我们开发了用于胸腺活体成像采集的新型实验工具和方案。该技术将有助于识别胸腺内发生T细胞发育的“微环境”。
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摘要
摘要
双光子显微镜（TPM）能够在组织和器官内部深层区域进行图像采集。结合新型立体定位工具和手术方法的发展，TPM 已成为识别器官内“微环境”以及记录活体动物中细胞“行为”的强大技术。尽管活体成像能够提供最接近细胞在器官内真实行为的信息，但与替代性的离体（ex vivo）成像相比，它在所需设备和操作流程方面更加费时且技术要求更高。因此，我们描述了一种手术方法以及一种新型的“立体定位”器官固定装置，可用于追踪胸腺内 Foxp3+ 细胞的运动。
Foxp3 是调节性T细胞（Tregs）生成的主要调控因子。此外，这些细胞可根据其来源进行分类：即在胸腺中分化发育的Tregs被称为“天然存在的Tregs”（nTregs），与之相对的是在外周转化而来的Tregs（pTregs）。尽管已有大量文献报道了这些T细胞的表型与生理特性，但关于它们的 体内 与其他细胞的相互作用。这一缺陷可能源于缺乏能够实现此类观察的技术。本文所述的实验方案为解决这一问题提供了有效方法。
我们的方案采用无胸腺裸鼠，这些小鼠由于DNA序列中存在点突变，导致包括胸腺上皮细胞在内的某些上皮细胞的分化受到损害。裸鼠经γ射线照射后，通过移植Foxp3-KI小鼠的骨髓（BM）进行重建。gfp/gfp 小鼠。骨髓恢复后（6周），每只动物在肾包膜内接受胚胎胸腺移植。胸腺移植成功后（6周），动物被麻醉，暴露包含移植胸腺的肾脏，固定于器官固定装置中，并在生理条件下维持 体内 通过双光子显微成像（TPM）进行成像。我们一直采用该方法研究药物对调节性T细胞生成的影响。
方案
1. 动物准备
重要提示：骨髓细胞悬液制备和胸腺移植操作均在无菌条件下进行。骨髓细胞悬液在细胞培养室的生物安全柜内制备，而胸腺移植手术则在动物实验设施内的手术室中进行。为维持并确保上述无菌环境，我们无法在这些区域进行视频拍摄。然而，所有手术器械均已高压灭菌，手术台面在操作前已使用Virkon（Pharmacal Research Laboratories Inc.）和70%乙醇进行清洁消毒。所有实验操作均经机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并符合欧洲实验动物科学协会联合会（FELASA）的指导原则。批准文号为AO10/2010。所有影像学实验均为终末性操作，动物在完成影像采集后立即实施安乐死。
具体步骤如下：
- 使用 γ-射线辐照器对 8 周龄的裸鼠进行 900 rads 的辐照，以破坏骨髓（BM）内的内源性造血前体细胞。辐照后，将动物放回笼中，直至准备好供体骨髓细胞用于静脉注射及后续的骨髓重建。该骨髓移植操作在辐照后 1 小时内完成。
- 分离骨髓供体动物。通常一只动物后肢的胫骨和股骨足以重建最多 3 只受体动物的骨髓。使用 CO2 实施安乐死后，取下后肢，并去除骨骼上的皮肤和肌肉组织。
- 剪断每根骨头的闭合端，用 PBS（或 RPMI）冲洗，或在研钵中用研杵将所有骨头研碎，加入 2 ml PBS（或 RPMI）以获取骨髓细胞。
- 通过 P1000 移液器反复强力吸打，将骨髓组织分散成单细胞悬液。或者，也可将骨髓悬液通过 21G 注射器针头反复推注数次。离心（400g，5 分钟，室温），用 PBS 重悬细胞，然后静脉注射至辐照后的裸鼠受体中。在我们的实验中，使用了来自 Foxp3-KIgfp/gfp 小鼠的骨髓，其中所有调节性 T 细胞（Tregs）均表达 GFP1。
- 供体骨髓的接受过程发生在移植后的最初几天内，因为未进行骨髓重建的动物无法存活超过 14 天。然而，应等待 4 至 6 周，以确保所有骨髓组分完全恢复。在辐照后的第一周，将复方新诺明（Bactrim，Roche）加入饮水中（2 mg/ml），以降低细菌感染的风险。
- 胚胎胸腺移植方法已有报道2。简而言之，开始配对同源品系小鼠，并每天检查阴栓（交配成功的证据）。将发现阴栓的雌鼠单独饲养，并在妊娠第 15 天（发现阴栓当天为妊娠第 1 天）使用 CO2 实施安乐死。取出胚胎并分离胸腺。将胚胎胸腺置于冷 PBS 中，直至进行移植。
- 进行胸腺移植时，使用氯胺酮（120 μg/g 小鼠体重）/赛拉嗪（16 μg/g 小鼠体重）对骨髓受体裸鼠进行麻醉，并将其置于 37°C 的加热垫上，直至失去意识。
- 外科暴露肾脏以进行胸腺移植。首先用 ChloraPrep（Carefusion Inc.）和 70% 乙醇对皮肤进行消毒。然后，在动物背部侧方皮肤上做一道长约 1 cm 的切口，位置位于最后胸椎肋骨下方约 2 mm 处。
- 切开腹膜腔，取出该侧肾脏。用手术刀片在肾包膜上做一个小的浅表切口。使用尖端极细的镊子在受体小鼠肾包膜下创建一个囊腔，并将最多 4 个胸腺叶植入该囊腔内。
- 将肾脏复位，用一到两针缝合腹膜腔，然后使用相同缝合方法关闭小鼠皮肤。也可选择使用外科胶水进行缝合。
- 手术结束后立即皮下注射镇痛剂（布托啡诺，5 mg/kg），以减轻动物疼痛，并将动物留在加热垫上直至从麻醉中开始恢复。移植后前 3 天，将小鼠单独饲养，以防止同笼动物撕扯缝线。术后 1 周拆除缝线。
- 裸鼠缺乏 T 细胞。因此，可通过监测血液中 CD4+ 或 CD8+ T 细胞的比例来评估胸腺移植物的接受情况。在胸腺移植后两周起，每周采血一次，使用抗 CD4 和抗 CD8 单克隆抗体（MAbs）对血液进行染色。当 CD4:CD8 比例约为 2:1 时，表明移植的胸腺已完全功能化（图 1）。
2. 活体成像采集
提前准备好所需的所有材料，并放置在一旁。
- 使用与第1.5项所述相同剂量的氯胺酮/赛拉嗪麻醉动物，并将其置于37°C的加热垫上。静脉注射100 μl 罗丹明B异硫氰酸酯-葡聚糖（20 mg/ml溶于PBS中），以便后续观察血流情况。
- 按照第1.6项中先前描述的方案暴露移植胸腺所在的肾脏。
- 为防止肾脏回缩至原始位置，用缝线闭合皮肤切口的两侧。
- 将一块浸有PBS的棉片覆盖在器官表面，以保持其湿润。
- 将加热垫放置在动物固定装置的载物台上（图2A）。
- 将动物放置在动物固定装置内的加热垫上，使器官朝上（图2B）。
- 使用薄铝箔制成的夹子从器官两侧夹住组织（图2C）。
- 关闭动物固定装置，并将顶部加热探针尽可能靠近组织放置（图2D）。该加热探针持续测量器官温度，并将信息传送给加热器以调节电流，从而维持组织温度在37°C。
- 移除浸有PBS的棉片，并在样本上覆盖30°C的低熔点琼脂糖（2%溶于PBS中）。
- 用顶部加热装置完全覆盖整个样本（图2E）。该加热装置的开口处装有盖玻片，用于隔离琼脂糖与物镜（图2F）。监测小鼠的麻醉状态，每40分钟追加半剂量麻醉剂。图像采集完成后，使用CO2对动物实施安乐死。
注意：铝箔夹和顶部加热器的图片见图3。
3. 双光子成像采集
我们使用了一台正置式“Prairie Ultima X-Y”双光子显微镜。该系统配备了一台钛宝石激光器、四个顶部PMT，可同时进行最多四个通道的信号采集，以及一个20倍水浸物镜。
- 打开钛宝石激光器及整个显微镜系统。
- 根据所需波长安装二向色镜和滤光片组。在本实验中，我们使用了 Olympus-BX2 Chroma 滤光片架，其中包含一个 565 nm 二向色镜、一个 525/50 nm 滤光片（用于 Foxp3-GFP 信号）和一个 595/50 nm 滤光片（用于血管内 Dextran-Rhodamine-B 信号）。所用激光波长范围为 880 至 900 nm。
- 将动物固定装置安装到显微镜上，连接并开启所有加热装置，在顶部加热器开口处加水，小心地将物镜浸入水中，并对准血管或某些 GFP-Treg 细胞进行聚焦。
- 利用显微镜的 x、y、z 外部控制系统，快速扫描组织以定位感兴趣区域。
- 调节光电倍增管（PMT）的增益，以优化颜色分离效果，并尽量减少实现足够信噪比所需的激光强度。尽量使用最低限度的激光功率，以避免对组织造成光损伤。
- 一旦定位到感兴趣区域，即开始延时成像。在本实验中，典型的 5D（x、y、z、t 和颜色）图像采集方案包括：对深度为 50 μm 的组织体积进行连续成像，z 轴步进为 4.0 μm，x 和 y 方向长度各为 140 μm。每个体积的采集时间约为 30 秒，因此 60 次采集可完成约 30 分钟的图像采集。
- 将数据传输至机构服务器，并使用 ImageJ、Imaris 或 Volocity 软件进行多维图像重建和细胞追踪分析。
4. 典型结果
图 1. 胚胎胸腺的接受与功能。 骨髓重建后，将胚胎胸腺移植至骨髓重建的动物体内；胸腺移植两周后，每周采血一次，通过抗 CD4 或抗 CD8 单克隆抗体染色检测 T 细胞亚群的比例。我们认为，当动物体内 CD4:CD8 比值约为 1.5–2.0:1 时，表明胸腺成功被接受（A）。为验证其功能，我们处死部分胸腺移植动物，并将其不同胸腺细胞亚群的比例与野生型小鼠进行比较（B）。这些动物中双阴性（DN；CD4-CD8- 胸腺细胞）亚群（通过抗 CD25 和抗 CD44 单克隆抗体染色鉴定）、双阳性（DP；CD4+CD8+ 胸腺细胞）以及单阳性（SP）CD4+ 或 CD8+ 胸腺细胞的比例与野生型小鼠相似。
图 2. 动物固定装置组装示意图。 动物在深度麻醉后置于加热垫上，该加热垫事先已安装于动物固定架的载物台上（A）。含有移植胸腺的肾脏朝上放置（B）。使用铝箔制成的夹具轻柔地夹住整个肾脏（C），以固定其位置。图 1C 插图为夹具的细节示意图。将动物固定装置的上部结构安装到位（D）。移除覆盖在器官表面的 PBS 浸润棉片，替换为温热的低熔点琼脂糖，并放置上部加热装置（E）。最后，将整个装置转移至显微镜下，图中以物镜表示（F）。
图3. 支架部件的细节。 这些图片显示了夹持肾脏（B）的铝箔夹（A）。同时请注意移植胸腺所在区域，这大致指示了应切开胸腺囊并制作囊袋以植入胚胎胸腺的位置。顶部加热器盖玻片（C）使用硅胶粘合剂固定在其底座部分（D）上。
视频 1. 在整个过程中保持生理氧浓度和温度（37°C）的条件下，对胸腺内 Foxp3-GFP+ 胸腺细胞进行活体成像。请注意血流及调节性T细胞（Tregs）的运动。这些细胞的运动速度可被测量，并可与已发表的数据进行比较。点击此处观看视频。
视频 2. 在维持血流的情况下，于 30°C 条件下对胸腺内调节性 T 细胞（Tregs）进行活体成像。请注意，细胞呈现圆形且无运动。点击此处观看视频。
讨论
本文中，我们展示了在活体动物内对胸腺细胞进行双光子成像的操作步骤。同时，我们还描述了一些需要严格控制的参数，例如成像过程中血液流动的维持以及器官温度的保持。然而，尽管已采取谨慎措施以确保器官稳定，仍可能出现诸如“器官漂移”等运动伪影。可通过开发专门针对此类问题的算法来进行后续图像校正。进一步的图像分析也可能为新实验方案的建立提供依据，以期最大限度地减少误差。
胸腺是所有T细胞产生的器官，因此也是免疫学家研究γδ、CD4或CD8 T细胞生成过程时关注的核心器官。大多数关于T细胞的研究均基于不同干预后这些细胞数量和/或稳定性的差异 体外/体内 操作。然而，只有在 体内 通过可视化，我们可以观察到参与维持稳态的免疫系统细胞之间的相互作用3-7因此， 体内 观察胸腺细胞可能是目前深入理解T细胞生物学所缺失的最重要信息之一。活体双光子显微成像（intravital TPM）能够详细呈现T细胞的运动行为与相互作用，本文展示了该技术如何应用于胸腺细胞的深入研究。然而，每种技术均有其局限性。尽管活体成像在反映细胞体内行为方面最为准确，但离体器官成像操作更为简便，且已被广泛用于获取免疫系统的重要信息8,9此外，不可否认的是，活体成像技术需要通过手术暴露麻醉动物的组织和血管，这一操作本身可能导致整个器官生理状态的改变。10然而，也存在一些非侵入性方法，可消除手术操作所导致的伪影11 并正在开发新的方法，以更好地提前准备将要使用的动物12因此，新的外科手术技术和工具将最大限度地减少或绕过活体成像采集的实际限制，并逐渐为科学界所广泛采用。
我们已证明，所描述的方法是可行的，并且能够报告我们使用过的所有体内系统性操作，例如药物给药。因此，我们建议将该方法与现有的离体技术结合使用，以补充并进一步加强关于胸腺细胞发育的研究。
披露
我们无可披露的内容。
致谢
我们感谢 David Olivieri 博士对本手稿的审阅，Nuno Moreno 博士在动物固定装置和加热垫搭建过程中提供的后勤帮助，以及 Vijay K. Kuchroo 博士慷慨捐赠 Foxp3-KIgfp/gfp 小鼠。本工作由葡萄牙“科学技术基金会”（FCT）资助，项目编号 # PTDC/EBB-BIO/115514/2009。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 罗丹明B异硫氰酸酯-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | R9379 | 配制20 mg/ml的储存液 | |
| 双光子显微镜 | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| 钛宝石激光器 | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20倍/1.00数值孔径浸没式物镜 | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| 滤光片/二向色镜支架 | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 滤光片 | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 滤光片 | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm 二向色镜 | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris 软件 | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
参考文献
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