本文描述了三种互补的实验方案，用于评估聚谷氨酰胺（polyQ）扩展蛋白在酵母Saccharomyces cerevisiae中的毒性。这些方案可轻松修改，以监测其他错误折叠蛋白在酵母中的毒性。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质错误折叠与多种人类疾病相关，尤其是阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病1。亨廷顿病（HD）是由亨廷顿蛋白中多聚谷氨酰胺（polyQ）区域异常扩增所致。这种polyQ扩增的亨廷顿蛋白呈现异常构象（即发生错误折叠），并导致细胞毒性2。至少还有八种神经退行性疾病也由polyQ扩增引起，包括脊髓小脑性共济失调和肯尼迪病3。
模式生物酵母已帮助人们深入理解聚谷氨酰胺（polyQ）毒性的细胞与分子基础，包括聚Q毒性中分子内和分子间因素的影响，以及表达聚Q扩展蛋白的细胞中受损的细胞通路的鉴定3-8。重要的是，许多在酵母中发现的聚Q毒性特征在其他实验系统中乃至亨廷顿病（HD）患者样本中均得到一定程度的重现，从而证明了酵母模型在揭示聚Q毒性基本机制方面的重大意义。
在酵母中直接且相对简单地测定多聚谷氨酰胺（polyQ）毒性的方法是检测表达多聚谷氨酰胺扩展蛋白的酵母细胞的生长缺陷。本文描述了三种互补的实验方法，通过测定表达多聚谷氨酰胺扩展蛋白的酵母细胞的生长情况来评估其在酵母中的毒性。前两种实验方法通过平板监测酵母的生长，第三种方法则使用BioscreenC仪器监测液体培养酵母的生长。
此外，本文描述了在操作酵母多聚谷氨酰胺（polyQ）模型时可能出现的实验困难，并概述了有助于避免或减少这些困难的策略。本文所述的实验方案可用于鉴定和表征调控polyQ毒性的遗传通路及小分子。此外，所描述的检测方法可作为模板，用于对其他与疾病相关的错误折叠蛋白在酵母模型中引起的毒性进行精确分析。
方案
1. 在酵母中表达有毒的多聚谷氨酰胺扩展蛋白
系统性分析已确定了在酵母中引发毒性的多聚谷氨酰胺（polyQ）扩展蛋白的精确氨基酸序列7。这种有毒的多聚谷氨酰胺扩展蛋白包含一个位于氨基末端的FLAG标签，随后是亨廷顿蛋白（huntingtin）原始序列中的17个氨基酸、一个多聚Q区域，以及与荧光蛋白（GFP或CFP，见图1a）的羧基末端融合。当在可诱导且相对强效的GAL1启动子控制下表达时，含有46个或更多谷氨酰胺重复（例如72个和103个谷氨酰胺）的多聚谷氨酰胺扩展蛋白会在酵母中产生毒性7, 9。
如先前所述，聚谷氨酰胺（polyQ）的毒性仅在携带Rnq1p蛋白且其处于朊病毒构象[RNQ+]的酵母细胞中显现，例如酵母菌株W3039。有毒性的polyQ扩展蛋白在酵母中重现了polyQ生物学的核心特征，例如polyQ长度依赖性毒性（见下文）和聚集现象（图1b）。值得注意的是，有毒性的polyQ扩展蛋白并不会立即杀死酵母细胞；它们更倾向于损害或阻滞细胞周期及细胞分裂，从而减缓或抑制酵母菌落在平板或液体培养基中的生长（我们未发表的数据）。
2. 表达毒性多聚谷氨酰胺扩增蛋白的酵母细胞可能存在的问题
表达通常具有毒性的多聚谷氨酰胺（polyQ）扩增蛋白的酵母细胞可....
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讨论
本论文概述了三种互补的实验方法，通过检测表达毒性多聚谷氨酰胺（polyQ）扩展蛋白的酵母细胞生长减缓现象，来测定模式生物酵母中的polyQ毒性。利用酵母开展的研究已为蛋白质错误折叠及其继发毒性的基本细胞与分子机制提供了深刻见解，其中包括polyQ扩展蛋白的错误折叠与毒性机制9,11,12。基于本文所述实验方案的研究已成功帮助鉴定并表征了polyQ毒性的遗传增强因子或抑制因子、调控polyQ毒性的小分子化合物，以及介导polyQ毒性的细胞机制5-8,13,14。
所述方案可轻松调整，用于研究其他影响 polyQ 毒性的因素，例如不同的生长条件或可减轻或加剧 polyQ 毒性的遗传突变。此外，所述实验方案也可简便地调整用于检测其他有毒错误折叠蛋白在酵母中的毒性。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
杜恩瓦尔德实验室的工作得到了美国衰老研究联合会（AFAR）、遗传性疾病基金会（HDF）和威廉·伍德基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Frogger（6×8 针） | V&P Scientific | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growth Curves USA | 5101370 | |
| 100 孔蜂窝板 | Growth Curves USA | 9602550 |
参考文献
- Soto, C., Estrada, L. D. Protein misfolding and neurodegeneration. Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).
- Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).
- Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <....
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