组织制备及小鼠皮肤与四肢骨骼支配感觉神经纤维的免疫染色

摘要

外周感觉神经纤维亚型的免疫细胞化学鉴定（及其蛋白表达的检测）是理解外周感觉分子机制的关键。本文描述了用于外周/内脏组织样本（如皮肤和四肢骨骼）制备的方法，以实现对外周感觉神经纤维进行特异性免疫染色。

摘要

外周感觉神经纤维对物理、化学和温度等感觉刺激的检测及初级处理，是动物和人类感觉感知的关键。这些外周感觉神经纤维表达多种受体和离子通道蛋白，能够检测并启动特定的感觉刺激。目前已有一些方法可用于表征支配皮肤的外周感觉神经纤维的电生理特性，这些方法也可用于鉴定这些神经纤维中特定离子通道蛋白的功能性表达。然而，目前尚无类似电生理方法（且开发也极为困难）可用于检测支配其他内脏器官的外周感觉神经纤维中受体和离子通道蛋白的功能性表达，其中尤以骨骼等最具挑战性的组织为甚。此外，此类电生理方法也无法用于确定外周感觉神经纤维中非兴奋性蛋白的表达。因此，对外周/内脏组织样本进行免疫染色，是确定这些神经纤维中特定目标蛋白表达的最佳途径。迄今为止，大多数关于感觉神经元中蛋白表达的研究均采用感觉神经节的免疫染色方法，但其信息仅限于特定类型或亚群感觉神经元胞体中特定蛋白的表达。本文报道了用于外周感觉神经纤维免疫染色的外周/内脏组织样本制备的详细方法/方案。我们特别详述了从小鼠制备皮肤或足底穿刺活检样本以及骨骼（股骨）切片以进行外周感觉神经纤维免疫染色的具体方法。这些方法不仅对于定性确定外周感觉神经元中蛋白表达至关重要，还可提供一种定量分析手段，用于检测特定类型或亚群感觉纤维中蛋白表达水平的变化，以及在不同病理状态下感觉纤维数量和密度的形态学和/或解剖学改变。此外，这些方法不仅限于感觉神经纤维的染色，也可用于皮肤、骨骼及其他内脏组织中任何类型神经纤维的染色。

方案

1. 动物灌注

本研究中进行的所有动物实验均经爱荷华大学机构动物护理和使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于动物在科研中使用的指南。

1. 灌注前一天，配制1 L磷酸盐缓冲液（0.2 M PB，使用双蒸水）₂O，pH 7.4），并于 4°C将用于灌注和后固定过程。
2. 灌流当天，配制500 ml含4.0%多聚甲醛的0.1 M磷酸缓冲液（PFA，pH 7.4）固定液，该体积足以用于2只小鼠的灌流：将200 ml去离子水₂在玻璃烧杯中加热，持续30秒或直至接近沸腾。在通风橱中，向烧杯中加入20 g颗粒状多聚甲醛（PFA），并持续搅拌。逐滴加入5 ml 5 N NaOH，搅拌至溶液变澄清。当PFA完全溶解后，将溶液冷却至室温（RT）。在持续搅拌下缓慢加入250 ml 0.2 M PB。使用浓度逐渐降低的HCl溶液（6 N、1 N、0.1 N），将pH调节至7.4。定容至500 ml，并置于冰上冷却。同时，通过将0.2 M储备液与ddH₂O按1:1稀释，配制400 ml 0.1 M PB。₂O 并在冰上冷却。
3. 通过腹腔注射过量麻醉剂（戊巴比妥钠，80 mg/kg，使用27G针头）对小鼠进行麻醉。
4. 灌流过程中，使用50 ml 0.1 M PB（将0.2 M PB贮存液与ddH₂O按1:1稀释）₂O）和150 m....

讨论

本文详细介绍了用于免疫染色及外周感觉神经纤维检测的小鼠皮肤和骨组织切片的制备方法。由足底穿孔活检所获得的组织切片包含无毛皮肤和有毛皮肤，因此该方案可适用于任何类型的皮肤组织。这些技术也可用于对这些组织中的其他细胞类型进行染色（例如白细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞等）。如果严格按照步骤操作，这些方法能够在超微结构的最佳保存（通常通过戊二醛固定实现，但常导致抗原表位破坏和免疫染色质量下降）与免疫细胞化学检测的可识别性之间达到良好的平衡。

检测这些组织中的感觉神经纤维有助于我们理解外周神经突生长和 sprouting⁴ 的调控机制，以及在不同病理条件下外周感觉传入纤维的解剖学变化。此外，还可研究在正常发育或病理状态下神经递质、受体、离子通道或其他表型标志物表达的变化^3,5-10。结合适当的电生理学、生物化学和行为学检测，外周感觉神经元染色模式的这些变化可用于验证与各种疼痛状态^6,9、炎症¹¹ 和神经病变^5,12 相关的假说。总之，这些技术提供了宝贵的 in vivo

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3mm Harris微型打孔器	材料	Ted Pella, Inc.	15094
灌流泵	材料	VWR 国际公司	23609-170
多聚甲醛	试剂	Fisher Scientific	T353
苦味酸	试剂	Sigma-Aldrich	239801
OCT包埋剂	试剂	Tissue-Tek	4583
Cyto-Freeze 冷冻喷雾剂	材料	对照公司	3118
山羊血清	试剂	Sigma-Aldrich	G9023
免疫染色用孵育板及盖子（大型）	材料	Research Products International Corp.	248270（托盘） 248270-A（盖子）
ImmEdge疏水屏障笔	材料	Vector Laboratories	H-4000
骆驼’s 发刷（#1 型厚度）	材料	Ted Pella, Inc.	11859
Pro‐长型金质封片剂	试剂	Invitrogen	P36930