γ-疱疹病毒（γ-HVs）可在其宿主中建立终身持续性感染。利用γ-HV68感染小鼠为研究该病毒提供了可进行遗传学操作的模型。 体内 用于表征γ疱疹病毒（γHVs）生命周期/致病机制的模型。本实验方案描述了通过噬斑形成、感染中心及定量PCR检测方法，在急性期和潜伏期感染阶段对γHV68感染进行检测与定量分析。
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摘要
摘要
γ-疱疹病毒（γ-HVs）因其能够建立淋巴样细胞的潜伏感染而备受关注1。人类γ-HVs（如EBV和KSHV）宿主范围狭窄，严重阻碍了对其致病机制的深入研究。小鼠γ-疱疹病毒68型（γHV68）在基因和生物学特性上与人类γ-HVs具有高度相似性，且是鼠科啮齿类动物的天然病原体2。因此，通过评估不同病毒感染阶段下近交系小鼠对γHV68的感染情况，可为理解γ-HVs感染过程中病毒生命周期及致病机制提供重要模型。
经鼻腔接种后，γHV68 感染可在肺部引起急性病毒血症，随后转变为脾细胞及其他细胞的潜伏感染，这种潜伏感染可在宿主一生中被重新激活3,4。在本实验方案中，我们将介绍如何利用噬斑测定法，在感染后早期（5–7 天）检测肺组织匀浆液在 Vero 细胞单层上的感染性病毒滴度。尽管急性感染在感染后 2–3 周内基本被清除，但 γHV68 的潜伏感染大约在感染后第 14 天于小鼠脾脏中建立并持续维持。潜伏感染通常仅影响感染组织中极小部分的细胞，此时病毒处于休眠状态，并关闭其大部分基因表达。潜伏感染的脾细胞在被移出并接种于组织培养时可自发地重新激活病毒，这一过程可通过感染中心（IC）测定法来重现，以确定病毒的潜伏负荷量。为了进一步估算急性和/或潜伏感染组织中病毒基因组拷贝的数量，可采用定量实时 PCR（qPCR）方法，因其具有最高的灵敏度和准确性。结合 qPCR 与噬斑测定法和/或 IC 测定法的结果分析，可揭示病毒在体内的时空复制动态及感染特性 in vivo。
方案
以下方案将描述在小鼠中研究γHV68病毒裂解期和潜伏期感染周期中的病毒滴度及病毒基因组载量的方法，该方法理论上也可用于评估其他与γHV68具有相似生命周期的病毒的感染情况。
1. γHV68 的扩增
- 将一管冻存的γHV68在37 °C水浴中解冻。
- 将病毒接种物加入培养于10 cm培养皿中的NIH3T12或3T3细胞（约50%汇合度）中，并在37 °C、5% CO2条件下培养感染细胞。
- 通过显微镜观察细胞病变效应（CPE），在感染后约4~5天、超过80%细胞出现CPE时收集培养上清。为最大化病毒产量，可将感染的细胞培养物反复冻融两次，以释放所有细胞相关的γHV68。
- 将收集的上清在室温（RT）下以1000 rpm离心5分钟，去除细胞碎片。
- 小心将上清转移至新管（高速离心管）中，避免接触底部的细胞碎片。
- 在4 °C下以12,000 rpm（适用于Sorvall SA-600转子）高速离心至少1.5小时，以浓缩病毒颗粒。
- 将上清弃入含10γ漂白液中，并小心用1 ml无血清DMEM重悬沉淀（病毒及残留细胞碎片）。将重悬后的沉淀转移至1.5 ml微量离心管中，充分涡旋混匀。
- 以最大转速离心2分钟，去除残留细胞碎片，将上清（病毒原液）转移至新管中。此即用于感染的最终病毒原液。病毒原液的滴度通过噬斑实验测定（见下文）。
2. 小鼠γHV68鼻内感染
- 在约6周龄时，每只小鼠接种1,000至5,000个噬斑形成单位（PFU）的γHV68病毒。
- 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合液（每只小鼠60 μl，含80 mg/ml氯胺酮和12 mg/ml赛拉嗪）对小鼠进行麻醉。通过轻捏小鼠脚趾监测麻醉状态，通常需要约5-10分钟。若小鼠未完全麻醉，可能会将病毒喷出。
- 当小鼠完全麻醉后，使用移液器将含有γHV68的PBS溶液（每侧鼻孔15 μl，共约30 μl）缓慢而稳定地逐滴接种至小鼠鼻腔。确保小鼠确实正在吸入液滴，且未试图形成气泡。
- 让小鼠恢复10-15分钟，并在放回笼具前监测其健康状况（如意识、呼吸等）。每日检查动物的疾病情况以及食物、饮水和垫料是否充足。若出现疾病、疼痛或痛苦的临床症状，将进行常规诊断以确定病因。若动物体重减轻超过20%，需记录最大体重损失并实施安乐死。是否实施安乐死最终由临床兽医决定，并在与主要研究者协商后执行。
3. 噬斑实验测定急性感染肺组织中的病毒滴度
- 通过Vero细胞单层上的噬斑形成来测定病毒的感染滴度。
- 在噬斑实验前一天，将Vero细胞以每孔2.5×104个细胞的密度接种于12孔板中。细胞应均匀分布，且在进行噬斑实验当天，细胞密度应达到30–40%。
- 配制0.5% (w/v) 甲基纤维素（MC）覆盖培养基（表1）。
- 在鼻内感染后5–7天处死γHV68感染的小鼠，以测定肺组织中急性期病毒滴度。安乐死方法为：先肌肉注射盐酸氯胺酮（80–100 mg/kg，皮下、肌肉或腹腔注射），随后腹腔注射戊巴比妥钠过量（30–50 mg/kg）。该方法已获美国兽医医学协会批准。
- 取出肺组织，用1×PBS冲洗两次以去除血细胞。将一侧肺组织放入1 ml冰上预冷的完全DMEM培养基中并置于冰上保存；迅速冷冻另一侧肺组织，并于-80°C保存，用于后续通过qPCR检测肺组织中的病毒DNA载量（见下文）。
- 使用组织匀浆器以最大速度匀浆肺组织1秒，反复冻融三次。每次更换样本时，均需用70%乙醇清洗匀浆器。
- 将匀浆后的组织在4°C条件下以3,000 rpm离心10分钟，收集上清液并转移至新管中，用于噬斑实验。
- 用普通DMEM在1.5 ml微量离心管中对肺匀浆样品进行系列稀释（通常从10°至10-8），通过涡旋混匀。预先在相应数量的离心管中加入540 μl DMEM，将60 μl匀浆液加入第一管，混匀后取60 μl转移至下一管，依此类推。
- 吸除12孔板中已准备好的Vero细胞单层中的培养基，按反向顺序（从10-8至10°）每孔加入200 μl系列稀释的含感染性病毒的匀浆液。每个稀释度设两个重复孔。
- 将Vero细胞与病毒接种物在37°C孵育1小时，每隔15分钟轻轻摇动培养板，使病毒在单层细胞上均匀分布。
- 移除接种物，每孔加入2 ml覆盖培养基（表1），于37°C继续孵育一周。
- 移除覆盖培养基（无需完全去除），每孔加入噬斑实验的固定/染色液（表1），室温孵育至少1小时。
- 待培养板干燥后，计数各稀释度下边界清晰的噬斑数量。为减少误差，仅计数含有10至100个噬斑的孔。
- 使用以下公式计算病毒滴度：滴度（pfu/ml）= [（每孔噬斑数）/（每孔接种体积）] × 稀释倍数。
4. 检测潜伏感染脾细胞中病毒载量的感染中心实验
- 通过在 Vero 细胞单层上进行感染中心（IC）检测来确定病毒潜伏载量。在进行 IC 检测的前一天，将 Vero 细胞接种于 6 孔板中（每孔 1 - 2.5 × 105 个细胞）。每个脾脏样本通常使用 11 个孔，其中 10 个孔用于系列稀释的脾细胞悬液，另 1 个孔用于检测冻融循环后病毒的自发再激活。
- 在潜伏感染建立后（感染后 12 - 14 天）处死感染小鼠，取出小鼠脾脏并将其置于 1 ml 冰冷的 DMEM 中合并保存。
- 机械法解离小鼠脾脏。将新鲜分离的小鼠脾脏转移至 10 cm 培养皿中，并加入 10 ml 所需培养基（如含 2% FBS 的 DMEM）。用冰浴培养基润湿两张磨砂端玻璃显微镜载玻片。将脾脏置于其中一张载玻片的磨砂面上，并用另一张载玻片的磨砂边缘划破包膜。在两张载玻片之间机械解离脾脏，直至所有红色团块被碾碎（如有脂肪颗粒也应去除）。
- 用 DMEM 冲洗载玻片，以回收两片上残留的细胞。
- 将整个组织悬液轻柔地通过细胞滤网（40 μm 尼龙滤膜）转移至 50 ml 锥形螺帽管中。用 10 ml PBS 冲洗含有脾组织匀浆的 10 cm 培养皿，并在过滤的同时转移液体。
- 将单细胞悬液在 375 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。轻弹管底使已有的细胞团块分散。加入 5 ml ACK 缓冲液（表 1）以裂解红细胞。孵育 5 分钟后再次在 375 × g 条件下离心。
- 弃去上清液，将沉淀细胞彻底但轻柔地重悬于含 2% FBS 的 PBS 中。将细胞置于 4 °C 保存。如有必要，使用移液器去除碎片。使用自动细胞计数仪（Bio-Rad）计数活细胞。
- 将 PBS 重悬的脾细胞在 375 × g 条件下离心 4 分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于 4 ml 完全 DMEM 中（其中 2 × 1 ml 用于原始悬液的 IC 检测；0.6 ml 用于 IC 检测中的系列五倍稀释；0.4 ml 用于病毒 DNA 提取和 qPCR 检测；另 1 ml 悬液用于评估经三次冻融循环后潜伏病毒的自发再激活情况）。
- 将脾细胞悬液用 DMEM 进行系列五倍稀释（即 1/5、1/25、1/125、1/250），每种稀释度设两个复孔。预先在 15 ml 锥形管中加入 2.4 ml DMEM，取 600 μl 脾细胞悬液加入第一管并充分混匀。从上一管转移 600 μl 至下一管，依此类推。切勿涡旋！
- 吸去已准备好的 Vero 细胞 6 孔板中的培养基。每种稀释度接种 1 ml 至 Vero 细胞，每个稀释度设两个复孔（共使用 10 个孔，分别对应 0、1/5、1/25、1/125、1/250 稀释度）。
- 将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 8 - 12 小时，不得超过 24 小时。吸去接种的脾细胞悬液，每孔加入 4 ml 覆层培养基（表 1），继续孵育 6 天。
- 通过用 0.2%（w/v）结晶紫染色培养板来确定脾脏感染中心的数量，方法如噬斑检测所示。
5. 病毒基因组的定量
- 从γHV68感染的组织（如本实验中的肺和脾样本）中提取总基因组DNA。使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen），按照制造商提供的操作说明进行。
- 测定每个样本的DNA浓度，以确保qPCR实验中使用等量的DNA。设计病毒特异性引物（qPCR实验中建议扩增子长度约为200 bp）。本实验采用针对γHV68 ORF56的特异性引物（正向引物：5′- GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3′；反向引物：5′-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3′），并以β-actin引物（正向引物：5′-cacccacactgtggcccatcat-3′，反向引物：5′-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3′）作为qPCR反应的内参对照。
- 将DNA样本（100–500 ng为宜）与相应的引物同2×SYBR预混液（Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix）混合。使用Bio-Rad实时PCR系统对感染组织中的病毒载量进行定量。PCR反应条件如下：95 °C预变性15分钟，随后进行45个循环的扩增，每个循环包括95 °C变性30秒、60 °C退火30秒、72 °C延伸30秒，最后对病毒和actin扩增产物均进行熔解曲线分析。
- 为定量病毒基因组构建标准曲线，将已知量的γHV68 bacmid DNA与从未感染细胞中提取的基因组DNA进行系列稀释。使用相同的病毒特异性引物组，将感染组织提取的DNA与标准品同时进行qPCR检测。
- 经β-actin归一化后，以每单位基因组DNA（例如100 ng或500 ng）中的病毒DNA拷贝数表示组织中的病毒基因组载量。
6. 代表性结果：
图1展示了在小鼠中检测γHV68感染的实验总体方案 体内图2A展示了通过噬斑实验测定的γHV68急性感染期间肺部病毒滴度的代表性结果。在经鼻感染7天后，携带非功能性病毒Bcl-2（vBcl-2）的γHV68突变株在BALB/c小鼠肺部的复制水平与野生型γHV68相当（每组6–7只小鼠）。两组间肺部病毒滴度无统计学显著差异。该数据表明，vBcl-2在小鼠γHV68急性感染过程中并非关键因素。然而，在感染后28天时，通过感染中心实验测定，vBcl-2突变株在脾脏中的滴度较野生型下降了6至10倍（图2B），提示vBcl-2突变的γHV68病毒在感染后维持脾脏潜伏感染的能力存在缺陷。与感染中心滴度降低的结果一致，在多次重复实验中，感染后第28天时vBcl-2突变病毒的病毒基因组负荷量相较于野生型病毒显著降低，如图2C所示。病毒基因组负荷量与潜伏性HV68 vBcl-2突变病毒再激活频率之间存在密切相关性 离体 感染潜伏期阶段的结果凸显了该突变病毒在潜伏感染中的缺陷。
图1. 通过噬斑形成、感染灶中心及qPCR检测方法测定小鼠γHV68感染的示意图。
图2. 野生型与突变型γHV68病毒在体内的裂解性感染与潜伏性感染。体内急性复制（A）通过噬斑实验测定BALB/c小鼠感染后第7天（dpi）肺组织中野生型与vBcl-2突变型γHV68病毒的复制水平。（B和C）通过感染中心实验（B）和qPCR（C）分别测定感染后第28天小鼠脾脏中的感染中心数量和病毒基因组载量。红线表示相应数值的平均值。n.s.，无统计学显著性。
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讨论
γHV68 已被广泛用作研究人类 γ-HV 致病机制的模型2,4,5。在本实验方案中，我们描述了三种常规使用的方法，包括用于测定感染性病毒滴度的噬斑试验、用于检测病毒潜伏负荷的 IC 试验以及用于检测病毒基因组负荷的 qPCR，以评估小鼠经鼻接种 γHV68 后的急性感染和潜伏感染情况。
蚀斑试验已广泛用于测定感染细胞或组织中的病毒滴度，但针对不同病毒，其最佳实验条件各不相同。这主要是因为不同病毒在细胞单层上形成蚀斑（可计数的病灶）的能力存在差异。γHV68 通常在感染后 6 至 7 天内在猴 Vero 细胞或培养的小鼠细胞（如 NIH3T12 或 3T3）的单层上产生明显的蚀斑。值得注意的是，随着细胞单层老化或过度生长，其对病毒感染的敏感性会下降。因此，我们通常在 Vero 细胞融合度低于 50% 时进行蚀斑试验，根据我们的经验，这最有利于 γHV68 的检测效果。此外，为确保蚀斑计数的准确性，强烈建议使用分布均匀且 freshly-made（新制备）的细胞单层。在对病毒样本进行系列稀释时，需小心避免产生气泡，并且每次稀释均应更换移液器吸头。对于高滴度的病...
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致谢
作者感谢加州大学洛杉矶分校的Ren Sun和华盛顿大学的Seungmin Hwang提供的技术指导与支持。本研究由Baxter基金会以及美国国立卫生研究院基金（R01 CA140964和R21 AI083841，授予C. Liang）资助。
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