采用快速扫描循环伏安法检测纹状体脑切片中的突触前多巴胺动态变化

摘要

利用快速扫描循环伏安法测量纹状体脑片中电刺激诱发的突触前多巴胺动态变化。

摘要

大量研究集中于神经递质多巴胺，因其在滥用药物（如可卡因和苯丙胺）作用机制中的重要性，其在精神疾病（如精神分裂症和注意缺陷多动障碍）中的作用，以及其在帕金森病和亨廷顿病等退行性疾病中的参与。在正常的生理条件下，多巴胺已知可调节运动活动、认知、学习、情绪影响以及神经内分泌激素的分泌。多巴胺神经元密度最高的区域之一是纹状体，该区域可分为两个不同的神经解剖学区域，即伏隔核和尾状壳核。本实验的目的是展示在小鼠纹状体中进行脑片快速扫描循环伏安法（FSCV）的一般实验方案。FSCV 是一种明确的电化学技术，能够在特定脑区实时测量多巴胺的释放与摄取。在 FSCV 中使用碳纤维微电极（直径约 7 μm）来检测多巴胺的氧化。利用 FSCV 检测多巴胺的分析优势在于其高达 100 毫秒的时间分辨率和小于十微米的空间分辨率，可为 in vivo 微透析提供互补信息。

方案

1. 实验基本要素

电极制备

• 由于大多数碳纤维微电极均为实验室自制，因此存在多种碳纤维微电极的制备方法。通常决定电极制备细节的是施加于电极的电化学技术（例如安培法与快速扫描循环伏安法FSCV）。对于FSCV，可采用以下三步法在实验室中自制微电极。有关碳纤维电极制备的更完整描述，请参见近期发表的JOVE文章¹。但需注意，下文所述电极为圆柱形碳纤维微电极，其制备步骤较上述方案中的安培法碳纤维微电极更少。该简化方案无需将碳纤维在丙酮中煮沸、无需对玻璃毛细管进行火焰抛光，也无需使用环氧树脂密封玻璃-纤维连接处。
• 使用真空负压将一根碳纤维（直径7 μm；Goodfellow，Oakdale，PA）吸入含微丝的硼硅酸盐玻璃毛细管中（长度10 cm，外径1.2 mm，内径0.68 mm；A-M systems，Carlsborg，WA）。
• 将装有碳纤维的毛细管放入电极拉制仪（Narishige，Tokyo，Japan）中，将其拉断成两半。不同实验室所使用的电极拉制仪参数设置各不相同。作为参考，我们使用的拉制参数为主磁铁90.7、副磁铁23.2、加热器53.4。应通过实验优化输出参数，以获得长度约为4.4 mm的玻璃锥形结构，并在碳纤维周围形成紧密密封。
• 在显微镜（Olympus，Tokyo，Japan）下，使用手术刀片修剪从玻璃尖端伸出的碳纤维，使约50–200 μm的碳纤维从密封良好的界面处露出。

溶液配制

需要提前配制三种人工脑脊液（aCSF）溶液，均使用超纯水（18 MΩ cm）配制。

• 蔗糖-人工脑脊液（sucrose-aCSF）可至少在切片前一日配制。蔗糖-人工脑脊液缓冲液的成分为（单位：mM）：180 蔗糖，30 NaCl，4.5 KCl，1.0 MgCl₂，1.0 CaCl₂，26 NaHCO₃，10 葡萄糖。₂，26 NaHCO₃₃，1.2 NaH₂PO₄，以及 10 D-葡萄糖（pH 7.4），并应使用 95% O₂ 氧合₂/5% CO₂₂ 15 分钟 ²若提前配制，溶液可在4 °C冷藏保存长达1周。
• 用于伏安法记录的 aCSF 溶液应在实验当天配制。aCSF 溶液的成分为（单位：mM）：126 NaCl，2.5 KCl，2.4 CaCl₂，1.4 MgCl₂，1.2 NaH₂PO₄，25 NaHCO₃，11.1 葡萄糖₂，1.2 MgCl₂，25 NaHCO₃₃，1.2 NaH₂PO₄，11 D-葡萄糖，0.4 抗坏血酸（pH 7.4）。实验过程中，通过通入95% O2/5% CO混合气体进行氧合₂ 在室温下
• 用于电极校准的改良 aCSF 溶液成分（单位：mM）为：2.5 KCl、126 NaCl、1.2 NaH₂PO₄、1.3 MgCl₂、2.4 CaCl₂、10 葡萄糖、25 NaHCO₃₂PO₄，2.4 CaCl₂，1.2 MgCl₂，以及 25 NaHCO₃₃ （pH 7.4），可在无需冷藏或充氧的条件下保存长达一周。

电极校准

• 使用含有3个端口并配备密封参比电极（Ag/AgCl）的流动“T型细胞”（t-cell），通过预校准和后校准分别确定电极的活性与灵敏度。将制备好的微电极插入流动“T型细胞”中。入口端连接至注射泵，使改良aCSF以2 mL/min的流速持续流过。T型细胞的第三个端口连接一支装有3 μM多巴胺（溶于改良aCSF中）的注射器。
• 进行预校准时，先让改良aCSF溶液流动约3–7秒，然后手动注入1–2 mL的3 μM多巴胺标准溶液。对每根需预校准的电极，重复校准至少3次，并取每次获得的最大电流值求平均。
• 在脑片伏安实验结束后（见第3节），立即以与上述相同的方式对电极进行后校准。
• 校准因子（后续数据分析中使用）通过将平均多巴胺氧化电流（nA）除以多巴胺标准溶液的浓度计算得到。例如，当使用3 μM多巴胺标准溶液时，将电流响应值除以3。

2. 切片制备

1. 将 10 mL 蔗糖 aCSF 倒入一个小烧杯中，并置于冰桶内。同时，将瞬干胶（Loctite 404）也放入冰桶中，以便取用。
2. 用酒精棉片擦拭清洁剃刀刀片以及解剖所需的工具，如镊子、刮匙和剪刀，做好准备。
3. 将小鼠置于小型气体室中，通过 CO₂ 窒息法处死，随后立即使用锋利剪刀进行断头。迅速取出整个脑组织，并将其放入盛有冰冻蔗糖 aCSF 的烧杯中，浸泡约 10 分钟。
4. 在此期间，准备振动切片机进行切片。首先，在样本槽中放入一些碎冰。安装样本室并拧紧固定，使其牢固就位。在样本室周围添加更多碎冰以填满空隙，注意避免冰块进入样本室内。将已清洁的剃刀刀片装入振动切片机的刀片夹中，并向样本室加入冰冻蔗糖 aCSF。
5. 为准备脑组织的工作面，将少量冷的蔗糖 aCSF 滴加到放置在倒置培养皿上的纸巾上。用镊子将脑组织转移至准备好的培养皿上。对于冠状切片，使用剃刀刀片沿内侧-外侧轴切除小脑并弃去。由此形成一个平坦的基底，可用于固定在振动切片机的载物台上。
6. 在样本载物台上滴加一滴步骤 1 中置于冰桶内的 Loctite 胶水。立即把脑组织的平坦端固定在载物台上，尽量保持其竖直。将载物台放入样本室中并拧紧螺丝，确保脑组织完全浸没在样本室的蔗糖 aCSF 中。
7. 通过振动切片机前面的控制装置调节载物台位置，使剃刀刀片与脑组织顶部对齐。将频率和速度均设为低档，以获得最佳切片参数。较低的速度有助于减少刀片对脑组织的挤压作用，而高速下常出现此类问题。切片厚度设定为 400 μm。
8. 最初的几片切片不包含纹状体。重复切片过程，直至获得含有纹状体的切片。一旦到达纹状体区域（通过解剖标志确认），使用毛笔小心提起切片，转移至盛有通氧、室温 aCSF 的烧杯中。通常可获得 3 至 4 片包含纹状体复合结构的切片，其中包含尾状壳核和伏隔核。
9. 将切片在室温下、通氧的 aCSF 中静置至少 1 小时，使其适应环境，之后方可用于实验。

3. 脑片伏安法记录

在切片孵育的同时，可准备切片记录室。

1. 取连接至浸没式记录室（Custom Scientific，丹佛，科罗拉多州）的管路，放入持续通氧、室温的aCSF中。将灌流泵（Watson Marlow Limited，法尔茅斯，英格兰）设置为1 mL/min的流速。将温度控制器设定为32 °C。当aCSF充满自制的脑片持留装置（经改装的网格圆盘载台）后，使用针头注射器（BD脊髓穿刺针）去除其中所有气泡，以准备放置脑片。
2. 通过使用注射器对流出管路（通向玻璃废液瓶）抽真空，启动灌流以预充填记录浴槽。在脑片持留装置边缘放置一片Kimwipe纸巾作为吸水芯，以控制缓冲液溢出。
3. 脑片孵育1小时后，将其转移至记录室内的脑片持留装置中，该装置持续灌流含有95% O₂/5% CO₂的室温aCSF。
4. 将Ag/AgCl参比电极浸入脑片持留装置中（用胶带固定在记录室盖上），并通过鳄鱼夹将其连接至前置放大器。
   • Ag/AgCl参比电极可自行制备：将一根250 μm银丝（A-M Systems，卡尔斯伯格，华盛顿州）在1 M HCl溶液中阳极氧化（+1 V，5分钟），使其表面沉积一层薄薄的AgCl。
5. 将钨刺激电极（Plastics One，罗阿诺克，弗吉尼亚州）缓慢下降至纹状体脑片表面。刺激电极与脑片表面接触即可，但不应刺穿脑片。在本实验装置中，刺激信号由Neurolog刺激器产生。
6. 使用BD脊髓穿刺针将150 mM KCl溶液反向填充至碳纤维工作微电极中。随后插入导线（Squires Electronics，科尼利厄斯，俄勒冈州），并通过鳄鱼夹连接至低噪声ChemClamp恒电位仪（Dagan Corporations，明尼阿波利斯，明尼苏达州）的前置放大器。工作电极放置于距离双极刺激电极约100–200 μm处，并深入脑片约75 μm。
7. 通过刺激电极施加单次（单相，350 μA，60 Hz，脉宽4 ms）或多次（例如5个脉冲，350 μA，20 Hz，脉宽4 ms）电刺激，以诱发神经递质释放³。
8. 为利用FSCV测量电刺激诱发的多巴胺释放，需向电极施加三角波形电压。典型的多巴胺检测参数如下：碳纤维微电极电位相对于Ag/AgCl参比电极维持在-0.4 V，线性扫描至+1.2 V正向极限，再返回-0.4 V，扫描速率为400 V/s。
9. 每5分钟进行一次电刺激，并对由此引发的多巴胺外排进行15秒的伏安法测量。
10. 在获得至少三次稳定的电刺激诱发多巴胺释放记录（峰值高度差异<10%）后，以1 mL/min流速向脑片灌流含有目标药理学试剂的aCSF，持续30分钟以达到最大效应。在药理学试剂灌流期间，每5分钟进行一次电刺激诱发的多巴胺释放记录。

4. 数据分析

从脑片获得的电流随时间变化的曲线可通过非线性回归拟合为一组基于米氏方程的公式，该方法由Wightman及其同事在LabVIEW软件（National Instruments，Austin，TX）中实现^4-6。在该软件中，可通过调整两个参数来拟合电流-时间曲线：V_max（nM/s；对应于多巴胺转运体的摄取速率，由曲线下降相反映）和每脉冲多巴胺浓度（nM；对应于曲线峰值高度）。K_m值反映多巴胺对多巴胺转运体的亲和力，设定为160 nM且保持不变。拟合前需输入实验后确定的电极校准系数。LabVIEW软件包含可决系数（R²）参数以评估拟合优度（通常采用R²值> 0.8的结果）。

5. 代表性结果

采用快速扫描循环伏安法（FSCV）检测小鼠尾状壳核（CPu）、伏隔核（NAc）核心区及NAc壳区中单脉冲电刺激诱导的多巴胺释放与再摄取。图1A所示代表性结果为电流（或浓度）随时间变化的曲线图。红色箭头指示对脑片施加电刺激的时刻，随后在碳纤维微电极处检测到与多巴胺浓度变化相关的电流相应上升。电刺激期间的主要过程为多巴胺释放，但其他过程如再摄取和扩散也会影响观测到的峰值高度。峰值下降阶段主要归因于神经递质通过其转运体的再摄取，因为神经元刺激已经停止⁷。然而，峰值衰减不仅限于再摄取过程，扩散和代谢同样会导致电流下降。有研究推测，由于电化学测量的时间尺度为数秒量级，FSCV的时间分辨率过快，难以检测到代谢过程的贡献⁷。在这些电流-时间曲线中，通过实验后校准因子将纵轴转换为浓度（μM）。图1A插图为对应电流-时间曲线经背景扣除后的循环伏安图。将测得的电流（纵轴）对施加于电极的电位（横轴）作图，可化学鉴定多巴胺：相对于Ag/AgCl参比电极，在+0.6 V处观察到氧化峰，而在-0.2 V处观察到多巴胺邻醌的相应还原峰。数据的第三种呈现方式为三维伪彩色图（图1B），整合了电流-时间曲线与循环伏安图的信息，形成单一图像。在代表性伪彩色图中，横轴表示时间（秒），纵轴表示施加于碳纤维工作微电极的电压，电流则以伪彩色形式表示（z轴）。由于碳纤维微电极尺寸较小（直径约7 μm），可在纹状体的不同解剖区域（CPu、NAc核心区与NAc壳区）分别检测电刺激诱导的多巴胺动态变化（图2）。

使用纹状体冠状切片的一个优势在于，它消除了多巴胺能神经元胞体的贡献，从而能够研究突触前多巴胺的动力学过程。如其他研究已表明的，突触前对多巴胺释放和再摄取的调控并不仅限于多巴胺自身受体或转运体的功能^{16, 17}。其他神经递质系统的异源受体也能调节多巴胺的动力学^{18, 19}。图3A所示的典型电流-时间曲线显示，当切片用1 μM的喹吡罗（D2/D3受体激动剂）处理30分钟后，电刺激诱发的多巴胺释放量减少。相反，当以甲基苯丙胺等多巴胺转运体底物灌注切片30分钟时，多巴胺释放未见明显变化（图3B）。其峰值衰减速率向右偏移，这通常与多巴胺转运体动力学参数（K_m）的改变相关³。最后，图3C为切片在100 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）溶液中孵育后的典型电流-时间曲线，已有研究假设BDNF可影响多巴胺释放的动力学过程^{20, 21}。从该代表性曲线可见，BDNF能够增强电刺激诱发的多巴胺释放。综上所述，这些药理学处理手段突显了快速扫描循环伏安法（FSCV）在探究纹状体内多巴胺动力学方面的应用价值。

使用脑片通过快速扫描循环伏安法（FSCV）研究突触前多巴胺动态的主要局限性在于，完整大脑中的神经环路已被破坏。在脑片FSCV中，无法研究来自其他脑区的神经递质的影响，因而难以理解这些系统对所研究脑区（例如纹状体）功能的作用，也无法评估非刺激状态下的多巴胺水平。然而，近年来FSCV技术的进步已实现在自由活动的大鼠中检测多巴胺瞬时变化（无论是否施加电刺激），以响应药理学干预、自我给药或新奇刺激^{22 - 24}。总体而言，脑片FSCV为突触前多巴胺动态提供了重要信息，将脑片FSCV结果与微透析、电生理学和/或自由活动FSCV等互补的神经化学技术相结合，可更全面地揭示大脑中神经递质的功能机制。

图1. 使用FSCV在C57Bl/6J小鼠背侧CPu脑片中，通过单脉冲刺激诱发的多巴胺释放的电化学检测结果。（A）多巴胺浓度随时间变化的曲线，其中单脉冲刺激（红色箭头）诱发多巴胺释放。单个星号表示导致浓度上升的因素，主要为多巴胺释放，但再摄取和扩散也有贡献。双星号表示信号峰值恢复至基线水平，主要归因于再摄取，扩散亦有作用。插图显示相应的循环伏安图。（B）来自背侧CPu的代表性彩色图谱，显示时间（x轴）、施加于碳纤维微电极相对于Ag/AgCl参比电极的电位（y轴）以及以伪彩色表示的电流强度。

图 2. 在 C57Bl/6J 小鼠的伏隔核（NAc）核心与壳区，由单次电刺激脉冲（红色箭头所示）诱发的多巴胺释放。（A 和 C）NAc 核心与壳区的浓度-时间曲线及其相应的循环伏安图（插图）。（B 和 D）如前所述，NAc 核心与壳区的代表性彩色图谱。

图3. 脑片经药物处理30分钟后的代表性记录；所有情况下均使用单次脉冲刺激诱发尾壳核（CPu）中的多巴胺释放。（A）多巴胺D2受体激动剂喹吡罗处理后（红色迹线）与处理前（黑色迹线）的比较。（B）甲基苯丙胺灌注后（紫色迹线）与处理前（黑色迹线）的比较。（C）脑源性神经营养因子（BDNF）对多巴胺动态调节作用的记录（蓝色迹线）与处理前（黑色迹线）的比较。

讨论

本文所述方案演示了如何制备和使用小鼠冠状脑切片进行FSCV实验。尽管该方法主要用于获取和测量多巴胺动态变化，但其他神经递质如腺苷、过氧化氢、去甲肾上腺素和5-羟色胺也已通过FSCV在体（in vivo）或离体（in vitro）条件下实现监测^{3, 8 - 11}。通过简单调整施加于工作电极的电压波形，FSCV即可用于监测其中部分其他神经化学物质^{3, 11}。由于这些神经化学物质中的许多具有相似的氧化电位，所生成的循环伏安图可为每种可氧化物质提供独特的化学指纹图谱，从而实现化学物质的鉴定。此外，FSCV已在多种物种中得到应用，从果蝇到非人灵长类动物，以更深入地理解这些模式生物中的神经传递过程^{12 - 15}。FSCV之所以能在如此多样的物种中被广泛应用，主要原因之一在于碳纤维微电极的直径极小，通常小于7 μm。因此，这些微电极能够从非常微小的环境中取样，例如果蝇脑组织（纳升级体积），或在较大物种中区分精细的亚解剖区域，如伏隔核（NAc）的核心区与壳区^12-14。

综上...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Potassium Chloride	Fisher Scientific	7447407
Sodium chloride	EMD Millipore	7647145
Magnesium chloride	Fisher Scientific	7791186
Calcium chloride	Fisher Scientific	10035048
Sodium bicarbonate	EMD Millipore	144558
Sodium phosphate,Dibasic	EMD Millipore	7558794
D-glucose	Fisher Scientific	50997
Ascorbic acid	Fisher Scientific	50817
Sucrose	Fisher Scientific	57501
Carbon fiber	Goodfellow
Glass capillary	A-M Systems	602000
Silver wire	A-M Systems	787000
Tungsten stimulating electrode	Plastics One
Platinum wire
Lead wire	Squires Electronics, Cornelius, OR
Loctite 404 instant adhesive	Hankal Corp.
Razor blade	World Precision Instruments, Inc.
BD Spinal needle	BD Biosciences	REF 405234
Surgical Blade	Feather Safety Razor Co, Ltd.
TH software	ESA Inc.,Chelmsford, MA
Submersion recording chamber	Custom Scientific
Neorolog stimulus isolator	Digitimer Ltd.	NL800A
Automatic temperature controller	Warner Instruments
Microscope (SZX7)	Olympus Corporation
Microscope	Fisher Scientific
Vibratome 3000 sectioning system	St. Louis , MO.
Perfusion pump	Watson-Marlow Pumps Group	H110708
Micropipette puller	Narishige International
ChemClamp potentiostat	Dagan Corporations