我们开发了一种在植物中检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术。将黄色荧光蛋白（YFP）分割成两个不重叠的片段，每个片段通过Gateway系统与目标基因进行同框克隆，从而表达融合蛋白。只有当目标蛋白质发生相互作用时，YFP荧光信号才会重建。
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摘要
摘要
我们开发了一种双分子荧光互补（BiFC）技术，用于检测两种蛋白质之间的相互作用 体内通过将黄色荧光蛋白（YFP）分割成两个不重叠的片段来实现。每个片段分别与目标基因按读码框融合克隆。随后可将这些重组质粒共转化至 Nicotiana benthamiana 通过 农杆菌 介导的转化，实现融合蛋白的瞬时表达。只有当目标蛋白相互作用时，YFP 信号才会重建。 1-7为了检测和验证蛋白质-蛋白质相互作用，可将双分子荧光互补（BiFC）与酵母双杂交（Y2H）实验联合使用。该联合方法能够检测到在Y2H中可能被忽略的间接相互作用。Gateway技术是一种通用平台，可使研究人员将目的基因（GOI）快速转移至尽可能多的表达和功能分析系统中。8,9方向和读码框均可在无需使用限制性酶或连接步骤的情况下得以保持，从而直接构建可用于表达的克隆。因此，可省去所有重新测序步骤，确保实验过程中结果的一致性。我们已构建了一系列与Gateway兼容的BiFC和Y2H载体，为研究人员提供便于使用的工具，以开展BiFC和Y2H实验。10在此，我们展示了利用我们的BiFC系统检测蛋白质-蛋白质相互作用的简便性 N. benthamiana 植物
方案
1. 准备 农杆菌 培养
- 农杆菌 菌株GV3101，此前已转化含有Gateway兼容的双分子荧光互补载体pEarleyGate201-YC和pEarleyGate202-YN，两者均包含目的基因的融合构建体。
- 接种5 ml YEB（5 g/L-1 牛肉浸膏，1g L-1 酵母提取物，5 g/L-1 蛋白胨，5g L-1 蔗糖，2 mM MgSO₄4，pH 7.2）培养转化了BiFC融合蛋白构建体的细胞 农杆菌 使用适当的抗生素进行筛选。在37°C下过夜培养。 28°C 以 200 rpm 振荡。
- 将1 ml培养物转移至无菌的1.5 ml离心管中。
- 在室温下以1,000g离心10分钟收集细胞，弃上清液。
- 加入1 ml浸润培养基（5 g L⁻¹）洗涤沉淀-1 D-葡萄糖，50 mM MES（Sigma），2 mM Na3PO4，0.1 mM 乙酰丁香酮 11用移液器重悬沉淀，然后在1,000g离心10分钟，再次收集细胞沉淀。
- 重复洗涤步骤两次。
- 将沉淀重悬于0.5 ml浸润培养基中。
- 在600 nm处测定吸光度，并调整终末OD值600 1.0 至 1.2
- 分装等量的 农杆菌 将每种构建体的悬浮液分别转入新的1.5 ml离心管中，涡旋振荡10秒。用于单次侵染时， 100 μL 每种构建体的量都绰绰有余。
- 的 农杆菌 混合液现已可进行浸润。
2. 渗入
- 在21°C、16小时光照和8小时黑暗的条件下培养N. benthamiana植株。应使用5至6周龄的植株进行农杆菌浸润。
- 将植株从生长室中取出，在白色光源下放置1小时，使气孔充分打开，然后再进行浸润操作。
- 用1 ml无针头的滑动式结核菌素注射器吸取重悬的agrobacterium混合液。
- 将注射器尖端抵住叶片背面，同时用一根手指轻轻托住叶片上表面，缓慢推动活塞。液体将随着填充叶肉组织的细胞间隙而在叶片内扩散。
- 用记号笔标记浸润区域，以便后续识别。
- 当使用不同构建体进行浸润时，每次浸润之间务必更换手套或用70%乙醇清洁手套。如有可能，不同样品之间应至少保留一条中脉间隔，以防止交叉污染。
- 将植株放回生长培养箱中，在正常生长条件下继续培养。
3. 重建的YFP信号的观察
- 在侵染区域内切取一块5mm × 5mm的叶片组织
- 将样品置于水中的玻璃载玻片上，加盖盖玻片，使用共聚焦或荧光显微镜观察相互作用情况。
- 从侵染开始起，应每隔24小时监测一次表达情况，持续至5天后，因为过表达或蛋白转运可能随时间推移导致荧光融合蛋白出现在多个不同位置。
4. 代表性结果：
双分子荧光互补（BiFC）实验检测蛋白质-蛋白质相互作用的示例如图1所示。AtTHP1和AtSAC3A被认为属于 拟南芥 酵母TREX-2复合体的同源物。它们可与核孔蛋白AtNUP1相互作用，并促进mRNA的输出10将AtTHP1和AtSAC3A克隆至pEarlyGate201-YC载体，AtNUP1克隆至pEarlyGate202-YN载体。随后将这些质粒转化至农杆菌GV3101中。三种构建体以三种可能组合（AtTHP1+AtNUP1；AtTHP1+AtSAC3A；AtNUP1+AtSAC3A）进行共浸润实验。浸润48小时后，利用激光共聚焦显微镜（LCSM）检测重组YFP信号。信号出现在表皮细胞中，并定位于核周区域或核质，与这些蛋白的亚细胞定位一致。阴性对照未检测到YFP信号。
图1. Arabidopsis TREX-2 mRNA 输出复合体组分之间相互作用。N. benthamiana 叶片共转化了目的基因（GOI）与 pEarleyGate201-YC 和 pEarleyGate202-YN 载体（如图所示），在侵染后48–72小时使用Leica TCS SP2共聚焦显微镜进行成像。图像显示为表皮N. benthamiana叶细胞的YFP共聚焦图像与明场图像的叠加结果
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讨论
双分子荧光互补（BiFC）检测是一种研究蛋白质相互作用的有力工具。与传统的酵母双杂交（Y2H）检测不同，BiFC不仅能够实现蛋白质-蛋白质相互作用的可视化，还能提供有关蛋白复合物的更多信息，例如亚细胞定位。此外，只要两个候选蛋白能通过第三个伴侣分子被拉近到足够距离，就有可能检测到间接相互作用。与所有技术一样，BiFC也存在局限性。由于荧光团的形成需要分子氧，因此该技术不能用于专性厌氧生物——这类生物无法在氧气存在下存活，从而限制了BiFC仅能应用于需氧生物6。荧光团复合物的形成是不可逆的，这会阻止蛋白质与其他蛋白进一步相互作用，并可能干扰处于动态平衡中的蛋白复合物的结合与解离过程6。然而，这种不可逆性也使我们能够观察到较弱或短暂的相互作用。荧光蛋白片段在不依赖其融合蛋白的情况下也具有一定的自发结合能力，因此必须设置充分且多样化的对照，以区分真实的相互作用与假阳性结果6。此外，由于荧光团的重建可在7 nm甚至更远的距离发生，荧光互补信号可能反映的是直接或间接的相互作用。因此，需要结合其他方法（如Y2H或共免疫沉淀）来验证具体的相互作用关系7。
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致谢
我们感谢 Vi Nguyen 对稿件的审阅以及在实验室工作中的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酰丁香酮 | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES 水合物 | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL 带滑动接头的结核菌素注射器 | BD Biosciences | 309602 |
参考文献
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