组织制备及小鼠皮肤与四肢骨骼支配感觉神经纤维的免疫染色

摘要

外周感觉神经纤维亚型的免疫细胞化学鉴定（及其蛋白表达的检测）是理解外周感觉分子机制的关键。本文描述了用于外周/内脏组织样本（如皮肤和四肢骨骼）制备的方法，以实现对外周感觉神经纤维进行特异性免疫染色。

摘要

外周感觉神经纤维对物理、化学和温度等感觉刺激的检测及初级处理，是动物和人类感觉感知的关键。这些外周感觉神经纤维表达多种受体和离子通道蛋白，能够检测并启动特定的感觉刺激。目前已有一些方法可用于表征支配皮肤的外周感觉神经纤维的电生理特性，这些方法也可用于鉴定这些神经纤维中特定离子通道蛋白的功能性表达。然而，目前尚无类似电生理方法（且开发也极为困难）可用于检测支配其他内脏器官的外周感觉神经纤维中受体和离子通道蛋白的功能性表达，其中尤以骨骼等最具挑战性的组织为甚。此外，此类电生理方法也无法用于确定外周感觉神经纤维中非兴奋性蛋白的表达。因此，对外周/内脏组织样本进行免疫染色，是确定这些神经纤维中特定目标蛋白表达的最佳途径。迄今为止，大多数关于感觉神经元中蛋白表达的研究均采用感觉神经节的免疫染色方法，但其信息仅限于特定类型或亚群感觉神经元胞体中特定蛋白的表达。本文报道了用于外周感觉神经纤维免疫染色的外周/内脏组织样本制备的详细方法/方案。我们特别详述了从小鼠制备皮肤或足底穿刺活检样本以及骨骼（股骨）切片以进行外周感觉神经纤维免疫染色的具体方法。这些方法不仅对于定性确定外周感觉神经元中蛋白表达至关重要，还可提供一种定量分析手段，用于检测特定类型或亚群感觉纤维中蛋白表达水平的变化，以及在不同病理状态下感觉纤维数量和密度的形态学和/或解剖学改变。此外，这些方法不仅限于感觉神经纤维的染色，也可用于皮肤、骨骼及其他内脏组织中任何类型神经纤维的染色。

方案

1. 动物灌注

本研究中进行的所有动物实验均经爱荷华大学机构动物护理和使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于动物在科研中使用的指南。

1. 灌注前一天，配制1 L磷酸盐缓冲液（0.2 M PB，使用双蒸水）₂O，pH 7.4），并于 4°C将用于灌注和后固定过程。
2. 灌流当天，配制500 ml含4.0%多聚甲醛的0.1 M磷酸缓冲液（PFA，pH 7.4）固定液，该体积足以用于2只小鼠的灌流：将200 ml去离子水₂在玻璃烧杯中加热，持续30秒或直至接近沸腾。在通风橱中，向烧杯中加入20 g颗粒状多聚甲醛（PFA），并持续搅拌。逐滴加入5 ml 5 N NaOH，搅拌至溶液变澄清。当PFA完全溶解后，将溶液冷却至室温（RT）。在持续搅拌下缓慢加入250 ml 0.2 M PB。使用浓度逐渐降低的HCl溶液（6 N、1 N、0.1 N），将pH调节至7.4。定容至500 ml，并置于冰上冷却。同时，通过将0.2 M储备液与ddH₂O按1:1稀释，配制400 ml 0.1 M PB。₂O 并在冰上冷却。
3. 通过腹腔注射过量麻醉剂（戊巴比妥钠，80 mg/kg，使用27G针头）对小鼠进行麻醉。
4. 灌流过程中，使用50 ml 0.1 M PB（将0.2 M PB贮存液与ddH₂O按1:1稀释）₂O）和150 ml的PFA将依次注入小鼠循环系统。通过向管道中充满PB并固定一个23^1/2G 蝶形针一端连接。将管路的另一端浸入盛有 0.1 M PB 的烧杯中。将蠕动泵的流速设置为 10 ml/min，并泵入足量溶液，确保管路中无气泡。
5. 等待麻醉小鼠不再表现出任何反射活动，例如脚趾/尾巴夹捏反射和眨眼反射。将动物仰卧置于通风橱内的解剖托盘上，并用胶带固定四肢。用70%乙醇喷洒体表毛发。沿正中线切开皮肤，暴露肋骨 cage 及腹壁最上部四分之一区域。随后在肋骨 cage 底部切开腹壁。完成此切口后，应可见膈肌及胸骨下端。小心地从左至右沿膈肌边缘及胸骨全长剪开，注意避免损伤肺组织。此过程中胸骨处出现少量出血属正常现象，不会影响灌注效果。当沿胸骨切开并剪断膈肌后，应可将两侧肋骨 cage 向上及向外抬起，从而暴露心脏。必要时可移开肺组织。可使用止血钳固定两侧肋骨 cage 于抬起位置。插入蝶形针头（23^1/2G）将连接至蠕动泵的导管插入左心室，深度为3-4 mm，方向平行于动物的长轴。此位置可最大程度降低针头脱出的风险。在右心房做一小切口，以允许回流循环液体流出心脏。
6. 以0.1 M PB溶液以10 ml/min的速度开始灌注，持续4–5分钟。若此时仍有大量血液从右心房流出，则继续灌注直至流出液变清。
7. 停止灌注PB，将蠕动泵的进液管切换至4% PFA溶液。将流速降低至5 ml/min，继续灌注PFA溶液20–25分钟。当PFA进入循环系统后，肌肉会发生痉挛，数分钟后动物应已基本“固定”于原位。可通过轻推后肢足掌来检测其僵直程度，注意避免移动动物或移位插管。良好的灌注效果可防止肢体出现屈曲反应。完成PFA灌注后，可移除插管和止血钳，准备对尸体进行组织解剖。具体解剖方法取决于目标组织类型。
8. 制备4% PFA / 5% (v/v) 苦味酸（PA；仅用于足底穿刺组织的采集和后固定）：将饱和苦味酸溶液加入4% PFA中。添加PA可显著提高外周神经组织中抗原的可检测性¹
9. 配制骨/软骨组织脱钙/冷冻保护液——含0.07%甘油和15%蔗糖的10% EDTA 0.1 M PB溶液。基于EDTA的溶液可在脱钙组织的同时保护抗原表位².
10. 配制冷冻保护液——0.1 M 磷酸缓冲液（PB）中含 30% 蔗糖。

2. 组织解剖/切除、后固定与切片

1. 足底穿孔
   将灌注后的动物腹侧朝下放置在切割垫或其他坚固的表面上。手持足部使其足底朝上，用穿孔活检工具（直径3 mm；Harris微穿孔器，Ted Pella公司）用力压入足部中央。将活检工具来回旋转180度，确认已完全切断后肢足部组织。轻轻将活检工具从足部取出，并将组织弹入含有1 ml 4%多聚甲醛/5%过碘酸（PFA/PA）溶液的无菌2 ml带盖离心管中。
2. 肢体骨（例如股骨）
   在动物骨盆水平处沿背部做一外侧切口，并向下延伸至双侧后肢。切开骨盆及周围肌肉，将股骨从骨盆分离，同时保持股骨近端头部完整。切开胫骨/腓骨以保留其远端头部完整，并去除骨干周围的肌肉/骨膜。将股骨放入含有1 ml 4% PFA / 5% PA溶液的2 ml离心管中。
3. 将组织样本在4% PFA / 5% PA溶液中后固定，在摇床上4°C条件下轻柔振荡16–18小时。
4. 按以下步骤进行脱钙：足底穿孔样本（用于脱钙足部小骨），将穿孔组织放入含1.5 ml 0.1 M磷酸缓冲液（PB）中含10% EDTA、0.07%甘油和15%蔗糖溶液的无菌2 ml带盖离心管中。将离心管置于摇床上，4°C条件下轻柔振荡16–18小时。肢体骨样本，将组织放入含1.5 ml相同脱钙液的无菌2 ml带盖离心管中，4°C条件下轻柔振荡6–7天。每24小时更换一次脱钙液，并用镊子监测组织硬度是否消失以判断脱钙进程。
5. 将组织转移至含1.5 ml冷冻保护液（0.1 M PB中含30%蔗糖）的无菌2 ml带盖离心管中，4°C条件下在摇床上轻柔振荡16–18小时。
6. 准备组织切片：在冷冻切片机组织托块上加入适量最佳切割温度（OCT）包埋剂（Sakura Finetek USA公司），并在冷冻切片机舱内（通常维持在-20°C）使其冻结。也可喷洒冷冻喷雾剂（Cyto-freeze，Control公司，美国）以加速冻结过程。将组织样本置于OCT基质上，并覆盖一层薄薄的额外OCT。轻轻喷洒冷冻喷雾直至OCT硬化且内部组织完全冻结。将样本安装至冷冻切片机的切头，在冷冻切片机舱内平衡至切片温度，至少1小时。若包埋剂过冷时即开始切片，会导致切片脆裂及组织损伤。
7. 待组织达到最佳切片温度后，开始切片并制备40 μm厚的切片。
8. 足底穿孔样本：将冷冻切片收集至含有0.1 M PB缓冲液（含10 mM叠氮化钠）的12孔细胞培养板中。确保切片始终浸没于该溶液中，并于4°C保存。此类保存方式下，切片可用于免疫染色实验，最长可保存4–6个月。或者，漂浮切片可长期保存于-20°C的冷冻保护液中（500 ml 0.1 M PBS，pH 7.2，30 g蔗糖，10 g PVP40，300 ml乙二醇），用蒸馏水定容至1 L³。肢体骨样本：将冷冻切片直接收集到明胶预涂层载玻片（或Superfrost Plus载玻片，Fisher Scientific）上，室温晾干1小时后于-20°C保存。以此方式保存的骨组织切片载玻片，可在2–3个月内用于免疫染色实验。

3. 感觉神经纤维组织切片的免疫染色

3.1. 足底穿孔切片——漂浮切片染色

1. 使用剃须刀片从1 ml移液器吸头末端切下6-7 mm。通过多次吸取含1%胎牛血清（FBS）的0.1 M磷酸缓冲液（PB）预处理吸头内壁（此举可防止组织切片粘附于吸头壁上）。将待染色的足底穿孔组织切片转移至24孔细胞培养板中。通常每孔应放置8-10个切片，以确保每次免疫染色可获得多个高质量切片。
2. 每孔加入500 μl 0.1 M PB，在室温下于摇床上剧烈振荡5分钟，清洗足底穿孔组织切片。重复此步骤2次。
3. 弃去清洗液，将足底穿孔组织切片置于封闭液中孵育，封闭液成分为含10%山羊血清和0.3% Triton X-100的0.1 M PB（每孔500 μl封闭液），在4°C下于摇床上轻柔振荡孵育1小时。
4. 弃去封闭液，将组织切片置于含适当稀释的一抗或一抗混合液的250 μl封闭液中，在4°C下于摇床上轻柔振荡孵育18-24小时。根据研究者的实验需求，可在同一组织切片上进行单标免疫染色（使用一种针对特定蛋白或神经纤维标志物的一抗）或双标免疫染色（使用两种分别针对不同蛋白或神经纤维标志物的一抗）。进行双标免疫染色时，需确认所用两种一抗来源于不同宿主物种（例如一种来自小鼠，另一种来自兔），或使用不同免疫球蛋白G（IgG）亚型的纯化单克隆抗体（例如一种为IgG1，另一种为IgG2a）。建议用Parafilm密封培养板以进行过夜孵育，避免过度蒸发。为标记外周感觉神经纤维，可使用多种特异性抗体。针对神经丝蛋白200（NF200；Sigma）的抗体可标记大直径神经纤维，而降钙素基因相关肽（CGRP；Sigma）和瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1，Neuromics）抗体则可标记肽能性小直径外周感觉神经纤维。所有外周神经纤维也可用抗β3-微管蛋白抗体进行标记。在皮肤组织中，抗胶原IV（Abcam）抗体可用于界定分隔表皮与真皮的基底膜。一般而言，组织切片染色所需抗体浓度应比细胞培养免疫荧光实验高5-10倍，通常工作浓度为5-10 μg/ml。
5. 每孔加入500 μl含Triton X-100的封闭液，在室温下于摇床上剧烈振荡5分钟，清洗组织切片。重复此步骤3次。
6. 弃去清洗液，将组织切片置于适当的荧光标记二抗溶液中孵育（通常以封闭液按1:1000稀释，每孔500 μl），在4°C下于摇床上轻柔振荡孵育。孵育过程中必须用铝箔包裹培养板，以防荧光染料发生光漂白。
7. 每孔加入500 μl封闭液，在室温下于摇床上剧烈振荡10分钟，清洗组织切片。随后每孔加入500 μl 0.1 M PB，在室温下剧烈振荡清洗10分钟。最后每孔加入500 μl 0.05 M PB，在室温下剧烈振荡清洗10分钟。
8. 使用经FBS处理过的1 ml移液器吸头（从末端切去6-7 mm），从细胞培养板中吸取组织切片，并转移至SuperFrost Plus载玻片上。用细毛笔整理切片并吸除多余洗涤缓冲液。避免长时间暴露于光照下。将载玻片置于室温孵育，使切片在玻片上自然干燥（5-30分钟）。
9. 滴加数滴封片剂（ProLongGold、Vectashield或类似产品），缓慢将盖玻片覆盖于组织切片上。将载玻片置于暗处静置5分钟，随后用透明指甲油封固盖玻片边缘。室温下空气干燥15-20分钟。此后载玻片即可用于观察，或于-20°C保存数年而无明显荧光衰减。

3.2. 四肢骨切片——载玻片染色

1. 将载玻片从 -20°C 储存条件下取出，恢复至室温。使用疏水屏障笔（Super Pap Liquid Blocking Pen, Ted Pella Inc.）在载玻片上围绕待染色的骨组织区域均匀涂抹一圈阻水溶液，形成封闭区域。室温下静置晾干 10–15 分钟。
2. 每张载玻片用 250 μl 的 0.1 M 磷酸缓冲液（PB）清洗骨组织切片，持续 5 分钟，重复清洗 3 次。
3. 弃去清洗液，将骨组织切片置于封闭液中孵育，每张载玻片加入 250 μl 封闭液（含 10% 山羊血清和 0.3% Triton X-100 的 0.1 M PB 溶液），4°C 孵育 1 小时。
4. 弃去封闭液，将骨组织切片与一抗（或在双重免疫标记情况下使用多种一抗的组合，见 3.1.4 节）在 250 μl 封闭液中稀释后，于 4°C 孵育 18–24 小时。需特别注意：载玻片必须置于带密封盖的湿盒中，以防止一抗溶液干燥。若需标记外周感觉神经纤维，可使用上述抗体组合（见第 3.1.4 节），工作浓度相似。
5. 每张载玻片用含 Triton X-100 的封闭液 250 μl 在室温下清洗 15 分钟，重复清洗 4 次。
6. 弃去清洗液，将骨组织切片与适当荧光标记的二抗（通常以封闭液按 1:1000 稀释，每张 250 μl）在 4°C 孵育。染色盒必须用铝箔包裹，以避免荧光染料发生光漂白。为方便操作，建议使用深色染色盒（例如：RPI Corp. 的载玻片孵育盘/盒）。
7. 每张载玻片用 250 μl 封闭液在室温下清洗 15 分钟，随后用 500 μl 的 0.1 M PB 在室温下清洗 15 分钟，再用 500 μl 的 0.05 M PB 在室温下清洗 15 分钟。最后将载玻片短暂浸入 ddH₂O 中漂洗，然后于室温下静置，使骨组织切片自然风干（5–30 分钟）。避免长时间暴露于光照下。
8. 滴加数滴封片剂（ProLongGold 或类似产品），缓慢将盖玻片覆盖于组织切片上。将载玻片置于暗处静置 5 分钟，随后用透明指甲油封固盖玻片边缘。室温干燥 15–20 分钟。载玻片可在 -20°C 条件下保存数年，荧光信号不会明显减弱。

4. 代表性结果

4.1. 足底穿孔切片

足底穿孔组织切片可在落射荧光显微镜下观察，或使用配备10X、40X或63X物镜的共聚焦显微镜观察。

图1. A-D 显示胶原蛋白IV抗体（绿色）在基底膜、表皮-真皮交界处以及软骨和肌肉中的染色情况。在小鼠足底区域的皮肤中，可见大量降钙素基因相关肽（CGRP，A-B，红色）和NF200阳性神经纤维（C-D，红色）分布（箭头所示）。β3-微管蛋白是一种泛神经元标记物（E，红色），而TRPV1染色（F，红色）主要局限于小直径神经纤维，这些纤维也呈CGRP阳性（绿色；箭头所示）。A和C为使用10倍物镜拍摄的落射荧光图像（比例尺：500 μm）；B、D、E和F为在60倍物镜下以2 μm步长采集的11层z轴图像叠加生成的共聚焦图像组合（比例尺：50 μm）。

4.2. 四肢骨切片

肢体骨组织切片也可在落射荧光显微镜下，或使用10X、40X或63X物镜的共聚焦显微镜下观察。

图 2. 显示使用抗-CGRP 抗体（A-B，红色；箭头）、抗-NF200 抗体（C-D，红色；箭头）、抗-β3-微管蛋白抗体（E，红色）和抗-TRPV1 抗体（F，红色）与抗-CGRP 抗体（绿色；箭头）共染色的免疫染色结果。这些图像显示了分布于小鼠股骨海绵状头部区域骨基质中的感觉神经纤维亚型。A 和 C 为使用 10X 物镜拍摄的落射荧光图像（比例尺：500 μm）；B、D、E 和 F 为在 60X 物镜下以 2 μm 步长采集的 11 层 z 轴堆叠图像生成的共聚焦图像合成图（比例尺：50 μm）。

讨论

本文详细介绍了用于免疫染色及外周感觉神经纤维检测的小鼠皮肤和骨组织切片的制备方法。由足底穿孔活检所获得的组织切片包含无毛皮肤和有毛皮肤，因此该方案可适用于任何类型的皮肤组织。这些技术也可用于对这些组织中的其他细胞类型进行染色（例如白细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞等）。如果严格按照步骤操作，这些方法能够在超微结构的最佳保存（通常通过戊二醛固定实现，但常导致抗原表位破坏和免疫染色质量下降）与免疫细胞化学检测的可识别性之间达到良好的平衡。

检测这些组织中的感觉神经纤维有助于我们理解外周神经突生长和 sprouting⁴ 的调控机制，以及在不同病理条件下外周感觉传入纤维的解剖学变化。此外，还可研究在正常发育或病理状态下神经递质、受体、离子通道或其他表型标志物表达的变化^3,5-10。结合适当的电生理学、生物化学和行为学检测，外周感觉神经元染色模式的这些变化可用于验证与各种疼痛状态^6,9、炎症¹¹ 和神经病变^5,12 相关的假说。总之，这些技术提供了宝贵的 in vivo

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3mm Harris微型打孔器	材料	Ted Pella, Inc.	15094
灌流泵	材料	VWR 国际公司	23609-170
多聚甲醛	试剂	Fisher Scientific	T353
苦味酸	试剂	Sigma-Aldrich	239801
OCT包埋剂	试剂	Tissue-Tek	4583
Cyto-Freeze 冷冻喷雾剂	材料	对照公司	3118
山羊血清	试剂	Sigma-Aldrich	G9023
免疫染色用孵育板及盖子（大型）	材料	Research Products International Corp.	248270（托盘） 248270-A（盖子）
ImmEdge疏水屏障笔	材料	Vector Laboratories	H-4000
骆驼’s 发刷（#1 型厚度）	材料	Ted Pella, Inc.	11859
Pro‐长型金质封片剂	试剂	Invitrogen	P36930