利用适用于Gateway系统的双分子荧光互补（BiFC）技术检测植物中的蛋白质相互作用

摘要

我们开发了一种在植物中检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术。将黄色荧光蛋白（YFP）分割成两个不重叠的片段，每个片段通过Gateway系统与目标基因进行同框克隆，从而表达融合蛋白。只有当目标蛋白质发生相互作用时，YFP荧光信号才会重建。

摘要

我们开发了一种双分子荧光互补（BiFC）技术，用于检测两种蛋白质之间的相互作用 体内通过将黄色荧光蛋白（YFP）分割成两个不重叠的片段来实现。每个片段分别与目标基因按读码框融合克隆。随后可将这些重组质粒共转化至 Nicotiana benthamiana 通过 农杆菌 介导的转化，实现融合蛋白的瞬时表达。只有当目标蛋白相互作用时，YFP 信号才会重建。 ^1-7为了检测和验证蛋白质-蛋白质相互作用，可将双分子荧光互补（BiFC）与酵母双杂交（Y2H）实验联合使用。该联合方法能够检测到在Y2H中可能被忽略的间接相互作用。Gateway技术是一种通用平台，可使研究人员将目的基因（GOI）快速转移至尽可能多的表达和功能分析系统中。^8,9方向和读码框均可在无需使用限制性酶或连接步骤的情况下得以保持，从而直接构建可用于表达的克隆。因此，可省去所有重新测序步骤，确保实验过程中结果的一致性。我们已构建了一系列与Gateway兼容的BiFC和Y2H载体，为研究人员提供便于使用的工具，以开展BiFC和Y2H实验。¹⁰在此，我们展示了利用我们的BiFC系统检测蛋白质-蛋白质相互作用的简便性 N. benthamiana 植物

方案

1. 准备 农杆菌 培养

1. 农杆菌 菌株GV3101，此前已转化含有Gateway兼容的双分子荧光互补载体pEarleyGate201-YC和pEarleyGate202-YN，两者均包含目的基因的融合构建体。
2. 接种5 ml YEB（5 g/L^-1 牛肉浸膏，1g L^-1 酵母提取物，5 g/L^-1 蛋白胨，5g L^-1 蔗糖，2 mM MgSO₄₄，pH 7.2）培养转化了BiFC融合蛋白构建体的细胞 农杆菌 使用适当的抗生素进行筛选。在37°C下过夜培养。 28°C 以 200 rpm 振荡。
3. 将1 ml培养物转移至无菌的1.5 ml离心管中。
4. 在室温下以1,000g离心10分钟收集细胞，弃上清液。
5. 加入1 ml浸润培养基（5 g L⁻¹）洗涤沉淀^-1 D-葡萄糖，50 mM MES（Sigma），2 mM Na₃PO₄，0.1 mM 乙酰丁香酮 ¹¹用移液器重悬沉淀，然后在1,000g离心10分钟，再次收集细胞沉淀。
6. 重复洗涤步骤两次。
7. 将沉淀重悬于0.5 ml浸润培养基中。
8. 在600 nm处测定吸光度，并调整终末OD....

讨论

双分子荧光互补（BiFC）检测是一种研究蛋白质相互作用的有力工具。与传统的酵母双杂交（Y2H）检测不同，BiFC不仅能够实现蛋白质-蛋白质相互作用的可视化，还能提供有关蛋白复合物的更多信息，例如亚细胞定位。此外，只要两个候选蛋白能通过第三个伴侣分子被拉近到足够距离，就有可能检测到间接相互作用。与所有技术一样，BiFC也存在局限性。由于荧光团的形成需要分子氧，因此该技术不能用于专性厌氧生物——这类生物无法在氧气存在下存活，从而限制了BiFC仅能应用于需氧生物⁶。荧光团复合物的形成是不可逆的，这会阻止蛋白质与其他蛋白进一步相互作用，并可能干扰处于动态平衡中的蛋白复合物的结合与解离过程⁶。然而，这种不可逆性也使我们能够观察到较弱或短暂的相互作用。荧光蛋白片段在不依赖其融合蛋白的情况下也具有一定的自发结合能力，因此必须设置充分且多样化的对照，以区分真实的相互作用与假阳性结果⁶。此外，由于荧光团的重建可在7 nm甚至更远的距离发生，荧光互补信号可能反映的是直接或间接的相互作用。因此，需要结合其他方法（如Y2H或共免疫沉淀）来验证具体的相互作用关系⁷。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酰丁香酮	Sigma-Aldrich	D134406
MES 水合物	Sigma-Aldrich	M2933
1 mL 带滑动接头的结核菌素注射器	BD Biosciences	309602