本实验方案展示了如何通过重复使用Invitrogen Nupage Novex微型凝胶盒以及在家居装修商店购买的廉价材料，同时制备多块蛋白质凝胶。这种经济且高效的流程还包括将凝胶在4°C下保存数周的方法。通过重复使用商业凝胶中的塑料凝胶盒，频繁进行蛋白质凝胶电泳的实验室可显著节省成本，并有助于环境保护。
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本文内容
摘要
摘要
采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析对蛋白质进行检测是生物化学与分子生物学研究人员常用的技术1-4对于每天进行蛋白质分析的实验室而言， commercially available polyacrylamide gels 的成本˜$10/胶）长期累积也是一笔可观的开支。为降低此项成本，一些研究人员选择自行制备聚丙烯酰胺凝胶。传统的凝胶制备方法通常需要使用专用设备和玻璃胶板，而这些材料价格较高，且限制了同时制备和储存多块凝胶用于后续实验的能力。此外，在清洗或灌胶过程中操作玻璃板时可能发生意外破碎，造成安全隐患，因而可能不适用于本科生实验课程。本实验方案展示了如何利用回收的Invitrogen Nupage Novex微型胶盒以及从家装商店购买的低成本材料，同时制备多块蛋白凝胶。该经济高效的方法还包括在4℃条件下储存凝胶的步骤°几周后。通过重复使用市售凝胶中的塑料胶盒，频繁进行蛋白质凝胶电泳的实验室可以显著节省成本并减少环境污染。此外，塑料胶盒具有极强的抗破损性，非常适合本科教学实验室使用。
方案
1. 准备受盒
- 清洗已使用过的 Invitrogen Nupage Novex mini胶盒或其它商用mini胶盒的前板和后板。
- 根据制造商说明，配制约1–3 ml的塑料环氧树脂并充分混合。
- 将环氧树脂涂于前板内侧边缘，该位置为胶盒组装时前后板相互接触的区域。
- 在组装胶盒时，将一片滤纸或硬纸板从后板底部的狭缝中插入，以防止多余的环氧树脂封住开口；待前后板组装完成后立即取出滤纸。
- 在胶盒边缘夹上文件夹夹以确保紧密密封，并将胶盒静置过夜，使环氧树脂完全固化。
- 用绝缘胶带密封后板底部的狭缝。
2. 灌制分离胶
- 取一个 125 ml 的侧臂烧瓶，加入以下成分：2.25 ml 的 4X Tris-碱分离胶缓冲液（pH 8.70）、3.50 ml 的 30.8% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液、3.25 ml 的 I 型试剂级水（IRG-H2O），总体积为 9 ml。
- 将烧瓶的侧臂连接至真空装置，并在烧瓶口倒置一个塞子，对溶液抽气 10 分钟以去除溶解氧。
- 将 9 ml 脱气后的溶液转移至一个 50 ml 的一次性聚丙烯离心管中，加入 30 μl 的 10% 过硫酸铵（APS）和 6 μl 的 N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED），轻轻旋转混匀，避免引入气泡。
- 立即将溶液倒入凝胶夹心中，使其沿夹心一侧流下，防止胶板之间产生气泡。灌胶至前侧（较短）玻璃板顶部边缘下方约 2 cm 处。
- 轻柔地在胶面上覆盖 0.5 ml 用 1X 分离胶缓冲液饱和的 1-丁醇，并静置 1 小时使凝胶充分聚合。
3. 灌注浓缩胶
- 向一个125 ml的侧臂烧瓶中加入以下成分：0.75 ml pH 6.80的4X Tris-碱浓缩胶缓冲液、0.40 ml 30.8%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液、1.85 ml IRG-H2O，总体积为3 ml。
- 按照步骤2所述，对溶液脱气10分钟。
- 在浓缩胶溶液脱气的同时，倒掉分离胶顶部已用1X分离胶缓冲液饱和的1-丁醇。用IRG-H2O冲洗分离胶顶部一次，然后倒掉水，并用吸水纸或Whatman滤纸吸除残留液体。
- 取出3 ml已脱气的溶液，加入9 μl 10%过硫酸铵（APS）和2 μl TEMED，充分混匀。
- 迅速将溶液倒入胶板夹心中，使其沿夹心侧壁流下，直至接近较短前玻璃板的顶部边缘。
- 将干净的梳子插入凝胶夹心顶部，并在梳子上方的夹心处夹上一个文件夹夹子以固定梳子。让浓缩胶聚合1小时至过夜。
4. 凝胶的保存
- 当凝胶完全聚合后，取下回形夹，将凝胶夹心放入可热封的塑料袋或可重复密封的塑料袋中。
- 向袋中加入20 ml含有0.1%叠氮化钠的1×浓缩胶缓冲液。
- 将袋子热封5秒，并确保袋子无泄漏。
- 将凝胶保存在4°C环境中。
5. 样品制备
- 在薄壁微量离心管中，加入最多 6.5 μl 蛋白质样品、7.5 μl 2x Novex Tris-Glycine SDS 上样缓冲液、1 μl 100 mM 二硫苏糖醇（DTT），以及 IRG-H2O（如需要），总体积为 15 μl。
- 通过涡旋混匀样品，并短暂离心，使管内液体全部沉降至管底。
- 在 70°C 下变性样品 10 分钟。
6. 电泳运行
- 安装 Novex 胶装置。
- 向内槽加入含有 500 μl Nupage 抗氧化剂的 200 ml Tris-甘氨酸电泳缓冲液，向外槽加入 300 ml Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
- 使用加样枪头将变性蛋白样品（15 μl）加入胶孔中。
- 以 200 V 电压电泳 60–70 分钟。
7. 染色凝胶
- 从电泳装置中取出凝胶板，用凝胶刀或硬质油灰刀撬开两片塑料凝胶板，破坏环氧树脂密封。小心地将凝胶从板上分离，注意不要撕裂凝胶。
- 用去离子水（IRG-H2O）轻轻振荡洗涤凝胶三次。
- 用 Invitrogen SimplyBlue SafeStain 染色液对凝胶染色1小时，期间轻轻振荡。
- 倒掉染色液，用去离子水（IRG-H2O）对凝胶进行脱色。
8. 清洗盒式容器
- 使用金属刮刀刮除或剥离盒式夹具上的所有环氧树脂，以便重复使用。
- 用温和的洗涤剂溶液清洗每一块塑料凝胶板，然后用自来水充分冲洗，再用蒸馏水冲洗。
9. 代表性结果
由于环氧树脂会形成防水密封（如图1所示），在将丙烯酰胺溶液倒入胶盒时不会发生泄漏。此外，凝胶胶盒可轻松打开以取出凝胶进行染色，且环氧树脂可从胶盒上剥离，从而实现胶盒的重复使用。如图2所示，凝胶显示出蛋白Marker和样品条带的清晰分离，适用于常规蛋白质电泳。
图1. 使用环氧树脂密封微型凝胶夹心盒的应用。 在组装之前，将一层薄薄的环氧树脂涂覆于其中一个夹心盒的边缘。为突出显示环氧树脂，本图中将其伪染为红色。
图 2. 使用重复利用的微型凝胶盒制备的 SDS-Tris-甘氨酸凝胶对蛋白质进行分离。 按照上述方法进行 SDS-PAGE 电泳。电泳完成后，将凝胶从微型凝胶盒中取出，按照生产商说明书用 SimplyBlue SafeStain 染色，并使用透射白光拍摄图像。泳道 M 含有 SeeBlue Plus2 预染蛋白质标准品。泳道 M 中蛋白质的分子量以千道尔顿（kDa）为单位标注在凝胶右侧。其余泳道显示的是表达谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签蛋白的细菌裂解液上清中的蛋白，这些蛋白是在洗脱 GST 标签蛋白之前从谷胱甘肽磁珠上洗脱下来的蛋白质。
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讨论
蛋白质凝胶电泳是大多数分子生物学实验室不可或缺的一种方法。市面上可购买的迷你凝胶系统提供了高度的便利性，但成本较高。本文介绍如何重复使用一种常见品牌的商用迷你凝胶盒（minigel cassette）。该方法保留了预制凝胶来源的便利性，同时成本仅为商用迷你凝胶的一小部分。此操作中的关键步骤是在加入未聚合的丙烯酰胺之前，使用适量的环氧树脂完全密封凝胶盒，以防止泄漏。仅使用适用于塑料的环氧树脂，并按照制造商说明书的要求留出足够时间使环氧树脂充分聚合。为了进一步提高便利性，可在灌制凝胶前预先密封多个凝胶盒并储存备用。在灌制分离胶时，务必为浓缩胶预留足够的空间，通常应比用于形成加样孔的梳子高度多出约0.5 cm。在分离胶聚合过程中，应将凝胶保持直立状态，以便缓冲液饱和的1-丁醇在分离胶顶部形成平整的界面。如果凝胶在30分钟内未能完成聚合，可适当增加10%过硫酸铵（APS）和TEMED的用量。电泳结束后，需小心地打破环氧树脂密封，以避免撕裂薄而脆弱的凝胶。本文所述的重复使用商用凝胶盒的方法，可显著降低频繁进行SDS-PAGE实验所产生的成本。同一凝胶盒可重复使用多年，我们尚未发现重复使用会降低其可用性。此外，可预先制备多块凝胶，并将其储存在含有少...
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致谢
作者感谢霍华德·休斯医学研究所为 A.H. 提供的 UF Science for Life 奖项。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | 提供 2、5、10、12、15 和 2D 孔规格 |
| 塑料环氧树脂 | Loctite | 108771 | |
| 绝缘胶带 | Scotch Co. | ||
| 125 mL 带侧臂烧瓶 | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base 分离胶缓冲液 | 1.5 M Tris-Base，pH 8.7 | ||
| 丙烯酰胺 | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| 双丙烯酰胺 | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% 丙烯酰胺溶液 | 丙烯酰胺:双丙烯酰胺 = 30:0.8，溶于 IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g 过硫酸铵溶于 1 ml IRG-H2O，使用前立即配制 |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 用 1X 分离胶缓冲液饱和的 1-丁醇 | 1-丁醇:1X 分离胶缓冲液 = 5:2 | ||
| 4X Tris-Base 浓缩胶缓冲液 | 1.5 M Tris-Base，pH 6.8 | ||
| 凝胶梳 | Invitrogen | NC3015 | 15 孔，1.0 mm 厚度 |
| 脉冲封口机 | TEW Electric Heating Equipment | ||
| 可热封袋 | Kapak/Scotchpak | 1 品脱尺寸 (6.5" x 8") | |
| 凝胶储存缓冲液 | 含 0.1% 叠氮化钠的 1X 浓缩胶缓冲液 | ||
| Novex SDS Tris-甘氨酸上样缓冲液 (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-甘氨酸电泳缓冲液 | Invitrogen | LC2675 | 1L 10X 储存液：29.0 g Tris-Base，144.0 g 甘氨酸，10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| 凝胶切刀 | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue 安全染色液 | Invitrogen | LC6065 |
参考文献
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
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重印与许可
