我们介绍了一种利用激光扫描共聚焦显微镜从活细胞中分离快速（微秒级）钙信号与较慢钙流的方法。该方法通过记录细胞内数百像素的线扫描，检测钙离子指示剂的荧光强度波动。利用直方图分析，可分离出不同时间尺度的钙流信号。
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摘要
摘要
心肌细胞具有多种钙2+ 不同时长的流共同作用以优化功能 1,2钙离子变化2+ 对细胞外因子的反应活性主要由磷脂酶Cβ- Gα调控q 位于质膜上的通路，可被乙酰胆碱等物质激活 3,4我们最近发现，质膜蛋白结构域中的小窝（caveolae）5,6 可捕获激活的Gαq 7这种捕获作用能够稳定Gα的激活状态q 并导致Ca持续延长2+ 心肌细胞及其他细胞类型中的信号8我们通过在活体心肌细胞中快速测量动态钙反应，揭示了这一令人意外的结果。简言之，细胞被加载一种荧光Ca2+ 指示剂。在我们的研究中，我们使用了Ca2+ 绿色荧光染料（Invitrogen, Inc.），其在结合钙离子后荧光发射强度增强。随后使用激光扫描共聚焦显微镜的线扫描模式记录荧光强度。该方法可快速获取沿选定线条上各像素荧光强度随时间变化的过程，从而在微秒时间尺度上生成数百条时间轨迹。这些极快速的时间轨迹被导入Excel，随后转入Sigmaplot进行分析，并与电子噪声、游离染料及其他对照组获得的轨迹进行比较。用于解析Ca2+ 不同流量速率的响应，我们进行了直方图分析，将像素强度按时间分箱。分箱使我们能够对超过500条扫描轨迹进行分组，并在单个图中空间和时间上可视化汇总结果。因此，缓慢的Ca2+ 由于峰位置不同和噪声干扰，当扫描图谱叠加时难以分辨的波动，在分箱直方图中可清晰显现。在测量时间尺度上非常快速的流速，在极短的时间分箱中表现为强度的窄分布，而较长的Ca2+ 波形显示了在较长时间区间内分布较广的分组数据。这些不同的时间分布使我们能够解析Ca2+细胞中的流变及其对各类细胞事件的影响
方案
1. 使用钙离子指示剂对细胞进行负载
- 将细胞接种于35 mm玻璃底MatTek培养皿（或其他玻璃底观察室）中。
- 若使用原代心肌细胞，需在接种前一天用10 μg/mL层粘连蛋白（laminin）包被培养室。将心肌细胞（来源于成年犬、新生大鼠或其他生物体）接种于KB缓冲液（K-逆转台氏液，含35 mmol/L HEPES、140 mmol/L KCl、8 mmol/L KHCO3、2 mmol/L MgCl2 和 0.4 mmol/L KH2PO4，pH 7.5）中，并逐渐更换为添加15%胎牛血清、1%链霉素和0.5%庆大霉素的M199培养基，于37 °C、5% CO2条件下培养。
- 在室温下用钙绿素AM（1–5 μM；Molecular Probes）或其他所需钙离子荧光探针孵育细胞30–45分钟。用铝箔覆盖培养皿，避免染料发生光漂白。
- 用含14 mM EGTA的Leibovitz15培养基（若进行低钙条件实验）或其他合适的观察用培养基洗涤细胞三次。
- 在含14 mM EGTA的Leibovitz15培养基中继续孵育30–45分钟。
- 若需测试抑制剂的作用（例如10 μM U73122 PLC抑制剂），可在第二次孵育期间加入。
2. 细胞显微注射
- 将心肌细胞培养于玻璃底MatTek培养皿（或其他观察用培养皿）中，培养24小时。
- 更换培养基为无酚红的Leibovitz-15培养基，并添加14 mM EGTA（心肌细胞必须在无钙培养基中注射；其他细胞可在含钙培养基中注射）。
- 配制显微注射溶液——我们的研究使用了一种可消除Gαq与小窝蛋白相互作用的多肽。需注意，注入细胞内的体积极小（约fL），因此应使用适当浓度的储备液。我们采用含DAPI的无钙培养基中2 μM的该多肽（Cav3-scaffold）。DAPI是一种蓝色荧光染料，可标记细胞核，用于识别已成功显微注射的细胞。DAPI不会干扰多种钙离子荧光探针的信号。DAPI的用量可调整，通常使用足以清晰观察细胞核的浓度（0.5 至 2 μM）。
- 配制仅含DAPI的对照溶液——即单独的染料示踪剂。
- 显微注射时使用自行拉制或商业购买的玻璃毛细针。可通过染料预注射练习，以确定合适的针头参数。需注意，不同类型的细胞可能需要不同的针头直径和注射压力。
- 使用自动化显微注射系统，例如Eppendorf的InjectMan NI2配合FemtoJet泵。设定注射压力Pi为90 hPa，补偿压力Pc为45 hPa，注射时间t设为0.7秒。根据实际需要调整注射参数。
- 在倒置显微镜（例如Zeiss Axiovert 200M）上进行显微注射，显微镜需配备长工作距离的相差物镜（例如空气40x相衬2物镜）。
- 尽可能快速地对多个细胞进行注射。使用相差显微镜观察注射后的细胞，筛选出状态良好的存活细胞。
3. 共免疫荧光研究
- 用 PBS 洗涤细胞两次，并用 3.7% 多聚甲醛固定 30 分钟。如有需要，可在固定前对细胞进行刺激。
- 用 PBS 洗涤固定后的细胞三次，然后在 PBS 中加入 0.2% NP40 孵育 5 分钟。
- 使用含 4% 山羊血清（或其他合适的血清）的 PBS 封闭 1 小时。
- 将细胞与一抗在含 1% 山羊血清的 PBS 中按适当稀释比例孵育 1 小时。
- 用 150 mM NaCl、25 mM Tris（pH 7.6）洗涤细胞三次，每次 10 分钟，随后加入荧光标记的二抗，例如 Alexa-Fluor-488 抗兔或 Alexa-Fluor-647 抗小鼠二抗，用含 1% 山羊血清的 PBS 按 1:1000 稀释（注意：当同时检测两种不同蛋白时，一抗必须来自不同物种，二抗需对应相应物种）。
- 在 37°C 孵育 1 小时，用 TBS 洗涤三次。
- 将细胞置于 TBS 缓冲液或其他合适的成像介质中观察。
4. 快速钙成像
- 使用激光扫描共聚焦显微镜（例如 Fluoview 1000 Olympus）。
- 使用高数值孔径物镜。
- 设置采集参数。对于钙绿染料，使用 488 nm 激发光和长通 515 nm 发射滤光片。
- 调整像素驻留时间——对于快速钙信号测量，将其设为 2 μs/像素。
- 设置图像缩放倍数，使像素大小达到 0.05 - 0.3 μm。
- 在特定区域选择一个目标细胞中的某条扫描线。
- 在时间控制器窗口中选择至少 1500 次扫描的时间序列采集（以获得所需的时间范围——每行 1.3 ms 可对应约 2 秒的记录时长）。
- 在刺激前记录背景信号。
- 用 5 μM 氯化卡巴胆碱刺激细胞，并立即开始数据采集。保持细胞在 1 mL Leibovitz15 培养基中，用 Leibovitz15 培养基配制 10 μM 氯化卡巴胆碱溶液，轻柔加入 1 mL 至培养皿中。
5. 数据分析
- 从记录的图像中提取每个像素的强度值。使用 Fluoview 1000 软件将强度数据保存为表格。
- 将强度数据导入 Sigmaplot 或类似的数据分析程序，并将数据分为约 9–40 个区间。将结果与对照实验和电子噪声进行比较。
6. 典型结果：
我们使用配备多谱线激光激发系统和40倍/1.2数值孔径（NA）复消色差水浸物镜的激光扫描共聚焦显微镜LSM510（Zeiss，Jena，德国）对细胞进行成像。在图1（红色）中，展示了经固定并用抗caveolin-3抗体染色的成年犬心室心肌细胞中caveolae的分布情况，caveolin-3是这些细胞中caveolae的主要结构蛋白9。caveolin-3使用Alexa-647标记，并用He:Ne激光的633 nm谱线激发，图像通过LP650 nm长通发射滤光片采集。caveolin-3的分布与使用Alexa-488标记的Gαq进行比较（绿色）。Alexa-488用488 nm氩离子激光谱线激发，图像通过BP505-530 nm带通发射滤光片采集。在这些共定位测量中，两种荧光染料采用多通道顺序扫描（Multi Track acquisition）方式进行激发，该方法可最大程度减少通道间的串扰。共定位的数据分析使用Zeiss LSM510-Meta配套的AIM软件完成。如图所示，这两种蛋白存在共定位现象。
为了确定caveolin-3与Gα之间的偶联机制q 影响钙信号，我们在共聚焦扫描激光显微镜系统（Fluoview，Olympus，东京，日本）上进行了钙成像研究，该系统配备倒置显微镜（IX70，Olympus）和40倍物镜（UPlanApo，Olympus，数值孔径1.3），尽管这些测量也可在上述Zeiss系统上完成。进行这些测量时，细胞被加载了Ca2+ 绿色。我们使用488 nm氩离子激光激发染料，并通过LP515长通发射滤光片采集图像。图像帧以500 ms的时间间隔采集。每个像素的强度值使用Olympus软件和ImageJ提取。线扫描模式用于快速Ca²⁺动态的定量分析。2+ 瞬时反应和Ca2+ 火花。本研究中使用的像素大小为0.1-0.3 μm. 线扫描速率约为每秒数百次 μs 每行。在图2中，我们展示了一条Ca的线扫描2+ 绿色标记的心肌细胞，其像素驻留时间为 2 μs，扫描线时间是 142 μs图像由1200行组成。
扫描的每一行对应 Ca2+ Green 荧光信号在 142 μs 时间范围内采集的 71 个点的强度波动，可用于快速读取钙离子反应。例如，在图 3 中，我们展示了单个心肌细胞一行区域的 Ca2+ 活性，通过 Ca2+ Green 荧光强度随时间（秒）的变化来测量，分别显示添加 5 μM 卡巴胆碱之前（上方）和之后（下方）的情况，该药物通过激活 Gαq-PLCβ 通路提高细胞内 Ca2+ 水平。当对多行扫描信号进行平均时，卡巴胆碱刺激可使 Ca2+ Green 荧光强度增加约 1.8 倍。但由于实验条件的差异（室温、激光功率、探测器响应、染料分布等），在单次扫描线中可能无法观察到该增幅。尽管强度值（y 轴数值）相近，但明显可见下方经卡巴胆碱刺激后的曲线具有更宽的峰值，表明钙离子水平维持更持久，而刺激前的波动峰则较窄。这种峰值展宽及相对强度上升会掩盖较小且较慢的振荡信号。我们的目标是更清晰地区分这些不同类型的钙波动表型。
图4展示了这类快速钙波动的另一个示例。上方的图表显示了受刺激心室心肌细胞的原始扫描线数据（红色），黑色曲线表示3条扫描线迹的平均值。为了确定这些钙波动在多大程度上由Gαq与caveolin-3的相互作用介导，我们微量注射了一种可破坏caveolin-3与Gαq相互作用的肽段（即Cav3肽段），该处理消除了较长的Ca2+电流，这些数据以蓝色显示（我们注意到，已将Cav3肽段信号强度减去500，以便更清晰地区分两条曲线）。
我们将 Excel 文件中的原始数据列导入 SigmaPlot（Jandel, Inc.）并进行了直方图分析。在此分析中，事件数量被分组到数量相等的区间（即“箱”或 bins）中，以生成直方图。每个箱的宽度代表相等的时间间隔。不同强度值被分配到相应的时间箱中，使得某一特定箱的高度表示该强度在对应时间窗口内出现的次数。由于此类分析仅依赖于以相同扫描速率采集数据，因此可同时分析多条轨迹。此外，该分析对染料浓度、激光功率等因素的差异不敏感，而电子噪声和背景噪声发生在极快的时间尺度上，通常仅在前 1–2 个箱中可见。
图4中原始数据对应的直方图显示在页面底部。对照组细胞的直方图分布在较多个区间内，表明其时间分布较宽，如红线所示（红线仅为视觉引导，未假设任何模型）。相比之下，通过肽段破坏Gαq-Cav3相互作用后细胞响应的直方图集中在较窄的区间分布内，提示肽段的存在消除了持续时间较长的信号流。注射一种不破坏Gαq-Cav3相互作用的对照肽段，所得直方图与未注射细胞相似8。
在图5中，我们比较了成年犬心室心肌细胞（左）与新生大鼠未受刺激、缺乏小凹的原代心肌细胞（右）中Ca2+Green的快速强度波动。此处，对3分钟内的荧光强度值进行了每35帧分组的直方图统计，以观察较慢的钙信号事件。注意，新生心肌细胞在平坦的基线基础上呈现快速波动，表明缺乏较慢的Ca2+活动，而成年细胞则显示出更具结构化的基线。这些差异在直方图中最为明显。
图1. 显示Gα在成年犬心室心肌细胞中分布的图像q 使用Alexa-488进行免疫标记，通过488 nm氩离子激光激发，并采用BP505-530 nm发射滤光片采集图像。右上角为同一图像中caveolin-3免疫标记（Alexa-647）的定位情况，通过He:Ne激光的633 nm谱线激发，采用LP650 nm长通发射滤光片采集。左下角为合并图像，共定位区域呈橙色，右侧为放大图像。
图 2. 负载Ca2+ Green的活体成年犬心室心肌细胞的钙成像。图像采用共聚焦扫描激光显微镜系统获取，物镜为40倍，激发光源为488 nm氩离子激光器，发射滤光片为LP515长通滤光片。图像由1200行构成，像素驻留时间为2 μs，像素大小为0.1 μm。
图 3. 上图：按所述方法用 Ca2+ Green 负载并成像的活体成年犬心室心肌细胞中一条线扫描的 TOP 强度波动；下图：同一细胞在添加 5 μM 卡巴胆碱刺激后的结果。
图4. 上图：从负载Ca2+ Green（红色）的活体成年犬心室心肌细胞记录的线迹示例，记录时长为180毫秒，其中三条轨迹的平均值以黑线表示；与之对比的是微注射了破坏Gαq-caveolin 3相互作用肽段的细胞（红色），其三条轨迹的平均值同样以黑线表示。需注意，为便于观察，下方数据集已减去400个强度计数。下图面板为文本所述分组数据对应的直方图，其中分组数量为任意值，分组计数（或简称计数）代表该特定分组内的总强度值。需说明的是，在对照组（左）和肽段处理组（右）直方图中绘制的红色和蓝色线条仅用于辅助数据识别与比较，未拟合任何模型。
图5. 显示成年犬心室心肌细胞（左侧）和缺乏小凹的新生大鼠未刺激心肌细胞（右侧）中Ca2+Green的强度波动及其相应的直方图。
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讨论
我们已开发出一种用于观察和分离活体心肌细胞中快速钙信号的方法。尽管这些测量的实验条件此前已被应用于其他细胞系统10以及心肌细胞11，但通过使用直方图和分箱分析，可获取大量Ca2+事件的数据。快速事件能够被轻易地与慢速事件区分开来，并可采用模型来解析其潜在机制。培养心肌细胞（如同许多原代细胞系一样）可能较为困难。尽管通常认为应在细胞获取后尽快进行测量，但我们发现，本研究中所用的成年犬心肌细胞在培养3天后才开始逐渐丧失其特有特性。较长的培养时间使细胞能够牢固地贴附于基质上，从而确保细胞能够耐受诸如显微注射等可能具有致死性的处理。牢固贴附对于显微注射的成功至关重要。
我们通过显微注射一种可破坏Gαq-caveolin 3相互作用的多肽，验证了其在钙离子流中的作用。需要特别强调的是，显微注射操作必须极为谨慎，以尽量减少对细胞的损伤以及细胞内容物的泄漏。然而，由于心肌细胞相对较大，需使用直径较大的针头才能注入足量的物质，因此必须在上述风险与针头尺寸之间取得平衡。加入如DAPI等染料以标记并追踪哪些细胞已成...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得美国国立卫生研究院基金项目 2R01 GM53132 和 P50 GM071558 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |
参考文献
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