从小鼠E13胚胎中分离少突胶质细胞限制性前体细胞

摘要

本方案概述了从胎儿脊髓中分离胶质限制性前体细胞，并在体外进行培养，用于移植或少突胶质细胞谱系研究。

摘要

从小鼠E13胚胎脊髓中分离胶质限制性前体细胞（GRP）的实验方案。这些细胞属于少突胶质细胞谱系的早期前体细胞。近年来，此类细胞已被研究作为治疗白质疾病潜在的修复疗法来源。脑室周围白质软化症（PVL）是儿童非遗传性白质疾病的首要病因，影响高达50%的极早产儿。研究数据表明，发育中的脑组织对缺氧-缺血、氧化应激和兴奋性毒性具有更高的易感性，这些因素选择性地损伤新生白质。胶质限制性前体细胞（GRP）、少突胶质细胞前体细胞（OPC）以及未成熟少突胶质细胞（preOL）似乎在PVL的发生发展中起关键作用，也是当前持续研究的重点。此外，既往研究已鉴定出中枢神经系统中某些组织区域对谷氨酸兴奋性毒性的易感性增强，并呈现出特定的发育阶段依赖性模式。本实验室目前正在探究少突胶质前体细胞在PVL中的作用，并采用处于GRP发育阶段的细胞进行研究。我们利用分离获得的GRP细胞，在多种实验模型中检测其对符合PVL病理特征的特定应激因素的反应。GRP细胞可被操控 体外 转化为少突胶质前体细胞和前少突胶质细胞，用于与小鼠PVL模型的移植实验 体外 包括缺氧缺血在内的类似PVL损伤的模型。通过使用培养细胞和 体外 研究中实验间的变异性将降低，从而有利于数据的解读。培养的细胞还可实现GRP群体的富集，同时最大限度地减少非GRP表型污染细胞的影响。

方案

引言

本方案中，我们展示了如何从 E13 小鼠胚胎的脊髓中分离、筛选并培养胶质限制性前体细胞（glial restricted precursor, GRP）。这些细胞属于少突胶质细胞系和星形胶质细胞系的早期前体细胞，其特征是表达 A2B5 抗原。在添加 FGF-2 的 GRP 培养基中，A2B5+ 的 GRP 细胞将开始表达早期少突胶质细胞系标志物 PDGFαR 和 NG2^1,2。这些少突胶质细胞系细胞会经历一系列明确的表型阶段，每个阶段均伴随着形态学变化以及特定发育阶段标志物的表达。

目前，这些前体细胞正在被研究作为治疗中枢神经系统白质疾病（包括多发性硬化症、脑白质营养不良症和脑室周围白质软化症（PVL））的基于细胞的治疗策略的潜在细胞来源^3,4,5,6。利用人脑来源的少突胶质细胞系前体细胞的研究已报道，在颤抖鼠髓鞘形成不良模型的小鼠脑内以及脱髓鞘脊髓啮齿类动物模型中均实现了成功的再髓鞘化^6,7,8,9。这些胶质前体细胞还被用于其他白质疾病模型的研究，例如脊髓损伤和肌萎缩侧索硬化症^10,11,12,13。

本实验室已建立一种早期产后缺氧-缺血小鼠模型，用于评估源自脊髓的胶质限制性前体细胞（GRP细胞）作为脑室周围白质软化症（PVL）——脑性瘫痪的主要病因——的修复治疗策略的有效性^14,15,16。此外，还存在一种广泛用于研究白质损伤的啮齿类动物脑源性少突胶质前体细胞（OPC）模型，因为GRP细胞倾向于向星形胶质细胞谱系分化¹⁷。OPC表型已进入少突胶质细胞谱系通路，这一过程似乎不可逆。然而，我们感兴趣的是评估更广泛谱系的少突胶质前体细胞的反应，包括GRP细胞，甚至可能涵盖在胚胎10.5天（E10.5）时获得的神经上皮前体细胞（NEPs）。基于此，我们在研究中采用了源自脊髓的GRP细胞模型。

除了利用少突胶质前体细胞进行细胞替代治疗外，从野生型及转基因啮齿类动物的白质疾病模型中分离这些细胞，还可进一步研究在正常和疾病条件下少突胶质细胞的分化过程 体外 环境。先前的研究表明，少突胶质细胞系前体细胞对外部应激因子具有选择性易损性，这些因子包括与成熟相关的谷氨酸兴奋性毒性、氧化应激以及某些参与神经炎症的因子。^18,19我们的研究主要集中在理解这些白质损伤发生背后的细胞与分子机制，评估少突胶质细胞谱系中各类细胞对损伤的易感性，并分析潜在的治疗策略。

材料

所有涉及动物的操作均符合美国公共卫生署（PHS）政策及约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会（JHU IACUC）的规定。所有操作均应在层流罩内进行，以维持无菌条件。通常解剖操作在水平层流罩中进行， 体外 在垂直层流罩中操作。解剖过程中使用的所有培养基均需保持低温。本研究使用的小鼠为野生型CD-1品系以及携带GFP转基因的C57/BL6背景小鼠。一只CD-1小鼠母体通常可获得10只以上的胎鼠，足以接种1–2个T25培养瓶。通常每次处死两只母鼠，将胎鼠脊髓组织合并，每只母鼠的组织接种一个T25培养瓶。获得细胞后可进行扩增与鉴定。 体外 用于后续研究。

1. 培养基与培养瓶的准备

• GRP储备培养基用作解剖培养基：DMEM/F12 1:1（Invitrogen）+ B27（50倍浓度；Invitrogen）、N2（100倍浓度；Invitrogen）添加剂以及牛血清白蛋白（BSA；0.5% w/v）。
• 解离液：与解剖液相同。
• 培养基：GRP 储存培养基 + FGF-2（10–20 ng/ml；Invitrogen）和肝素1 μg/ml；Sigma）
• PLL/层粘连蛋白包被的75 cm²培养瓶² 或 25 cm² 烧瓶（T75 或 T25）
• 组织培养瓶（75 cm²）²，Falcon）用15-20μg/ml 聚-L-赖氨酸（PLL；Sigma）溶于蒸馏水 H₂O，于 37 °C 孵育1小时后吸除，用PBS洗涤1次，然后以15-20 μg/ml Laminin（Sigma）在 PBS 中 37 °C 孵育1小时后，吸去溶液，加入新鲜PBS或培养基，直至细胞准备铺板。包被后，培养瓶严禁干燥，可一直保存在PBS或培养基中直至使用。 4 °C 使用前短暂存放。

2. 仪器与其他材料

• 培养皿：每只母鼠4个，其中3个用于解剖（75 mm），1个20 mm培养皿用于收集分离出的脊髓。
• 大剪刀（43 mm手术剪，Roboz）和组织镊子，用于打开母鼠腹腔。
• 小剪刀，用于解剖子宫并取出胎鼠（15 mm显微解剖剪，Roboz）。
• 显微解剖弹簧剪（6 mm），用于解剖胎鼠脊髓。
• 显微解剖弯头镊子，用于手术过程中固定母鼠和胎鼠体，并在暴露脊髓后用于取出脊髓。
• 40 或 70 微米细胞筛，用于接种前去除细胞碎片。
• 预热至37 °C的0.05%胰蛋白酶。
• 10 mg/ml DNA酶1（Sigma），配制成100倍储存液（1 g/ml）。
• 生物危害袋，用于盛放动物尸体。
• 15 ml和50 ml离心管，用于处理提取的脊髓组织。

3. 确定定时妊娠

妊娠小鼠母鼠可从商业来源订购，并指定在胚胎发育第12天（E12）或第13天（E13）交付，也可在实验室内自行确定妊娠。简言之，在傍晚时将两只雌鼠与一只雄鼠共同放入同一笼中并过夜。次日观察雌鼠阴道部位是否存在黏液栓。黏液栓仅表明交配已发生，因此后续需每日称量动物体重，以监测体重增长速率。观察到黏液栓的当天被定义为胚胎发育第一天（E1）。

4. 组织来源

1. 在水平流洁净工作台中操作，以维持无菌条件。
2. 用70%乙醇喷洒生物安全柜及工作区域。
3. 将器械进行高压灭菌或用70%乙醇充分喷洒。
4. 准备仪器、培养基和显微镜以供使用。
5. 将20 ml冷的解剖液倒入无菌培养皿中。
6. 以水合氯醛（500 mg/kg）经腹腔注射（IP）麻醉动物，随后行颈椎脱位或断头处死。
7. 用70-90%的乙醇喷洒母鼠腹部区域（消毒）
8. 用大剪刀和镊子打开腹腔。
   1. 在CD1和C57/BL6品系中：子宫内通常有8至14只胎鼠。胎鼠数量因品系而异。
9. 取出小鼠子宫（包括幼仔），置于洁净培养皿中的新鲜冷解剖液中，以清洗胎儿表面的血液和组织碎片。
10. 用小剪刀从子宫角中取出每个胎鼠，并将其与胎膜和胎盘分离。将取出的胎鼠转移至新培养皿中的新鲜解剖液内。
    1. 解剖介质应保持低温，以降低代谢活性并维持所获细胞的活力。
    2. 从现在开始，使用两把镊子和显微解剖弹簧剪进行操作。
11. 在解剖显微镜下操作，用显微外科剪刀沿脊髓纵向剪开皮肤，并向两侧剥离皮肤以暴露脊髓。
12. 用显微外科剪刀在约 C1 水平及尾部起始处横断脊髓。
13. 用钝头镊子取出脊髓，确保去除所有骨组织和软骨，并转移至3^rd 解剖液培养皿
14. 为防止后续细胞培养中脑膜组织过度生长，应尽量从脊髓上剥离尽可能多的脑膜组织。由于新生的外周神经突出，此操作比从大脑中剥离脑膜组织更为困难。
15. 脑膜去除后，将脊髓转移至20 mm培养皿中
16. 用70-90%的乙醇彻底喷洒该区域进行清洁。
17. 以下解离步骤应迅速进行，以保持所获得的脊髓组织的高存活率。

5. 培养物的建立

1. 胰蛋白酶应于37°C预热至少30分钟 37 °C H₂O-浴。应从储备液中取出适量等分试样，以减少储备液暴露于温度波动的影响。
2. 将收获的脊髓转移至含有10 ml预热胰蛋白酶（0.05%；Quality Biologicals）的50 ml离心管中，并 100 μl DNA酶（10 mg/ml）轻微吹打混匀。
3. 孵育于 37 °C H₂O型浴，10分钟。
4. 吹打混匀，再孵育10分钟。
5. 加入5 ml GRP培养基（定义如上），在1000 RPM下离心5分钟。
6. 吸弃上清液，用 10 ml GRP 培养基重悬沉淀，并加入 DNAse-1（10 mg/ml；Sigma）。
7. 孵育于 37 °C H₂O型浴，10分钟。
8. 离心5分钟，1000 RPM，吸除上清液。
9. 用新鲜的GRP培养基重悬沉淀，然后用40 - 70 μm 细胞筛
10. 接种于PLL/层粘连蛋白包被的25 cm培养瓶中² 培养瓶（T25）并在 37 °C，95% 湿度和 5% CO₂₂.
11. 次日更换100%培养基。
12. 此时，胶质限制性前体细胞（GRPs）已贴壁并开始延伸突起。

6. 免疫磁珠分选 GRP 细胞群

1. 将脊髓组织接种于PLL/层粘连蛋白包被的培养瓶中，培养至培养瓶汇合度达到85-90%，或培养约一周时间。
2. 用橡胶刮棒刮取细胞或使用0.05%胰蛋白酶消化收集细胞，轻柔而充分地吹打重悬，1000 RPM离心5分钟，将沉淀用3 ml GRP培养基充分重悬。
3. 将细胞悬液分别转移1 ml至3个T25培养瓶，或转移3 ml至1个T75培养瓶，加入适量培养基以完全覆盖细胞，培养至细胞汇合度达80-90%。
4. 每隔一天更换培养基，若培养基消耗较快则提前换液。
5. 在4 °C条件下，用抗小鼠IgM抗体（Southern Biotech）以10 μg/ml溶于PBS中，对细菌培养皿（75 mm）包被过夜。
6. 吸除多余缓冲液，并用PBS洗涤培养皿3次。
7. 加入A2B5抗体（Millipore），以5 μg/ml浓度溶于PBS中稀释，室温孵育1小时。
8. 再次用PBS洗涤培养皿3次，然后加入8 ml GRP培养基以防止培养皿干燥。
9. 从培养皿中转移5 ml GRP培养基，并用橡胶刮棒刮取培养瓶中的GRP细胞，使所有细胞脱落。
10. 短暂吹打细胞悬液以分散细胞团块，将5 ml细胞悬液转移至A2B5包被的细菌培养皿中。
11. 室温孵育1小时，期间不摇动。
12. 1小时后吸除培养基，并用PBS洗涤培养皿8次。
13. 用橡胶刮棒在2 ml GRP培养基中轻柔刮下细胞，然后转移至PLL/层粘连蛋白包被的培养板或培养瓶中，并加入适当体积的GRP培养基。

7. 分化细胞的冷冻与保存

1. 用 2 ml 0.05% 胰蛋白酶从 85–90% 汇合度的 T25 或 T75 培养瓶中收集细胞。
2. 加入 8 ml GRP 基础培养基稀释并终止胰蛋白酶作用，随后以 1000 RPM 离心 5 分钟。
3. T25 培养瓶的细胞沉淀重悬于 1 ml GRP 冻存液中（GRP 基础培养基添加 10% (v/v) DMSO，可选添加 20% FBS）；T75 培养瓶的较大沉淀则按两倍体积稀释。
4. 将含有 1.5 – 3 × 10^10,11,12,13 个细胞的细胞悬液转移至冻存管（Nalgene），置于含异丙醇的冻存盒（Nalgene）中，在 -80 °C 过夜缓慢冷冻。
5. 过夜冷冻后，将细胞转移至冻存盒，于 -80 °C 保存 6 个月至 1 年，或长期保存于液氮气相（N_(l)）中。解冻后的细胞活力通常为 60–80%，主要取决于多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的质量。

8. 代表性结果

CO₂ 由于可能对胎鼠的存活率以及最终获得的细胞产生不利影响，因此不使用麻醉剂对动物进行麻醉。此外，在细胞分离过程中，很难完全去除脊髓上的脑膜，但通过 GRP 培养基与免疫筛选相结合的方法可有效清除这些增殖迅速的细胞。同样，尽管 GRP 细胞群体在腹侧脊髓中浓度更高（因其起源于腹侧脊髓并向背侧迁移），仍会完整获取整个脊髓组织²⁰然而，GRP 培养基可筛选出具有 GRP 表型的细胞，而通过 A2B5 免疫铺皿可使该细胞群体得到最大化。在接种脊髓组织后， 体外 培养物需孵育两代或约一周时间。培养2天后，可在组织培养瓶中观察到具有不同形态的细胞，表明细胞群体具有异质性，但GRP培养基可筛选出GRP表型的细胞。这些细胞包括A2B5+的GRP、E-NCAM+的神经限制性前体细胞（NRP）、nestin+且A2B5-的神经上皮细胞，以及可能存在的纤维连接蛋白（fibronectin）+的软脑膜细胞。此外，还可能存在表达更成熟表型的细胞，其标志物包括神经元谱系的doublecortin和Tuj1、星形胶质细胞的GFAP，以及少突胶质细胞谱系的PDGFaR和GalC。为从起始的异质性细胞群体中获得高度富集的GRP细胞群体（图1A），当T75培养瓶中的细胞密度达到约85–90%融合度时，可对细胞进行双重免疫磁珠分选，先富集并去除E-NCAM+细胞，再筛选获得A2B5+的胶质限制性前体细胞（GRP）群体。这些GRP细胞即使在选择少突胶质细胞表型的培养基中仍保持向星形胶质细胞分化的潜能，因此可能需要后续的A2B5免疫磁珠分选以维持高度富集的GRP群体。免疫磁珠分选通常可获得高达95%的A2B5+细胞；若需更高得率，可使用A2B5偶联磁珠（Miltenyi Biotec Inc.），得率可达97%。在GRP细胞培养过程中保持警惕，例如定期更换培养基，有助于最大限度减少非GRP细胞类型的增殖。即使在无BMP-4的情况下，仍可能观察到星形胶质细胞的出现，尤其是培养基耗尽时更易诱导向星形胶质细胞表型分化。尽管B27添加剂中含有三碘甲状腺原氨酸激素（T3），但在GRP群体中并未观察到向少突胶质细胞分化的趋势；仅当培养基中添加较高浓度的T3时，才会出现该现象。然而，若担心成熟少突胶质细胞污染，可改用不含T3的B27添加剂。图1B）。这些GRP细胞可根据其细胞体较小并具有2或3个短突起的形态特征 readily 被识别；但为了筛查可能存在的其他细胞类型，可对前述常见的发育阶段及细胞类型特异性标志物进行免疫细胞化学染色。通常会存在少量持续存在的A2B5阴性细胞，即神经上皮细胞（NEP），其具有分化为GRP或NRP的潜能。幸运的是，细胞在GRP培养基中维持培养的时间越长，该培养基越倾向于筛选出具有GRP表型的细胞。

图1. a) 培养2天后可观察到形态异质的贴壁脊髓细胞。b) 免疫淘选法可从起始的异质细胞群体中最大化获得高纯度的GRP富集细胞群。

讨论

中枢神经系统白质疾病包含多种病因，包括遗传性、炎症性、缺血性及中毒性因素^{19,21,22,23,24}。在成人中，多发性硬化和血管病变是白质疾病的主要病因；而在儿童人群中，与早产相关的脑室周围白质软化症是最常见的白质损伤病因。为了进一步阐明疾病机制，有必要深入研究少突胶质细胞谱系的细胞，因为这些细胞在围产期损伤中受到显著影响。已从啮齿类动物胚胎脊髓中分离出胶质前体细胞（GRP），并证实其具有三向分化潜能，可分化为少突胶质细胞和两种不同的星形胶质细胞群体，但不能分化为神经元^2,25,26。同样，从大鼠视神经以及晚期胚胎或早期出生后大鼠脑组织中分离出的少突胶质前体细胞（OPC），在适宜的培养条件下已被证实能够成熟为具有功能的少突胶质细胞^27,28。此外，来源于胎儿或成人的 OPC 也可被进一步诱导转化为更成熟的少突胶质细胞表型^29,30。

GRP 细胞已从 E13.5 大鼠和 E12-13.5 小鼠的脊髓中分离获得。在大鼠中，已有研究报道，背侧来源和腹侧来源的 GRP 细胞在促进少突胶质细胞或星形胶质细胞生成的条件下表现出不同的反应，其中腹侧来源的 GRP 细胞更倾向于分化为更成熟的表型^25,26,28。这可能是由于新生 GRP 细胞存在从腹侧向背侧的迁移过程，导致其对分化信号的响应性较低。免疫平皿法可用于分离并收集表达 A2B5 的亚群，以便在体外培养中维持。

我们的小鼠GRP培养物来源于完整的脊髓组织，可获得具有异质性的混合细胞群体，再通过化学（培养基）和抗体依赖的技术从中筛选出GRP细胞。尽管我们的研究一直采用脊髓来源的小鼠GRP细胞，但最近已有报道指出，可从小鼠脑组织中分离获得同样具备分化为成熟少突胶质细胞能力的少突胶质前体细胞。³¹在此，衍生细胞最初以寡突球体形式进行培养，随后通过使用适当的培养基，将其诱导为富集的PDGFαR+少突胶质前体细胞（OPC）群体。³¹我们的研究主要关注缺氧缺血性损伤模型对少突胶质细胞谱系中不同细胞的影响，范围涵盖从A2B5+、PDGFαR- GRP前体细胞到表达髓鞘碱性蛋白（MBP+）的成熟少突胶质细胞。事实上，我们的 体外 鉴定结果显示，这些不成熟的少突胶质前体细胞（GRP细胞）无论在单培养还是与皮层神经元共培养条件下，均可成熟为表达髓鞘碱性蛋白（MBP）的细胞。这些细胞可在体外培养中被引导进入特定的分化通路，用于研究围产期白质损伤的相关机制。目前已有多种涉及少突胶质细胞谱系细胞的白质疾病小鼠模型，而该细胞群体的可获得性为进一步深入探究导致损伤的机制以及评估潜在细胞治疗方案的有效性提供了重要条件。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12 1:1	Invitrogen	11320033
B27	Invitrogen	17504044
N2	Invitrogen	17502048
rH-FGF-basic	Invitrogen	PHG0026
胰蛋白酶 (0.05%) EDTA	Quality Biological, Inc.	118-087-721
POLY-L-LYSINE HBr	Sigma-Aldrich	P1274-25MG
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
Dnase 1	Sigma-Aldrich	DN25