本方案介绍了一种用于器官培养的牛尾部椎间盘采集技术 体外 器官培养
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摘要
摘要
椎间盘（IVD）是脊柱中连接椎体与椎体的关节，其功能是传递脊柱载荷并为脊柱提供灵活性。椎间盘由三个部分组成：最内层的髓核（NP），被纤维环（AF）所包裹，以及两侧连接髓核和纤维环与椎体的软骨终板。由退行性椎间盘疾病（DDD）和椎间盘突出可能引起的盘源性疼痛，已被确认为现代社会中的一个主要问题。为了研究椎间盘退变的可能机制，含有活椎间盘细胞的体外器官培养系统具有很高的吸引力。完整牛尾部尾椎椎间盘的体外培养已发展为一种相关模型系统，可在良好控制的生理和力学环境中研究其力学-生物学特性。牛尾椎间盘相对容易大量获取，并且在细胞密度、细胞群体和尺寸方面与人类腰椎椎间盘非常相似。然而，以往保留软骨终板和骨性终板的牛尾部椎间盘获取技术在培养1-2天后即失败，原因是凝固的血液明显阻塞了营养通路。椎间盘是人体最大的无血管器官，因此髓核细胞的营养完全依赖于来自相邻椎体毛细血管芽的扩散。终板表面存在的骨碎片和凝血块可能阻碍营养物质向椎间盘中心的扩散，从而影响细胞活力。我们团队建立了一种相对快速的“破取”技术，可从尾部取出椎间盘，且污染风险较低。我们能够利用外科喷射灌洗系统对新鲜切割的骨性终板表面进行通透处理，有效清除血凝块和切割残留物，从而高效地重新开放营养物质向椎间盘中心扩散的通路。在培养前必须避免并去除椎体两侧的生长板。在本视频中，我们概述了制备过程中的关键步骤，并展示了在自由肿胀培养条件下维持14天高细胞活力的成功器官培养的关键技术。若能通过机械加载生物反应器维持适当的力学环境，培养时间还可进一步延长。本研究所展示的技术也可推广至其他动物物种，如猪、羊和兔的尾部及腰椎椎间盘分离。
方案
1. 椎间盘的采集
- 从当地屠宰场获取整条牛尾，若可能应选择无皮肤的牛尾，因为皮肤的存在会增加污染的风险（图2）。
- 准备一个大型砧板，并在砧板上设置无菌操作台及无菌器械（图2）。
- 在无菌超净工作台内，将用含55 mM柠檬酸钠的0.9%氯化钠溶液浸湿的无菌纱布准备好，并放入6孔板的每个孔中。
- 准备一个盆，用自来水将1:100稀释的聚维酮碘溶液（Betadine）配制好。
- 将整条牛尾浸入含有1%聚维酮碘溶液的盆中，持续5分钟。
- 用无菌纱布快速擦干牛尾，并将其放置在无菌操作台上。
- 使用#22号手术刀片小心地去除尾部周围的肌肉组织。
- 切除不需要的尾部部分，通常为尾部两端，因其包含相对较大或过小的椎间盘（IVD）（图3）。
- 使用#10号手术刀片进一步修整椎间盘周围的肌肉和肌腱，注意不要切到椎间盘的外层纤维环。
- 用外科皮肤标记笔标记椎间盘的腹侧（此步骤为可选，有助于在我们的生物反应器中确定轴向旋转的中心）。
- 轻轻活动尾部以定位椎间盘与椎骨的连接点，用手术刀片的钝边触感判断椎间盘与骨组织之间的边界。分离切口应位于距椎间盘向椎骨方向1–2 mm处。将定制的工业刀片夹具置于分离位置（图4）。
- 通过敲击定制的工业刀片夹具顶部，分离椎间盘与椎骨（图3）。
- 在椎间盘-椎骨连接的另一侧重复上述操作。
- 用含55 mM柠檬酸钠的0.9%氯化钠溶液浸湿的无菌纱布包裹分离得到的椎间盘。
- 继续分离椎间盘，直至获得所需数量的样本（通常可收获约6个，直径在10–20 mm之间）。
- 将喷射灌洗系统（Zimmer, inc.）连接至无菌乳酸林格氏液，5 L袋装液体较为适用（也可使用无菌PBS或0.9%生理盐水溶液）。
- 用镊子夹持椎间盘，使用Zimmer Pulsavac喷射灌洗系统对终板表面两侧进行喷射灌洗（图1C）。喷枪应以30–60°角对准终板表面，每侧冲洗约30秒（图1和图7）。
- 将椎间盘放回6孔板中，并用湿润纱布包裹，同时对下一个椎间盘样本进行喷射清洗。
- 椎间盘现已准备好用于器官培养及后续应用（如细胞活力检测、力学加载、器官培养等）（图1D）。
2. 代表性结果
用于评估椎间盘制备是否成功的检测指标可采用扩散实验，即用PBS配制小分子量荧光染料（如荧光红）的1%溶液2。将椎间盘置于至少100 mL染料溶液中，在自由溶胀条件下使染料被动扩散进入椎间盘，持续24小时。随后将椎间盘在液氮中速冻，再恢复至室温，并通过一系列丙酮转移步骤进行脱水处理（依次使用-80 °C预冷、-20 °C、4 °C，最后至室温的丙酮）。之后可将椎间盘包埋于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）中，用锋利刀片切割成100 μm厚的切片。这些切片可用任何标准明场显微镜观察，但优先推荐使用荧光显微镜，因为荧光红可发出红色荧光（图5-6）。经喷射灌洗步骤后，骨表面的小梁结构显得非常洁净（图7）。
成功的器官培养参数首先包括无污染、细胞活力保持（图8-9）、椎间盘高度以及整体“椎间盘完整性”，这些可通过组织学切片和沙黄O/快绿染色或Meyer苏木精3进行评估。我们已开发并发表了相关方案和宏程序4,5，用于对活体椎间盘组织进行染色，并利用共聚焦激光扫描显微镜及活/死细胞染色试剂盒（Molecular Probes, Invitrogen, 巴塞尔, 瑞士）在三维水平上扫描细胞活力。此外，我们进一步开发了一种宏程序和常规方法，基于NIH ImageJ平台4-6，实现对三维组织或三维载体中的细胞进行自动计数，以评估细胞活力。另有替代性方案被提出，即通过蛋白酶和II型胶原酶对细胞外基质进行连续消化，获得细胞悬液后进行染色，从而测定椎间盘细胞的活力7。早期版本的方案中，在椎间盘收获后、器官培养前，需在含有十倍浓度青霉素/链霉素的PBS中孵育10分钟。但随着喷射灌洗步骤的引入，该步骤已不再必要，因为喷射灌洗本身在培养过程中已显示出有利效果。
图 1. 制备具有完整终板及一层薄骨（1–2 mm）的牛尾椎椎间盘（IVD）的方法学步骤概述。A) 椎间盘（IVD）及其营养通路的示意图。B) 使用定制刀片夹具和工业锋利刀片切割出椎间盘的操作流程。C) 喷射灌洗步骤，以确保高细胞活力，并维持终板及两侧各1–2 mm骨组织的附着，从而支持营养交换。D) 最终，该椎间盘可置于生物反应器的样本腔中进行培养，或用于其他后续应用。
图 2. 上图：完整长度的新鲜牛尾（理想情况下应在死亡后2-3小时内获取，以确保细胞高存活率）。下图：约6月龄牛尾的X射线图像，显示骨性终板（EP）与椎体（VB）之间存在生长板（GP）及次级骨化中心。
图3. A) 在无菌条件下解剖牛尾所用的工具。B) 定制的刀片夹持器正在切割牛尾椎间盘以获取运动节段。C) 定制刀片夹持器的侧视图，配有标准工业刀片（Lutz，德国）。
图4. 去除周围肌肉和韧带后的牛尾示意图及实物图，展示用于切取运动节段的劈裂位点。应使用自制刀片夹具将部分椎体“劈开”，理想位置为距离软骨终板约1-2 mm处，以确保获得完整的骨表面。
图5. 喷淋冲洗步骤前（A）与步骤后（B）清洁效果的对比展示。注意喷淋处理后椎间盘节段骨表面的清洁程度。
图6. 新鲜制备的牛尾椎间盘（IVDs）在1%派洛宁红溶液中自由溶胀扩散24小时的实验，显示生长板的阻断作用。一张数字X射线矢状位图像显示仍含有生长板的椎间盘，以及另一张经矢状面切割的牛尾椎间盘组织块在自由扩散24小时后的荧光显微镜图像，可见软骨性和骨性终板结构。GP：生长板，2ndry CO：次级骨化中心。
图7. 新鲜制备的牛尾椎间盘（IVD）在1%派洛宁红溶液中自由溶胀24小时的实验，用于展示喷射灌洗处理的清洁效果。对切除的牛椎间盘组织进行矢状厚切片（约100 mm），骨性终板厚度约为1.5 mm，左侧为接受喷射灌洗处理的样本，右侧为未经处理的对照侧。插图显示所用喷雾模式，来自Zimmer创面清创系统，用于牛椎间盘离体组织在1%派洛宁红溶液中进行24小时自由扩散实验。
图8. 采用喷射灌洗法处理的牛椎间盘组织片段在自由肿胀条件下培养0天和14天后，分别获取的共聚焦成像堆栈（约250μm）的活/死细胞投影图像，包括髓核（NP）、内层纤维环（IA）和外层纤维环（OA）。绿色细胞 = 被钙黄绿素AM（乙酰甲酯）染色的活细胞，红色细胞 = 被碘化丙啶同源二聚体-1染色的死细胞核。
图9. 采用共聚焦激光扫描显微镜对活体组织进行三维层扫成像，评估椎间盘细胞活力。在自由膨胀条件下培养21天期间，髓核（NP）与纤维环（AF）的细胞活力变化。（均值 ± 标准误，N=6）。组间统计学差异通过非参数Kruskal-Wallis符号秩和检验进行分析。在髓核中，第21天与其他所有时间点之间存在显著差异；而在纤维环中，第7天与第0天之间存在显著差异。（* p < 0.05，** p < 0.01）。
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讨论
成功进行器官培养的第一步是确保外植体不被污染。在开始操作前，应先将尾部去皮。任何带入无菌实验室的动物毛发都可能带来污染风险。牛尾应尽可能新鲜（这会影响初始细胞的活力）。此外，建议使用碘伏清洗步骤，以进一步降低污染风险。分离椎间盘与椎体时，可不使用自制刀片夹具和锤子，而改用组织学带锯（切割时应使用PBS或林格氏液冷却金刚石锯片）。注意，带锯、样品夹持器和切割刀片均须保持无菌。此处演示的技术不仅限于牛尾椎间盘的分离，还可推广至其他动物物种，如猪、羊和兔的尾部甚至腰椎椎间盘的分离。在脊突存在的区域进行椎间盘采集时，必须首先完全去除所有突起结构。
图9中给出的细胞活力数据是在自由膨胀条件下培养长达21天后收集的，可作为参考。该方法在自由膨胀条件下可维持细胞活力达14天。21天时细胞活力下降可能是由于缺乏机械负荷，而机械负荷已被证明对促进营养物质通过终板扩散以及维持椎间盘细胞活力具有重要作用3。在静水压压缩和/或额外的昼夜负荷条件下，细胞活力很可能会更高8-10。
作为一种替代方案，可通过使用...
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致谢
本项目由瑞士国家科学基金会（SNF # 310030-127586/1）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 来自当地屠宰场的新鲜牛尾椎间盘组织（理想情况下在动物死亡后数小时内获取，且不含皮肤）。 | |||
| Pulsavac Plus AC 系统 | Zimmer 公司，瑞士 | 00-5150-486-01 | 使用髋部喷头并连接交流电源（配备8节AA电池盒的型号）时性能最佳–但效果较差且不够方便 |
| 高容量风扇喷雾头配防溅罩，12.7 cm 长度 | Zimmer inc.，瑞士 | 00-5150-175-00 | 有多种喷头可供选择，我们已成功测试了这一款 |
| 22号和10号手术刀片 | Swann-Morton | #10: 0201 #22: 0208 | |
| 手术刀片持柄 #3 和 #4 | 德国豪斯曼 | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 | |
| Lutz 工业刀片 | 吕茨，德国 | 1022.0884 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Invitrogen | 10010-023 | |
| 杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基） | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11960-044 | |
| 乳酸林格液’不含葡萄糖的溶液 | 比赫塞尔，瑞士 | 133 0002 | |
| 6孔多孔板 | Techno Plastic Products | 92006 | |
| 聚维酮碘溶液 | Mundipharma，瑞士 | 10055025 | |
| 外科皮肤标记笔 | Porex Surgical，瑞士 | 9560 | |
| 大型切菜板 | 任何品牌均可 |
参考文献
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