股动脉和股静脉插管用于采血、给药及清醒状态下的血压与心率测量

摘要

在大鼠中进行血管的慢性插管常用于物质给药、长时间采集血样或直接测量清醒状态下的血压。本实验将演示大鼠股动脉插管及其在清醒动物中相应的血压测量方法。

摘要

在多个研究领域中，实验室研究需要进入循环系统。在大鼠中使用长期植入的导管进行药理学研究，可使研究人员能够高效且人道地给药、反复采集血液样本，并有助于在清醒状态下直接测量血压和心率。导管植入后，即可实现长期取样。导管的通畅性及使用寿命取决于多种因素，包括所用封管液、冲洗方案以及导管材料。本视频将演示大鼠股动脉和股静脉导管植入的方法。此外，视频还将展示如何利用股静脉和股动脉导管进行血液采样、药物给予，以及如何利用动脉导管在清醒、自由活动的大鼠中测量血压和心率。通过将动物连接至带有旋转系统的系绳和背带装置，可在对动物干扰最小的情况下实现长期饲养并由研究人员采集样本。为维持导管通畅，需每日仔细维护导管，使用封管液（含100 U/ml肝素的生理盐水）、机械研磨的钝头注射器针头以及注射器滤器，以尽量减少潜在污染。通过严格的无菌手术技术、合适的导管材料以及细致的导管维护操作，可长期（数周）维持导管通畅并保障动物健康。

方案

1. 手术开始前

注意：在开始任何动物实验操作之前，请确保已通过所在机构/组织获得适当的许可。对于所有存活手术，必须在无菌条件下进行，并使用适当的镇痛药物和抗生素，以确保手术成功。

1. 开始导管插入术之前，使用无菌生理盐水冲洗导管，检查其是否通畅。
2. 对大鼠进行麻醉。
3. 准备大鼠以进行手术操作。
   1. 剃除手术区域的毛发，手术区域包括颈部背面（肩胛骨之间）以及内侧腿部区域。
   2. 分别使用碘伏和70%乙醇棉球进行擦洗，从中心部位开始，向外做环形擦拭。每个区域重复此过程3次，最后用70%乙醇完成最终清洁。
   3. 将动物置于无菌表面上，并在手术区域覆盖无菌手术巾。（使用Press-n-Seal薄膜是理想的手术覆盖方法，可使研究人员在整个操作过程中持续监测动物状态。）
4. 确保手术操作所需的所有外科器械均已灭菌。

2. 导管置入术前手术区域的准备

1. 将大鼠俯卧（腹部朝下），使用剪刀或手术刀在其肩胛骨水平的颈部背部做一条长约½英寸（12 mm）的横向切口，然后钝性分离皮下组织，形成一个约硬币大小的“皮下袋”。该区域用于放置一小段导管，以补偿动物的生长和/或活动，防止导管被牵拉而导致其从动脉中脱出。（此步骤也可在导管穿隧前立即进行。）
2. 将大鼠翻转为仰卧位，在腹股沟区域做一切口（沿后肢自然角度做长约½英寸（12 mm）的切口）。
3. 钝性分离以分开结缔组织（见图1）（可使用钝头剪刀、止血钳、棉签等）（通常将钝头剪刀或棉签保持在45度角，有助于更易定位目标区域），直至暴露股动脉和股静脉。
   1. 静脉呈深红色，动脉比静脉颜色更透明、更明亮。沿动脉走行的神经呈淡白色。
4. 在腿部区域进行钝性分离，于皮肤下方沿腿内侧形成一个约硬币大小的小型开放区域（即“皮下袋”），用于放置一小段导管（再次强调，这是为了适应动物的活动及长期植入时的生长变化）。
5. 将牵开器置入切口区域，以便充分暴露动脉和静脉。
6. 使用精细尖头镊子轻轻将沿股动脉走行的神经（颜色呈淡白色）从动脉和静脉上分离。（见图2）注意避免切割或损伤神经。
7. 将动脉和静脉作为一个整体进行分离，尽量暴露长约¼英寸（5–7 mm）的动脉/静脉段。
8. 重复操作，进一步将静脉与动脉分离。保持手术器械（如精细尖头镊子）与血管垂直，并沿平行方向分离血管，以避免撕裂、穿刺或损伤血管。可通过将精细尖头镊子从下方轻轻插入动脉与静脉之间，缓慢张开镊子并重复此动作，逐步分离血管。注意：若发生撕裂或出血，应使用无菌棉签或2×2纱布对出血部位施加压力，直至出血停止，然后继续手术操作。

3. 置入导管隧道

1. 将无菌生理盐水浸湿的 2 x 2 纱布覆盖于切口处，并将动物翻转至俯卧位。
2. 将 Rochester Pean 止血钳（长直止血钳）插入背部先前制作的切口，沿皮下向背部下方引导至髋部水平［确保止血钳尖端朝上（不要朝向脊柱），以避免损伤脊髓］。在髋部区域附近，将止血钳尖端转向腿部切口位置，并将止血钳尖端从已准备好的腿部切口推出。
3. 用止血钳轻轻夹住导管末端（非插入动脉/静脉的一端），缓慢将导管经已创建的皮下通道拉出，最终从颈部切口引出。
4. 将装有 20 U/ml 肝素/生理盐水的适当钝头针注射器连接至各导管末端，用肝素化生理盐水填充导管（确保无气泡）。再次检查导管是否通畅，确认导管未受损伤。保持注射器连接在导管末端，以防止空气进入导管系统，并再次将大鼠翻转至仰卧位。

4. 将导管插入股静脉和股动脉（图3）

1. 将一段无菌的4.0丝线对折后置于股静脉下方，然后在折叠端将丝线剪断，此时静脉下方将有两段丝线。或者，也可分别将两段4.0丝线单独置于静脉下方。
2. 将置于静脉下方的两段丝线分开，一段朝向腿部（远端），另一段朝向躯干。在靠近躯干的一侧打一个松结，然后用小型止血钳夹住丝线并拉紧，但暂不打紧结。将另一段丝线尽可能向腿部（远端）牵拉，并打成三重结，再用小型止血钳夹住丝线并拉紧。此方法可使静脉充盈血液，便于进行插入导管所需的切口（步骤4）。
3. 在静脉上滴加1–2滴利多卡因。
4. 使用Vanna显微解剖剪，在静脉壁上以约1/4厚度、45度角做一小切口。
5. 将精细尖头镊子（45号镊子）插入切口，同时使用另一把镊子小心地将静脉导管送入静脉。轻轻张开已插入静脉内的镊子，以便研究人员能轻柔地将静脉导管置于镊子下方并推进静脉内。
6. 当导管完全插入（约6–7 cm）时（制作导管时已在导管上做标记，以帮助术者判断导管是否完全插入）（此位置可使静脉导管进入腹腔下腔静脉），收紧围绕静脉和导管的前侧结扎线，打成三重结（确保未阻塞静脉）。使用靠近腿部的丝线缝合线（后侧结扎线）再次固定导管（三重结），并确认位置。缓慢回抽注射器，直至导管内可见少量血液，以确认缝合结未过紧且导管功能正常。检查完毕后，下压注射器推杆，直至导管内血液不再可见。
   注意：如有需要，可在股静脉内插入两根导管。
7. 重复步骤9–13以放置股动脉导管，但需注意以下例外情况：
   1. 在进行导管置入切口前，先将靠近腿部（后侧）的丝线打成三重结并拉紧，再在靠近躯干（前侧）处打松结。此操作可使动脉充盈血液，便于切割。在切开动脉前，必须将近端缝线拉紧以阻断动脉，防止切割时失血。
   2. 将动脉导管从股动脉插入约5 cm（此位置可使导管进入腹主动脉）。
   3. 用缝线固定导管时，应确保缝线不过紧，以免阻塞导管。

5. 手术收尾

1. 在导管上制作一个硬币大小（相当于十分之一到四分之一美元硬币）的环，将其放置于腿部内侧（该环应置于先前钝性分离的区域）。放置两根导管后，使用1-2针5.0外科缝线将导管固定于肌肉层。
2. 使用4.0 Ethilon缝线以间断缝合法关闭切口。
3. 将大鼠翻转至俯卧位，在导管上再制作一个约四分之一美元硬币大小的环，并将其置入背部已解剖出的皮下 pocket 中。使用缝线关闭切口。
4. 使用一滴Vetbond将背部的导管固定。
5. 用带垫片的止血钳夹住靠近背部切口处的导管，然后从导管末端取下注射器。
6. 为大鼠穿上系绳式背心，盖上导管帽（以维持肝素封管），并移除带垫片的止血钳。

——长期维持时，用 20 U/ml 肝素/生理盐水替换导管中的生理盐水溶液。

6. 导管维护（操作过程中应佩戴无菌手套）

1. 用包有垫料的止血钳夹紧导管。
2. 取下导管塞。
3. 将装有封管液的钝头注射器连接到导管上。
4. 松开止血钳。
5. 用封管液充满导管（体积已预先确定，通常为 0.3 ml）。
6. 在冲洗的同时夹紧导管，以防止血液回流至导管尖端，然后取下注射器。
7. 更换导管塞。
8. 松开止血钳，轻轻向内推入导管塞，以确保导管尖端无血液残留。

7. 血液采样（操作过程中应佩戴无菌手套）

用带垫镊子夹住导管。

1. 移除导管塞。
2. 使用钝头注射器缓慢抽出封管液，并弃去。
3. 将采样注射器连接至导管，缓慢抽出样本。
4. 用带垫镊子夹闭导管，将装有封管液的注射器连接至导管，并重新注入封管液以充满导管。
5. 在用溶液重新填充导管时保持导管夹闭状态。
6. 重新插入导管塞。
7. 移除带垫镊子，轻轻将导管塞进一步推入少许。

8. 药物输注

1. 使用带垫片的止血钳夹住导管。
2. 取下导管塞。
3. 用钝头注射器缓慢抽出封管液，并弃去。
4. 将装有药物的注射器连接到导管上，并将药物注入动物体内。
   • 若需多次注射，可使用三通旋塞作为中间连接装置，从而减少注入动物体内的液体量。
   • 也可连接带有无菌滤器的恒速输注注射泵，用于持续输注。
5. 用带垫片的止血钳夹住导管，将装有封管液的注射器接上导管，并用封管液重新充满导管。
6. 在用溶液重新充满导管时，保持导管处于夹闭状态。
7. 重新插入导管塞。
8. 移除带垫片的止血钳，并轻轻将导管塞进一步推入少许。

9. 血压和心率采样

1. 使用带垫片的止血钳夹闭动脉导管，并移除导管塞。
2. 将动脉导管连接至压力传感器。
3. 按照制造商说明操作软件以采集血压数据。
4. 在血压监测期结束时，使用带垫片的止血钳夹闭导管，并与传感器断开连接。
5. 用封管液冲洗导管，并按上述方法重新安装导管塞。

10. 代表性结果

从清醒且自由活动的动物中测得的代表性血压值如图4所示。通过股静脉导管给予苯肾上腺素（3 µg/kg，静脉注射），该药物为α1肾上腺素受体激动剂，用于升高血压，同时通过股动脉导管持续监测血压变化。随后给予非选择性α-肾上腺素受体拮抗剂酚妥拉明（4 mg/kg，静脉注射），以降低血压。

图1. 组织钝性分离。将大鼠仰卧位固定后，在后肢夹角处做一个约半英寸（12 mm）的切口，使用钝头剪刀或止血钳钝性分离结缔组织，以暴露股动脉和股静脉。

图2. 股动脉和股静脉与结缔组织的分离。

图 3. 导管置入。使用Vanna显微解剖剪，在血管壁约1/4深度处以45度角做一小切口（上图），将尖头镊插入切口，并用另一把镊子辅助将导管送入血管内（中图）。最后，导管置入到位后，用缝线将导管固定（下图）。

图4. 从清醒、自由活动的动物中记录的代表性血压测量结果。

讨论

动脉和静脉插管技术历来被用于在实验大鼠动物模型中进行急性和慢性血压监测、血液采样以及物质输注^1-4。这些外科操作技术的主要优势在于，能够在对动物干扰和应激最小化的情况下，完成包括血液采样、药物给药和血压监测在内的各项监测操作¹。许多研究人员已撰写相关方案，并建立了各自实验室特有的手术操作方法^5-8。本视频和图示展示了我们实验室在股动脉和股静脉插管操作中行之有效的技术流程。

大鼠因其体型小、易于操作，常被用于实验室中的多种科学研究。在动物体内进行慢性导管植入的部位有多个，包括颈静脉、腹主动脉、颈动脉和股动脉等。与其他导管植入部位相比，大鼠股动脉部位的慢性导管植入可延长导管通畅时间，并且术后动物体重恢复最快⁹。

许多研究人员已使用留置导管进行急性和慢性血液采样^1-5,11-13。在许多研究中，需要对动物进行多次采血，而外部插管/导管植入是一种具有优势的方法，因其具有非创伤性的特点；此外，该操作可在动物清醒状态下进行，因此不受麻醉剂影响，且动物可自由活动^1,10。长期以来，关于在啮齿类动物中获取血液样本及测定应激激素的最佳方法一直存在争议^6,13。在药代动力学研究中，对实验动物进行导管植入可利用慢性植入式导管系统，在几乎无需束缚的情况下实现重复采血。此外，研究显示，与经过抓取（30秒）和/或束缚（5分钟）处理的动物相比，自由活动大鼠（颈静脉导管）血浆中肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺的基础浓度较低¹⁴。另一种评估应激水平升高的方法是检测血浆皮质酮水平。此前有研究指出，即使在手术后恢复三至四天，慢性插管大鼠的血浆皮质酮水平仍处于升高状态¹⁵。然而，近年来方法学的改进表明，颈静脉插管大鼠与未插管大鼠之间的基础血浆皮质酮水平并无差异¹⁶。此外，采用高效液相色谱法（HPLC）进行皮质酮分析也显示，束缚应激会导致皮质酮水平升高，而颈静脉导管植入后其水平则保持稳定¹⁶。

慢性插管的另一个用途是测量啮齿类动物的血压和心率。目前有多种方法可用于大鼠血压和心率的测量，包括无创尾套法、遥测技术以及直接留置导管法。每种方法均有其优缺点，相关细节已在其他文献中详细描述。充满液体的留置导管可植入大鼠的多条动脉中，股动脉仅为可用于测量的动脉之一。在进行血压/心率测定时，导管的远端连接至经过校准的压力换能器。导管可置于保护性弹簧套管内，并通过滑环装置连接，以允许动物自由活动；也可连接至外科手术植入动物体内的固定按钮上。留置导管的优点在于可最大程度减少动物长期承受的应激反应^17,18。此外，该方法所用材料成本较低，压力测定的校准简便，并可在相对低应激条件下持续进行数周以上的长期监测¹⁹。需要指出的是，该技术也存在一些缺点，例如属于外科侵入性操作，需对导管进行维护以保持通畅，导管植入可能导致动脉损伤，以及存在感染风险等。

对于血压的慢性测量，通过长期植入的动脉导管进行直接记录在技术上更具挑战性，但其准确性更高，且可连续进行而不会干扰动物。尾套法测量的准确性较低，但无需手术，且可重复进行。尾套法测量需要抓取动物并对其进行加热，以扩张尾部血管，便于脉搏检测²⁰。抓取操作以及附加的热应激可能影响血压测量结果，因而无法提供真正准确的数据。此外，这种非直接的尾套法测量难以同时方便地进行血液采样或药物给予。

实现直接测量的另一种方法是采用遥测技术。遥测技术能够在无束缚、无麻醉的清醒自由活动动物中，连续长时间地高质量记录血压（及其他指标）¹⁸。然而，尽管遥测设备性能理想，其成本却非常高昂。与遥测技术相比，导管插管法的优势包括：降低“建立”和运行成本，能够在清醒自由活动的动物中方便地给予药物和采集血液样本。对实验动物给药或施加物质以及采集血液样本时，可最大程度减少对动物的干扰，从而降低动物应激反应，获得更为准确的测量结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动脉导管	耗材	SAI 输注	RFA-01
静脉导管	耗材	Scientific Commodities Inc.	BB518-20 & BB31785-V/2
27g 1/2" 钝针	仪器设备	Integrated Dispensing Solutions, Inc.	9991113
23g 1/2" 钝针	仪器设备	Integrated Dispensing Solutions, Inc.	9991109
PowerLab/8SP	仪器设备	ADInstruments	ML765
四桥	仪器设备	ADInstruments	ML118
LabChart 7.2	软件	ADInstruments
带止流阀的血压传感器 & 电缆	仪器设备	ADInstruments	MLT844
单通道旋转接头	仪器设备	英斯特实验室公司	375/22PS
单轴-配重平衡旋转支架	仪器设备	Instech Laboratories, Inc	CM375BP
Covance 输注背心	仪器设备	Instech Laboratories, Inc	CIH105
台式异氟烷麻醉机	仪器设备	Protech International, Inc.	61020
啮齿类动物麻醉面罩	仪器设备	Protech International, Inc.	RAM-02
啮齿类动物诱导室	仪器设备	Protech International, Inc.	RIC-01
麻醉气体过滤罐	仪器设备	Protech International, Inc.	80120
台式层流罩	仪器设备	Sentry Air Systems, Inc.	SS-200-WSL
奥斯特金A5	仪器设备	Oster 专业产品	78005-140
带双蛇形导管的光纤光源	仪器设备	LW Scientific, Inc.	ILL-1502-DGG1
Deltaphase 等温垫	仪器设备	Braintree Scientific, Inc.	39DP
棉签	耗材	索伦制造公司	36200
2英寸×2英寸纱布垫	耗材	肯德尔	2146
5-0 尼龙缝合线	耗材	Ethicon Inc.	661G
4-0 丝线缝合线	耗材	德克纳特尔	8-S, 136075-0208
组织粘合剂	耗材	3M	1469SB
碎片 & 固定镊	仪器设备	George Tiemann & 公司	160-55
学生用组织镊	仪器设备	Fine Science Tools	91121-12
微型镊子/布拉肯镊子	仪器设备	George Tiemann & 公司	10-1942
超细格雷夫镊	仪器设备	Fine Science Tools	11152-10
Olsen-Hegar 持针器	仪器设备	精细科学工具	12002-12
学生用霍尔斯特德-蚊式止血钳	仪器设备	精细科学工具	91308-12
罗切斯特弯头止血钳	仪器设备	生物医学研究仪器	31-1640
学生用手术剪	仪器设备	精细科学工具	91402-12
杜蒙镊	仪器设备	精细科学工具	11251-35
显微解剖剪	仪器设备	George Tiemann & 公司	160-210
斜视剪刀	仪器设备	Fine Science Tools	14075-11
哈特曼止血钳	仪器设备	Fine Science Tools	13003-10
组织剪	仪器设备	George Tiemann & 公司	160-150
牵开器	仪器设备	定制