利用快速扫描循环伏安法测量纹状体脑片中电刺激诱发的突触前多巴胺动态变化。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
采用快速扫描循环伏安法检测纹状体脑切片中的突触前多巴胺动态变化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
大量研究集中于神经递质多巴胺，因其在滥用药物（如可卡因和苯丙胺）作用机制中的重要性，其在精神疾病（如精神分裂症和注意缺陷多动障碍）中的作用，以及其在帕金森病和亨廷顿病等退行性疾病中的参与。在正常的生理条件下，多巴胺已知可调节运动活动、认知、学习、情绪影响以及神经内分泌激素的分泌。多巴胺神经元密度最高的区域之一是纹状体，该区域可分为两个不同的神经解剖学区域，即伏隔核和尾状壳核。本实验的目的是展示在小鼠纹状体中进行脑片快速扫描循环伏安法（FSCV）的一般实验方案。FSCV 是一种明确的电化学技术，能够在特定脑区实时测量多巴胺的释放与摄取。在 FSCV 中使用碳纤维微电极（直径约 7 μm）来检测多巴胺的氧化。利用 FSCV 检测多巴胺的分析优势在于其高达 100 毫秒的时间分辨率和小于十微米的空间分辨率，可为 in vivo 微透析提供互补信息。
方案
1. 实验基本要素
电极制备
- 由于大多数碳纤维微电极均为实验室自制，因此存在多种制备方法。通常决定电极制备细节的是施加于电极的电化学技术（例如安培法与快速扫描循环伏安法FSCV）。对于FSCV，可采用以下三步法在实验室中自制微电极。有关碳纤维电极制备的更完整描述，请参见近期发表的JOVE文章1。但需注意，下文所述电极为圆柱形碳纤维微电极，其制备步骤较上述方案中的安培法用碳纤维微电极更少。该简化方案无需将碳纤维在丙酮中煮沸、无需对玻璃毛细管进行火焰抛光，也无需使用环氧树脂密封玻璃-纤维连接处。
- 利用真空负压将一根碳纤维（直径7 μm；Goodfellow，Oakdale，PA）吸入含内丝的硼硅酸盐玻璃毛细管中（长度10 cm，外径1.2 mm，内径0.68 mm；A-M systems，Carlsborg，WA）。
- 将装有碳纤维的毛细管放入电极拉制仪（Narishige，Tokyo，Japan）中，将其拉断成两半。不同实验室所用的电极拉制仪参数设置各不相同。作为参考，我们使用的拉制参数为：主磁铁90.7，副磁铁23.2，加热器53.4。应通过实验优化参数，以获得长约4.4 mm的玻璃锥形结构，并在碳纤维周围形成紧密密封。
- 在显微镜（Olympus，Tokyo，Japan）下，使用手术刀片修剪从玻璃尖端伸出的碳纤维，使约50–200 μm的碳纤维从密封良....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述方案演示了如何制备和使用小鼠冠状脑切片进行FSCV实验。尽管该方法主要用于获取和测量多巴胺动态变化，但其他神经递质如腺苷、过氧化氢、去甲肾上腺素和5-羟色胺也已通过FSCV在体（in vivo）或离体（in vitro）条件下实现监测3, 8 - 11。通过简单调整施加于工作电极的电压波形，FSCV即可用于监测其中部分其他神经化学物质3, 11。由于这些神经化学物质中的许多具有相似的氧化电位，所生成的循环伏安图可为每种可氧化物质提供独特的化学指纹图谱，从而实现化学物质的鉴定。此外，FSCV已在多种物种中得到应用，从果蝇到非人灵长类动物，以更深入地理解这些模式生物中的神经传递过程12 - 15。FSCV之所以能在如此多样的物种中被广泛应用，主要原因之一在于碳纤维微电极的直径极小，通常小于7 μm。因此，这些微电极能够从非常微小的环境中取样，例如果蝇脑组织（纳升级体积），或在较大物种中区分精细的亚解剖区域，如伏隔核（NAc）的核心区与壳区12-14。
综上.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
由美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所（NIAAA；AA-016967 和 AA016967-01S1；TAM）、韦恩州立大学启动资金以及韦恩州立大学研究资助计划提供资助。本内容仅由作者负责，不代表 NIAAA 或美国国立卫生研究院的官方观点。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钾 | Fisher Scientific | 7447407 | |
| 氯化钠 | EMD Millipore | 7647145 | |
| 氯化镁 | Fisher Scientific | 7791186 | |
| 氯化钙 | Fisher Scientific | 10035048 | |
| 碳酸氢钠 | EMD Millipore | 144558 | |
| 磷酸氢二钠 | EMD Millipore | 7558794 | |
| D-葡萄糖 | Fisher Scientific | 50997 | |
| 抗坏血酸 | Fisher Scientific | 50817 | |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | 57501 | |
| 碳纤维 | Goodfellow | ||
| 玻璃毛细管 | A-M Systems | 602000 | |
| 银丝 | A-M Systems | 787000 | |
| 钨刺激电极 | Plastics One | ||
| 铂丝 | |||
| 导线 | Squires Electronics, Cornelius, OR | ||
| Loctite 404 瞬干胶 | Hankal Corp. | ||
| 剃刀刀片 | World Precision Instruments, Inc. | ||
| BD 脊髓穿刺针 | BD Biosciences | REF 405234 | |
| 手术刀片 | Feather Safety Razor Co, Ltd. | ||
| TH 软件 | ESA Inc.,Chelmsford, MA | ||
| 浸入式记录室 | Custom Scientific | ||
| Neorolog 刺激隔离器 |  Digitimer Ltd. | NL800A | |
| 自动温度控制器 | Warner Instruments | ||
| 显微镜 (SZX7) | Olympus Corporation | ||
| 显微镜 | Fisher Scientific | ||
| Vibratome 3000 切片系统 | St. Louis , MO. | ||
| 灌流泵 | Watson-Marlow Pumps Group | H110708 | |
| 微电极拉制仪 | Narishige International | ||
| ChemClamp 恒电位仪 | Dagan Corporations |
参考文献
- Pike, C. M., Grabner, C. P., Harkins, A. B. Fabrication of Amperometric Electrodes. J. Vis. Exp. (27), e1040-e1040 (2009).
- Lack, A. K., Diaz, M. R., Chappell, A., DuBois, D. W., McCool, B. A. Chronic ethanol and withdrawal differentially modulate pre- a....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
