，5%CO₂）中过夜培养。
4. 次日，在电趋化室中对含有Hoechst 33342标记NPC的脊髓切片施加500 mV/mm的电场（采用步骤3中所述方法）。

6. 代表性结果

当神经前体细胞暴露于一系列生理电场时，它们表现出向阴极高度定向的细胞迁移（图1）。在脊髓组织切片的单细胞水平上也观察到了相同现象。 离体 模型，一种模拟的三维环境 体内 条件（图2）。

图1. 神经前体细胞在电场中表现出定向迁移。当暴露于电场（EFs）时，神经前体细胞（NPCs）表现出高度定向的向阴极迁移，红色线条和蓝色箭头代表细胞运动的轨迹和方向（A）。B图显示NPCs的迁移路径。标尺：50 μm。

图 2. 移植的神经前体细胞在脊髓组织切片中朝向阴极定向迁移。（A）用 Hoechst 33342 标记的神经前体细胞被移植至脊髓组织切片中电场处理的起始位置。神经前体细胞在 2.5 小时内朝阴极方向定向迁移，随后电场极性发生反转（B）。改变电场极性后，细胞的电趋向性迅速转向新的阴极（C）。（D）延时记录结束时脊髓切片内移植神经前体细胞的图像。（E）脊髓切片内移植神经前体细胞的三维重建图像。三维扫描切片厚度为 300 μm，从切片中部开始至底部结束。虚线表示同一批移植细胞在电场处理开始、极性反转及结束时的相对位置（分别为 A–C）。箭头指示同一群 Hoechst 33342 标记的神经前体细胞。标尺：50 μm。

讨论

我们所采用的实验方案基于以往的研究^5,11. 通过这些方法，可在使用琼脂桥、Steinberg 溶液和 Ag/AgCl 电极向培养于定制设计、尺寸标准化且精确的电趋性培养 chamber 中的细胞或组织切片施加电场时，维持稳定的培养环境和电流条件。chamber 的深度可调节，以适应不同厚度的样品¹¹，并且在细胞实验中，可根据所需细胞数量调整腔室大小（例如，蛋白质印迹分析需要大量细胞）。我们对这些方法进行了改进和优化，以实现对技术上难以追踪的细胞进行操作 体内 在单细胞水平上使用延时记录。以往关于细胞对电场（EFs）反应的大多数研究都是在二维（2D）环境中进行的。 体内 在单细胞水平上研究神经前体细胞（NPCs）的电趋化反应将为证实其任何生理相关性提供关键证据。然而，利用现有技术实现这一目标在技术上非常困难，尤其是在尝试获取细胞迁移实时记录时。我们已进一步采取措施建立一种 离体 类器官型脊髓切片培养模型，可高度模拟 体内 环境，表明细胞在三维环境中仍具有电趋向性反应，如图2所示。该方法也可适用于观察电场对类器官三维环境中多...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
重组人碱性成纤维细胞生长因子	Invitrogen	PHG0026	20 ng/mL
EGF 重组人	Invitrogen	PHG0311	20 ng/mL
N2补充剂（100倍浓缩液）	Invitrogen	02048
DMEM/F12 培养基（高糖）	Invitrogen	31330-095
聚-D-赖氨酸	EMD Millipore	A-003-E
天然小鼠层粘连蛋白	Invitrogen	23017-015
生长因子减少的基底膜基质（Matrigel）	BD生物科学	354230
HEPES缓冲液	GIBCO，隶属于 Life Technologies	15630
McIlwain组织切碎机	米克尔实验室工程有限公司	TC752-PD
道康宁高真空硅脂	Sigma-Aldrich	Z273554