由旁分泌来源的活性氧触发的血管钙2+信号转导的可视化

摘要

本文介绍了一种高效的方法，用于深入研究旁分泌来源的活性氧（ROS）诱导内皮细胞Ca2+信号的可视化。该方法利用共培养模型，检测旁分泌来源的ROS所触发的血管内皮细胞内Ca2+动员。

摘要

氧化应激已被证实与多种病理状态相关，包括缺血/再灌注损伤和脓毒症。氧化应激的概念指的是活性氧（ROS）的异常生成，这些活性氧包括超氧阴离子（O₂^•-）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基。活性氧影响多种细胞过程，包括信号转导、细胞增殖和细胞死亡^1-6。ROS 可直接损伤血管和器官细胞，并可引发继发性化学反应和基因改变，最终导致初始 ROS 介导的组织损伤被放大。加剧不可逆组织损伤的放大级联反应中的一个关键环节是循环炎症细胞的募集与激活。在炎症过程中，炎症细胞产生如肿瘤坏死因子-α（TNFα）和 IL-1 等细胞因子，这些因子可激活内皮细胞（EC）和上皮细胞，进一步增强炎症反应⁷。血管内皮功能障碍是急性炎症的明确特征。巨噬细胞通过尚不明确的机制参与了炎症期间的内皮功能障碍。巨噬细胞激活后会向细胞外释放 O₂^•- 和多种促炎性细胞因子，从而在邻近细胞中触发病理性信号传导⁸。在大多数细胞类型中，NADPH 氧化酶是 ROS 的主要和初级来源。最近，我们及其他研究者^9,10发现，在多种病理生理条件下，NADPH 氧化酶产生的 ROS 可诱导线粒体产生 ROS。因此，在检测胞质 ROS 的同时，检测线粒体 ROS 的生成同样重要。巨噬细胞通过黄素蛋白酶 NADPH 氧化酶产生 ROS，该酶在炎症过程中起主要作用。一旦被激活，吞噬性 NADPH 氧化酶会产生大量 O₂^•-，这在宿主防御机制中具有重要意义^11,12。尽管旁分泌来源的 O₂^•- 在血管疾病发病机制中发挥重要作用，但旁分泌 ROS 诱导的细胞内信号传导（包括 Ca²⁺ 动员）的可视化仍处于假设阶段。我们建立了一个模型，利用激活的巨噬细胞作为 O₂^•- 的来源，将信号传递给邻近的内皮细胞。通过该模型，我们证明巨噬细胞来源的 O₂^•- 可导致邻近内皮细胞中的钙信号传导。

方案

可以使用氧化敏感性染料（1 和 2）或质粒传感器（3 和 4），通过共聚焦显微镜在活细胞中检测活性氧种类。

1. J774 细胞中胞质活性氧的可视化

1. 将 J774.1 小鼠单核细胞来源的巨噬细胞（10⁶ 个细胞/ml）接种于玻璃底 35 mm 培养皿（Harvard Apparatus）中，培养 48 小时。
2. 用 TLR 激动剂处理细胞（2 μg/ml，脂磷壁酸—TLR2 激动剂；10 μg/ml，聚肌胞苷酸—TLR3 激动剂；1 μg/ml，脂多糖—TLR4 激动剂），在 37°C 下孵育 6 小时。
   注意：在相似条件下处理的巨噬细胞用于共培养模型中的 Ca²⁺ 释放实验。
3. 向细胞中加入氧化敏感性染料 H₂DCF-DA（Invitrogen），使其在 ECM（细胞外培养基：121 mM NaCl、5 mM NaHCO₃、10 mM Na-HEPES、4.7 mM KCl、1.2 mM KH₂PO₄、1.2 mM MgSO₄、2 mM CaCl₂、10 mM 葡萄糖和 2.0% 葡聚糖，pH 7.4；所有试剂均购自 Sigma）中终浓度为 10 μM，并添加 2% BSA，染色后于共聚焦显微镜下观察前孵育 20 分钟。
4. 染料负载完成后，将细胞置于配备温控载物台的合适成像系统上进行观察。我们使用 Carl Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦成像系统，结合氩离子激光器，以 488 nm 激发波长，通过 40 倍油镜检测 DCF 荧光信号¹³（图 1A 和 D）。
5. 使用 ImageJ 软件（1.44 版）分析图像，该软件由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）免费提供（Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2009）。

2. J774 细胞中线粒体活性氧的可视化

1. 将 J774.1 小鼠单核细胞来源的巨噬细胞（10⁶ 个细胞/ml）接种于玻璃底 35 mm 培养皿（Harvard Apparatus）中，培养 48 小时。
2. 使用 TLR 配体刺激细胞以诱导线粒体活性氧（mROS）的产生（2 μg/ml，脂磷壁酸-TLR2；10 μg/ml，聚肌胞苷酸-Poly (I:C)-TLR3；1 μg/ml，脂多糖-LPS-TLR4），在 37°C 下孵育 6 小时。
3. 向培养皿中加入线粒体超氧化物指示剂 MitoSOX Red（Invitrogen），使其在含 2% BSA 的 ECM 中终浓度为 5 μM，于 37°C 孵育 30 分钟，使细胞充分负载 MitoSOX Red。
4. 染料负载后，将细胞置于 Carl Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦成像系统上，使用氩离子激光器在 561 nm 激发波长下，通过 40 倍油镜在温度控制载物台上观察 MitoSOX Red 荧光信号（见图 1B 和 E）。
5. 对照实验中，在染料负载后，成像前向细胞中加入 PBS 或 DMSO（阴性对照），或加入 2 μM 抗霉素 A（Antimycin A，作为线粒体超氧化物生成的阳性对照），其余操作同步骤 2.4（见图 1C）。
6. 使用 ImageJ 软件（1.44 版）分析图像。

3. 稳定表达 HyPer-cyto 的 MPMVEC 中胞质 ROS 的可视化

1. 我们使用pHyPer-cyto（Evrogen）质粒，这是一种哺乳动物表达载体，编码定位于细胞质并特异性感应亚微摩尔浓度H₂O₂的荧光探针HyPer¹⁴。
2. 使用电穿孔或转染试剂将pHyPer-cyto质粒转染至小鼠肺微血管内皮细胞（MPMVECs）中。我们采用10 × 10⁶个细胞，通过BioRad Gene Pulser电穿孔系统（250 V；500 μF）使用10 μg pHyPer-cyto进行电穿孔转染。将MPMVECs培养于添加10%胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸、内皮细胞生长补充物和抗生素的DMEM培养基中。
   注意：转染后，将细胞以低密度接种，以利于克隆形成。
3. 转染48小时后，更换为含500 μg/ml G418的完全培养基。筛选HyPer阳性细胞比例最高的克隆，并传代扩增HyPer阳性克隆以增加HyPer阳性细胞数量（图2）。
   注意：我们采用细胞连续稀释法进行单细胞克隆筛选，并筛选稳定高表达HyPer的细胞系。
4. 将稳定表达HyPer-cyto的MPMVECs培养于0.2%明胶包被的盖玻片上（80%汇合度）。次日，在37°C条件下用TLR配体刺激细胞6小时（2 μg/ml脂磷壁酸-TLR2；10 μg/ml聚肌胞苷酸-Poly (I:C)-TLR3；1 μg/ml脂多糖-LPS-TLR4）。未处理细胞作为对照。
5. 处理结束后，将盖玻片安装至Attofluor细胞培养腔室（Invitrogen）中。向腔室内加入1 ml预热的Hanks平衡盐溶液（HBSS），并将腔室置于Carl Zeiss LSM 510 Meta共聚焦成像系统的温控载物台上。使用40倍油镜在488 nm激发光下观察并采集荧光变化图像（图3A和D）。
6. 使用ImageJ软件（1.44版）分析图像（见第6节）。

4. 稳定表达 HyPer-dMito 的 MPMVEC 中线粒体 ROS 的可视化

1. 我们使用 pHyPer-dMito（Evrogen），这是一种哺乳动物表达载体，编码定位于线粒体的 HyPer 蛋白，可特异性感应亚微摩尔浓度的 H₂O₂。
2. 用 pHyPer-dMito 转染 MPMVEC，并按照第 3.2–3.3 节所述步骤建立稳定的 HyPer-dMito MPMVEC 细胞系。
3. 将稳定的 HyPer-dMito MPMVEC 细胞接种于经 0.2% 明胶包被的盖玻片上，培养至 80% 汇合度。
4. 次日，用 TLR 配体处理细胞（2 μg/ml，脂磷壁酸-TLR2；10 μg/ml，Poly (I:C)-TLR3；1 μg/ml，LPS-TLR4），在 37°C 下孵育 6 小时。未处理细胞作为阴性对照。在成像前加入 2 μM 抗霉素 A（线粒体超氧化物诱导剂，阳性对照）。
5. 处理结束后，将盖玻片安装至 Attofluor 细胞培养皿（Invitrogen）中，向皿内加入 1 ml 预热的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS），并将培养皿置于 Carl Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦成像系统的温控载物台上。使用 40 倍油镜，在 488 nm 激发光下观察并记录荧光变化（图 3B、C 和 E）。
6. 使用 ImageJ 软件（1.44 版）分析图像（见第 6 节）。

5. 用于可视化内皮细胞中旁分泌来源的活性氧触发的 Ca²⁺ 信号传导的共培养模型

为了观察和测量[Ca²⁺]i 的变化，我们使用对 Ca²⁺ 敏感的荧光染料 fluo-4 AM（Invitrogen）。

1. 将 MPMVECs 接种于经 0.2% 明胶包被的 25 mm 玻璃盖玻片上（80% 融合度）。
2. 将生长在盖玻片上的细胞在含 2% BSA 和 0.003% 普鲁尼克酸的 ECM 中，于室温孵育 30 分钟，加入终浓度为 5 μM 的 fluo-4 AM（Invitrogen），以完成 fluo-4 AM 的负载。负载后，用含磺吡酮的实验成像溶液（含 0.25% BSA 的 ECM）洗涤细胞，以减少染料流失。
3. 负载 fluo-4 后，将盖玻片安装至 Attofluor 细胞腔室（Invitrogen）中。向腔室内加入 800 μL 预热的实验成像溶液，并将其置于 Carl Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦成像系统的温控载物台上。
4. 在另一管中，用细胞追踪红 CMTPX（500 ng/mL）（Invitrogen）标记从野生型或 gp91^phox-/- 小鼠（经 LPS 处理 6 小时）分离的非激活或激活的巨噬细胞，标记在含 2% BSA 和 0.003% 普鲁尼克酸的 ECM 中进行。洗涤后，用 200 μL 实验成像溶液重悬细胞。
5. 将标记的巨噬细胞加入腔室组件中已负载 fluo-4 AM 的 MPMVECs 上。
6. 使用 Carl Zeiss LSM510 Meta 共聚焦成像系统，通过氩离子激光器分别在 488 nm 和 561 nm 激发 fluo-4 AM 和细胞追踪红荧光，每 3 秒记录一次绿色和红色荧光，持续 10–20 分钟（图 4 A-C）。
   注意：也可使用 J774.1 细胞系诱导 MPMVECs 的 Ca²⁺ 释放。
7. 使用 ImageJ 软件（1.44 版）分析 fluo-4 荧光强度的变化（见第 6 节）。

6. 使用 ImageJ 软件进行数据分析

将共聚焦显微镜系统获得的图像以 .lsm 格式文件形式转移用于数据分析。LSM 510 Meta 共聚焦显微镜或 LSM 710 多光子共聚焦显微镜配套的 ZEN 2009 和 ZEN 2010 软件分别将文件保存为 .lsm 格式。我们建议使用这种原始的 .lsm 文件进行图像分析，以保留图像的原始质量。该文件格式可直接在图像分析程序 Image J 中打开。以下步骤提供了一个单幅图像定量分析的示例。此数据分析无需额外插件。

1. 在 Image J 程序中使用“文件”>“打开”来打开 .lsm 或 .TIFF 文件
2. 点击“图像”>“颜色”>“拆分通道”选项卡，拆分绿色通道和 DIC 通道。后续分析使用绿色通道的图像。
3. 双击并选择“椭圆画笔选区”选项卡，将像素值设置为 20。
4. 对于 Hyper-cyto 图像，单击单个细胞以定义测量的圆形区域，然后按“M”键测量所选区域的强度。数值将保留在新的结果窗口中。
5. 接着按住“Shift”键并单击另一个细胞以选择另一区域，随后按“M”键。强度值将记录在结果窗口中。在 50 个不同的细胞上重复步骤 4–5。
6. 对于 Hyper d-mito 图像，在“椭圆画笔选区”中将像素值设置为 10。需手动勾画感兴趣区域（ROI），包括特定细胞的线粒体。
7. 使用自由手绘工具围绕线粒体区域进行勾画，然后按“M”键。在 50 个不同的细胞上重复步骤 6–7。
8. 从结果窗口复制平均值，并粘贴到 Excel 表格或任意软件中以绘制结果图。我们通常使用 SigmaPlot 或 GraphPad PRISM 将数据绘制成图。

7. 代表性结果

图1显示了在TLR配体刺激下胞质和线粒体活性氧的产生情况。代表性共聚焦图像显示，刺激6小时后，DCF（胞质）和MitoSOX Red（线粒体）荧光强度增加。荧光变化经归一化处理后以倍数变化表示。

图2展示了稳定的HyPer-cyto和HyPer-dMito内皮细胞的构建过程。通过电穿孔法将pHyPer-cyto或pHyPer-dMito质粒载体转染至小鼠内皮细胞中。利用G418对稳定表达质粒的细胞筛选两周。筛选后，将细胞稀释并接种于96孔板中。分离单个克隆，并通过成像验证其表达的均一性。

图3显示了内皮细胞胞质和线粒体中H₂O₂水平的测定结果。代表性共聚焦图像显示，刺激6小时后，HyPer-cyto（胞质）和HyPer-dMito（线粒体）的荧光增强。荧光强度变化经归一化处理后以倍数变化表示。

图4显示了巨噬细胞来源的活性氧诱导内皮细胞胞质Ca²⁺动员的评估结果。将脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞加入已预先负载细胞内Ca²⁺（[Ca²⁺]i）荧光指示剂Fluo-4的肺微血管内皮细胞（PMVEC）中。加入野生型LPS激活的巨噬细胞可引发PMVEC中[Ca²⁺]i升高，而该反应在功能性NADPH氧化酶基因敲除（gp91^phox-/-）的情况下减弱。

图 1. 巨噬细胞产生细胞内活性氧（ROS）及线粒体超氧化物的可视化。J774.1 细胞经 TLR2、TLR3 和 TLR4 配体刺激。（2 μg/ml，脂磷壁酸-TLR2；10 μg/ml，Poly (I:C)-TLR3；1 μg/ml LPS-TLR4）在 37°C 下处理 6 小时。处理后，细胞分别加载（A）细胞内 ROS 指示剂（H₂DCF-DA；绿色荧光）或（B）线粒体超氧化物指示剂（MitoSOX Red；红色荧光）。（C）抗霉素 A 作为线粒体 ROS 生成的阳性对照。使用共聚焦显微镜评估荧光强度变化。（D）和（E）平均荧光变化的定量分析。

图2. 内皮细胞胞质和线粒体活性氧指示剂稳定表达的示意图。

图3. 内皮细胞胞质和线粒体中 H₂O₂ 水平的可视化。 稳定表达 (A) HyPer-cyto 或 (B) HyPer-dMito 的 MPMVEC 细胞在 37°C 下分别用 TLR2、TLR3 和 TLR4 配体处理 6 小时（2 μg/ml，脂磷壁酸-TLR2；10 μg/ml，Poly (I:C)-TLR3；1 μg/ml LPS-TLR4）。(C) 使用抗霉素 A 作为线粒体 ROS 产生的阳性对照。处理后，采用共聚焦显微镜检测荧光强度变化。(D) 和 (E) 平均荧光变化的定量分析。

图 4. 巨噬细胞来源的活性氧导致内皮细胞 Ca²⁺ 动员受损。（A） 内皮细胞/巨噬细胞共培养模型研究的示意图。（B） 从野生型（WT）和 gp91phox 基因敲除小鼠（The Jackson Laboratory）中新鲜分离的巨噬细胞，用 1 μg/ml LPS 激活 6 小时。巨噬细胞用细胞追踪染料 Red（红色）标记后，加入 Fluo-4 负载的肺微血管内皮细胞（PMVECs，绿色）中，以评估旁分泌 O₂^•- 信号传导。（C） 来自野生型小鼠的 LPS 激活巨噬细胞相较于 gp91phox 基因敲除小鼠的巨噬细胞，在 PMVECs 中引发了显著且快速的 Ca²⁺ 动员。巨噬细胞激活的有效性此前已有验证。

讨论

本文所述方法可利用氧化敏感性染料或质粒传感器，快速、定量地测量活细胞中的活性氧（ROS）。Toll样受体（TLR）激动剂是一类通过细胞表面存在的TLR刺激细胞并激活下游信号通路的化合物¹⁵。在本实验方案中，我们使用了三种不同的TLR激动剂作为诱导ROS产生的模型系统，分别为：脂磷壁酸（Lipo-teichoic acid）—TLR2激动剂；聚肌胞苷酸（Poly (I:C)）—TLR3激动剂；脂多糖（LPS）—TLR4激动剂。利用对氧化剂敏感的染料检测ROS具有快速的优点，且可检测多种ROS种类。而基于质粒的传感器HyPer则可选择性地检测H₂O₂水平。H₂O₂是一种较为稳定的氧化剂，且在稳定表达细胞系中使用HyPer-cyto和HyPer-dMito可避免ROS敏感荧光染料常见的光自氧化问题。HyPer不会人为诱导ROS的产生，可用于检测在不同生理和病理条件下，细胞不同区室中H₂O₂浓度的快速变化。稳定表达HyPer传感器的细胞可用于克隆筛选，从而获得更可靠、更准确的H₂

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Attofluor 细胞培养皿	Invitrogen	A7816
抗霉素 A	Sigma-Aldrich	A8674
低糖 DMEM 培养基	Invitrogen	10567-014
内皮细胞生长因子补充剂（ECGS）	Upstate, Millipore	02-102
胎牛血清	Invitrogen	12662011
G418	Invitrogen	10131-027
明胶	Sigma-Aldrich	G1393
H2DCFDA	Invitrogen	D-399
LPS	Sigma-Aldrich	L4516
LTA	Sigma-Aldrich	L2515
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008
Opti-MEM I 低血清培养基	Invitrogen	51985091
青霉素-链霉素（10x）	Invitrogen	15140163
pHyPer-cyto	Evrogen	FP941
pHyPer-dMito	Evrogen	FP942
Poly(I:C)	Sigma-Aldrich	P0913
Prism 软件 5.0	GraphPad Software Inc.
SigmaPlot 11.0	Systat software, Inc.
胰蛋白酶-EDTA（10x）	Invitrogen	15400054
T-25 培养瓶	Corning	430639
T-75 培养瓶	BD Biosciences	353136
96 孔组织培养微孔板	BD Biosciences	353072
Zen 2009 软件	Carl Zeiss, Inc.