测量心肌细胞中的快速钙离子流

摘要

我们介绍了一种利用激光扫描共聚焦显微镜从活细胞中分离快速（微秒级）钙信号与较慢钙流的方法。该方法通过记录细胞内数百像素的线扫描，检测钙离子指示剂的荧光强度波动。利用直方图分析，可分离出不同时间尺度的钙流信号。

摘要

心肌细胞具有多种钙²⁺ 不同时长的流共同作用以优化功能 ^1,2钙离子变化²⁺ 对细胞外因子的反应活性主要由磷脂酶Cβ- Gα调控_q 位于质膜上的通路，可被乙酰胆碱等物质激活 ^3,4我们最近发现，质膜蛋白结构域中的小窝（caveolae）^5,6 可捕获激活的Gα_q ⁷这种捕获作用能够稳定Gα的激活状态_q 并导致Ca持续延长²⁺ 心肌细胞及其他细胞类型中的信号⁸我们通过在活体心肌细胞中快速测量动态钙反应，揭示了这一令人意外的结果。简言之，细胞被加载一种荧光Ca²⁺ 指示剂。在我们的研究中，我们使用了Ca²⁺ 绿色荧光染料（Invitrogen, Inc.），其在结合钙离子后荧光发射强度增强。随后使用激光扫描共聚焦显微镜的线扫描模式记录荧光强度。该方法可快速获取沿选定线条上各像素荧光强度随时间变化的过程，从而在微秒时间尺度上生成数百条时间轨迹。这些极快速的时间轨迹被导入Excel，随后转入Sigmaplot进行分析，并与电子噪声、游离染料及其他对照组获得的轨迹进行比较。用于解析Ca²⁺ 不同流量速率的响应，我们进行了直方图分析，将像素强度按时间分箱。分箱使我们能够对超过500条扫描轨迹进行分组，并在单个图中空间和时间上可视化汇总结果。因此，缓慢的Ca²⁺ 由于峰位置不同和噪声干扰，当扫描图谱叠加时难以分辨的波动，在分箱直方图中可清晰显现。在测量时间尺度上非常快速的流速，在极短的时间分箱中表现为强度的窄分布，而较长的Ca²⁺ 波形显示了在较长时间区间内分布较广的分组数据。这些不同的时间分布使我们能够解析Ca²⁺细胞中的流变及其对各类细胞事件的影响

方案

1. 使用钙离子指示剂对细胞进行负载

1. 将细胞接种于35 mm玻璃底MatTek培养皿（或其他玻璃底观察室）中。
2. 若使用原代心肌细胞，需在接种前一天用10 μg/mL层粘连蛋白（laminin）包被培养室。将心肌细胞（来源于成年犬、新生大鼠或其他生物体）接种于KB缓冲液（K-逆转台氏液，含35 mmol/L HEPES、140 mmol/L KCl、8 mmol/L KHCO₃、2 mmol/L MgCl₂ 和 0.4 mmol/L KH₂PO₄，pH 7.5）中，并逐渐更换为添加15%胎牛血清、1%链霉素和0.5%庆大霉素的M199培养基，于37 °C、5% CO₂条件下培养。
3. 在室温下用钙绿素AM（1–5 μM；Molecular Probes）或其他所需钙离子荧光探针孵育细胞30–45分钟。用铝箔覆盖培养皿，避免染料发生光漂白。
4. 用含14 mM EGTA的Leibovitz15培养基（若进行低钙条件实验）或其他合适的观察用培养基洗涤细胞三次。
5. 在含14 mM EGTA的Leibovitz15培养基中继续孵育30–45分钟。
6. 若需测试抑制剂的作用（例如10 μM U73122 PLC抑制剂），可在第二次孵育期间加入。

2. 细胞显微注....

讨论

我们已开发出一种用于观察和分离活体心肌细胞中快速钙信号的方法。尽管这些测量的实验条件此前已被应用于其他细胞系统¹⁰以及心肌细胞¹¹，但通过使用直方图和分箱分析，可获取大量Ca²⁺事件的数据。快速事件能够被轻易地与慢速事件区分开来，并可采用模型来解析其潜在机制。培养心肌细胞（如同许多原代细胞系一样）可能较为困难。尽管通常认为应在细胞获取后尽快进行测量，但我们发现，本研究中所用的成年犬心肌细胞在培养3天后才开始逐渐丧失其特有特性。较长的培养时间使细胞能够牢固地贴附于基质上，从而确保细胞能够耐受诸如显微注射等可能具有致死性的处理。牢固贴附对于显微注射的成功至关重要。

我们通过显微注射一种可破坏Gα_q-caveolin 3相互作用的多肽，验证了其在钙离子流中的作用。需要特别强调的是，显微注射操作必须极为谨慎，以尽量减少对细胞的损伤以及细胞内容物的泄漏。然而，由于心肌细胞相对较大，需使用直径较大的针头才能注入足量的物质，因此必须在上述风险与针头尺寸之间取得平衡。加入如DAPI等染料以标记并追踪哪些细胞已成.......

材料

本文使用的材料清单

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DMEM	Invitrogen	ABCD1234