通过双光子成像检测小鼠大脑皮层内源性NADH荧光以识别微区域缺氧

摘要

本文介绍了一种直接可视化小鼠皮层微区域组织缺氧的方法 在体该方法基于对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和皮层微循环的同时双光子成像，适用于组织氧供应的高分辨率分析。

摘要

大脑在高代谢需求下维持正常功能的能力依赖于通过血流和组织氧扩散提供的持续氧气供应。本文介绍了一种可视化实验与方法学方案，用于直接观察小鼠皮层组织的微区域缺氧状态，并推断血管周围氧梯度。该方法基于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）内源性荧光强度与组织中氧分压之间的非线性关系：当组织氧水平低于10 mmHg时，观测到的NADH荧光强度会急剧升高¹。我们采用740 nm的双光子激发，可同时激发内源性NADH组织荧光，并利用Texas-Red标记的葡聚糖对血浆进行对比成像。该方法相较于现有技术具有以下优势：利用组织自身信号，可在标准的双光子活体成像设备上实施；可在整个视野范围内连续监测，深度分辨率达约50 μm。我们证明，距离脑血管最远的脑组织区域对应于易受损的分水岭区域，这些区域在血管供氧减少时最先出现功能性缺氧。该方法可用于成像皮层微区域的氧合状态，因此在研究神经血管疾病和脑卒中中组织供氧不足或受限所起作用方面具有重要应用价值。

方案

1. 准备用于成像的动物

注意：我们使用成年c57BL小鼠。可根据研究问题选用不同的转基因品系。白毛小鼠（如FVB品系）更便于进行微血管手术和脉搏血氧监测。

1. 在实验台上准备手术区域。所有手术器械均需经过高压灭菌或使用70%乙醇消毒。
2. 插入直肠探头，并在整个操作过程中持续监测动物的体温。
3. 使用初始浓度为5%的异氟烷对小鼠进行麻醉。15–30秒后，当动物不再活动时，将其置于加热垫（37 °C）上，并连接面罩以持续吸入含1.3–1.5%异氟烷的空气。确保动物对疼痛刺激（例如尾部夹捏）无反应。
4. 使用人工泪液凝胶覆盖小鼠眼睛，以防止角膜暴露于干燥空气中。
5. 使用电动剃刀去除头部及双侧大腿的毛发。在大腿部位涂抹脱毛剂（例如Nair）2分钟，然后仔细擦拭以清除残留毛发。该大腿部位将用于血氧监测。
6. 使用10%聚维酮碘溶液和70%乙醇对头皮进行消毒。

2. 制备开颅颅窗

1. 从颅骨尾侧5 mm处开始，用剪刀在头皮上做切口，并向前推进1厘米。将皮肤向两侧推开，暴露颅骨。
2. 为去除颅骨表面的膜，将10%氯化铁溶液涂抹于颅骨顶部。擦去多余溶液，用45°角的#5镊子刮除膜组织。必须仔细准备手术区域，以确保头板能够牢固地固定在颅骨上（见步骤4至6）。
3. 使用解剖显微镜确定感兴趣区域。注意应避开颅骨缝线，因为沿这些线钻孔时颅骨可能不可预测地破裂。
4. 在头板窗口边缘涂一层薄薄的快速胶水（例如Loctite 454）。将头板放置在适当位置，使感兴趣区域暴露于窗口中。对头板施加轻压。加入少量牙科水泥以加速胶水聚合。在胶水聚合期间保持按压10秒。
5. 在窗口边缘涂少量快速胶水，以密封头板与颅骨。在解剖显微镜下将头板拧紧至动物固定装置上。
6. 将Microtorque II钻机设定为6000 rpm，使用IRF 005钻头，清除颅骨和头板上所有多余的胶水。必须清除头板上残留的任何胶水，否则会影响玻璃盖片的安装。
7. 将钻机转速设为1000 rpm，开始在头板窗口内钻孔，形成直径约5 mm的圆形区域。操作时采用轻扫动作，如同用极软的铅笔作画。每钻20-30秒暂停一次，用压缩空气清除骨屑。
   注意：头板上的开孔形状可为钻头提供更多操作空间（适用于左利手和右利手操作者），便于制作圆形颅窗。此外，两个异形孔提供了必要的空间，可用于在颅窗下方脑组织中插入Clark电极或玻璃电极，进行额外的极谱或电生理测量。
8. 随着钻孔进行，中心完整颅骨周围会形成一圈均匀厚度的凹槽。注意不要刺穿已变薄的颅骨，而应保持该凹槽厚度一致。在大血管附近需格外小心——不得损伤这些血管，最好甚至避免接触。
9. 使用#3镊子的一个尖端抬起（“弹掉”）窗口中心的骨片。在窗口上滴加一滴人工脑脊液（aCSF）。
10. 用柔软纸巾（例如Kimwipe）的一角轻轻擦拭aCSF。通常在窗口边缘的一处或多处硬脑膜会受损。从其中一个损伤点开始，使用45°角的#5镊子轻轻抬起并移除脑表面的硬脑膜。选择开始剥离硬脑膜的位置时，应避开大血管邻近区域。若发生出血，滴加一滴aCSF，并等待2-3分钟，待轻微出血停止。
11. 配制0.07%低熔点琼脂糖溶液（溶于aCSF中），将熔化的琼脂糖加热至体温。用纸巾轻轻吸去脑表面多余的aCSF。将琼脂糖倒入窗口内，覆盖盖玻片。轻压盖玻片，使其与头板接触，静置10-20秒直至琼脂糖凝固。
12. 使用镊子和柔软纸巾清除盖玻片上多余的琼脂糖。
13. 在玻璃盖片周围涂少量快速胶水，将玻璃固定于头板上。再涂少量牙科水泥以加固胶水（见图1）。

3. 静脉注射与血氧监测

注意：我们通常使用股静脉而非尾静脉进行德克萨斯红染料的静脉注射。原因是股静脉注射能够安全且可重复地实现染料的团注。

1. 将动物部分翻转，暴露左侧大腿内侧。用胶带将动物固定在此位置。
2. 对皮肤进行消毒液擦洗，然后使用100%乙醇。
3. 沿大腿内侧从膝部至耻骨联合做一切口。使用5号镊子通过钝性分离法分离软组织。
4. 用1 ml注射器吸取130 μl Texas Red（2.5 mg/ml）。安装新针头（30号），小心将其弯曲30°，保持斜面朝上。用Texas Red溶液充满针头。
5. 在解剖显微镜下，将针头插入股静脉，注射100 μl Texas Red。拔出针头后，用纱布轻轻按压静脉以止血。
6. 使用4-0缝线缝合皮肤。
7. 为持续监测血氧饱和度SpO₂（以确保充分的血液氧合），将血氧仪探头置于右侧大腿（此前已去除毛发）。

4. 双光子成像

注意：我们使用Olympus Fluoview1000多光子成像系统（直立式），以Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee飞秒Ti:Sa激光器作为激发光源。成像时采用×10 NA 0.45（Zeiss C-Apochromat）或×25 NA 1.05（Olympus XLPlan N）水浸物镜。图像采集参数为12位深度，分辨率为512 × 512像素，像素驻留时间为2 μs。NADH和Texas-Red-葡聚糖在740 nm处同时被激发，荧光信号通过二向色镜/近红外阻挡滤光片组合（FF665-Di01；FF01-680/SP，Semrock，美国纽约州罗切斯特）与激发光分离，再通过另一二向色镜（505DCXRU，Chroma，美国佛蒙特州罗金厄姆）分为两个通道，并经带通滤光片过滤（NADH：Semrock FF460/80；Texas-Red-葡聚糖：Semrock FF607/36）。物镜后测得的激光功率在I层成像时为10–20 mW，在II层成像时为20–50 mW。

1. 将手术准备好的小鼠转移至显微镜载物台上。使用4倍放大倍率的明场照明拍摄颅窗部位的初始图像，作为参考图谱，用于与高倍率双光子血管造影图像进行配准。
2. 使用10倍放大倍率放大至目标区域。在皮层I层或II层（软脑膜表面下方最多150 μm）选择感兴趣区域。如需更高放大倍率，可使用25倍物镜。
3. 开始记录时间序列图像（图2）。建议对平均3–5帧进行采集，以提高图像质量。
4. 通过向动物呼吸的空气中加入50% N₂诱导低氧血症，使氧气浓度降至10%。通过监测血氧仪数据确认低氧血症状态。
5. 在低氧血症期间（例如持续30秒）及恢复正常氧气水平后，继续记录时间序列图像。
6. 通过检测、测量和量化血管周围缺氧区域及富氧组织柱的面积，收集数据以计算氧分布情况。

5. 数据处理

1. 确定克罗格组织圆柱半径 R。可通过手动方式（图3）测量血管中心与检测到高NADH荧光信号边界之间的距离来完成。
2. 或者，可采用先前已描述的¹计算化、无需研究者干预的半自动化方法来确定组织圆柱半径 R 及中心血管半径 r，该方法以补充材料形式提供，并在本实验方案的讨论部分进行了概述。
3. 使用开源图像分析软件（例如 ImageJ）确定缺氧区域面积。具体操作为：利用 NADH 信号，设定一个可界定高 NADH 强度区域的阈值，随后测量 NADH 组织荧光增强区域的面积。

6. 代表性结果

图2 显示了短暂低氧血症期间的NADH/血管造影图像视频（对于该图的PDF版本，已选用部分静态图像）。吸入氧浓度从21%降低至10%，持续3分钟。这种实验性诱导的低氧血症程度足以在大脑皮层中引发严重缺氧。缺氧导致NADH荧光增强，最初出现在距离动脉血液供应最远的区域。请注意清晰的NADH组织边界，这些边界代表了皮层微循环中氧气扩散的可观测组织边界。图3 中的图像显示了围绕脑血管的氧气扩散边界的几何形态。如先前所述¹，可通过这些边界推导出Krogh圆柱体的直径。

图 1. （A）已制备颅窗用于成像的小鼠。（B）头板的尺寸。

图 2. 通过颅窗利用双光子成像观察到的内源性 NADH 绿色荧光，成像深度约为软脑膜表面下 50 μm。血管结构使用 Texas Red 葡聚糖进行标记。吸入空气中的氧气浓度先降低至 10% 持续 3 分钟，随后恢复至 21%。比例尺：50 μm。

图 3. NADH 荧光边界的几何结构。黄色轮廓显示功能性缺氧区域的边界；蓝色圆圈表示投影的富氧（Krogh）圆柱体。蓝色线条表示圆柱体半径；数字表示以微米为单位的半径值。

讨论

关于氧气扩散的高空间分辨率信息，对于理解脑血流如何被调控以向脑细胞供氧并满足代谢需求至关重要。传统的采用克拉克型玻璃电极的极谱法氧含量测量具有高度侵入性，空间分辨率低^2-3，且响应时间较长（达秒级）。迄今为止，测量脑组织中pO₂的唯一非侵入性方法是磷光淬灭法，该方法中激发态探针的衰减速率与氧浓度成正比⁴。该方法可提供准确的氧浓度数据，但需要专用染料以及技术复杂的磷光寿命成像系统。本文中，我们展示了一种直接且更简便的方法，可在配备两个荧光通道的标准双光子成像系统上实施。该方法利用了组织的内源性信号⁵，仅需对皮层微循环进行对比可视化即可。由于在功能受限的氧浓度下，NADH荧光呈现非线性、近乎二元式的增强¹，因此仅在存在显著且代谢受限的缺氧区域才可观察到内源性NADH荧光的增强。一个重要推论是，皮层微血管周围氧气扩散的组织边界可通过呈圆柱形分布的内源性NADH荧光强度变化直接观察到。我们将这些结构称为克罗格圆柱体（Krogh cylinders），因为由August Krogh提出的、定义血管周围氧合组织体积的圆柱形结构概念，近期已通过双光子NADH成像实验观测到¹。通过采集Z轴层扫图像序列，可获得Krogh圆柱体的三维图像。这些结构在穿支小动脉附近尤为明显，并与毛细血管稀疏的动脉周围组织圆柱体相一致^1,4。

为了客观地确定Krogh组织圆柱半径R（见第5.2节），我们使用Matlab函数“improfile”测量了从圆柱中心到外边界之间明确定义的线段内的径向像素强度值。该线段的外边界应选择为超出可见边界一定安全范围的位置。为提高信噪比，我们对以1°步长覆盖整个可见圆柱段所需的所有径向线条的强度值进行了平均。所得线段内的平均径向强度分布呈现出明显的上升陡坡，该陡坡对应于可见的组织边界R。随后，我们将一个S型函数（例如Boltzmann函数）拟合至平均后的径向强度分布，并将其拐点（也称为x₀）作为R的定义。相应的双光子微血管造影（Texas-red）显示了位于圆柱中心的一条孤立中央血管的横截面。中央血管的直径可直接用于确定r。

双光子NADH成像可提供与同步高分辨率皮层微血管造影相同的空間分辨率。该方法用于定量分析的一个重要特征是，NADH荧光增强的p₅₀值已被测定为3.4 ± 0.6 mm Hg¹，且NADH荧光强度随微区组织pO₂的变化可用S型函数进行数学描述。我们证明，该技术可用于识别在低氧条件下最易受损的脑区（通过将空气中氧含量降低至10%）。我们还证明，氧的扩散遵循简单的几何化血管周围模式。

该方法的一个关键步骤是颅窗制备的质量。手术应尽量减少损伤，以避免干扰暴露区域的血液供应。需要注意的是，如果手术操作不当，颅窗下的皮层可能从实验开始就处于缺氧状态，从而无法进行任何有意义的实验。一个制备良好的颅窗应保留完整的主要和次要血管，所有类型的血管均呈现清晰的血流，且边缘无明显出血。在正常氧条件下（PaO₂ 80-100 mmHg，SpO₂ 97-99%），脑实质应表现出均匀一致的NADH荧光，不应出现明显的、NADH荧光增强的明亮组织区域。

本方法的一个基本物理限制是穿透深度有限。脑组织中蓝绿色的NADH荧光在这些波长下会因血红蛋白吸收和组织散射而迅速衰减。即使使用高数值孔径（例如1.05）的水浸物镜，双光子NADH成像目前也仅限于皮层I层和II层。这一限制具有重要的科学意义，因为白质内部或邻近区域的能量代谢可能与灰质存在差异。然而，若要研究更深的皮层结构（如IV-VI层）或皮层下结构（如白质纤维束或纹状体），则需要采用如在活体小鼠皮层中所描述的特殊微透镜技术⁶。

基于NADH的氧气扩散边界测量方法在与其他测量手段（如功能性充血分析和毛细血管通量速率检测）结合时尤为有用⁷。例如，该技术可被调整 用于可视化中风和阿尔茨海默病（AD）模型中的缺氧情况。由于氧气扩散具有简单的几何特性，因此可以在毛细血管密度降低的情况下（例如AD⁹）预测微血管床中的氧梯度⁸，并检验毛细血管密度降低的脑组织区域是否因微梗死而面临更高的缺氧损伤风险。该成像技术具备微区分辨能力，还可用于研究组织微梗死的几何形态和大小，确定发生缺氧的组织体积，以及分析组织缺氧与后续神经元死亡或毛细血管重塑之间的关系¹⁰。

最后，由于内源性NADH荧光的增加是急性线粒体功能障碍的直接结果，该方法为利用NADH成像作为神经能量代谢的特异性报告手段¹¹以及线粒体功能障碍的间接指标提供了可能。

总之，内源性NADH荧光的双光子成像是一种简单且易于实现的技术，可用于研究在正常和病理状态下脑组织中的氧气输送与消耗。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
加热垫	超越体热
眼用软膏（人工泪液）	辉瑞制药有限公司
聚维酮碘 10% 溶液	Betadine Puredue Pharma
10% 氯化铁溶液
水泥	斯托尔廷公司	51456
氰基丙烯酸酯 454	Loctite
aCSF	哈佛仪器	597316
Microtorque II 手柄套件	皮尔逊评估	R14-0002
IRF 007 钻头	Fine Science Tools	19008-07
镊子 #5	Fine Science Tools	11295
5/45号镊子	Fine Science Tools	11251-35
#0 玻璃盖玻片	电子显微镜科学公司	63750-01
光电倍增管	滨松公司	HC125-02
Ti:Sapphire 激光器 Mai-Tai	Newport公司