方法文章

血管钙的可视化 2 +信号旁分泌源性活性氧引发

DOI：

10.3791/3511

⸱

2011年12月21日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Temple University , 2Department of Anesthesiology and Pain Medicine, University of Washington

本文内容

摘要

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一种有效的方法获得可视化的旁分泌衍生活性氧诱导内皮细胞Ca2 +信号的见解的描述。这种方法测量旁分泌衍生活性氧引发共培养模型在血管内皮细胞内Ca2 +动员的优势。

摘要

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氧化应激有牵连的一些包括缺血/再灌注损伤和败血症的病理条件。氧化应激的概念是指异常形成的活性氧（活性氧），其中包括 Ø 2• - ，H 2 O 2，和羟基自由基。活性氧的影响多种细胞过程，包括信号转导，细胞增殖和细胞死亡 1-6 。活性氧有可能直接损伤血管和器官的细胞，并能启动中学的化学反应和遗传变异，最终导致初始ROS介导的组织损伤的放大。放大级联，加剧了不可逆的组织损伤的一个关键组成部分是招募和循环炎性细胞的激活。在炎症，炎性细胞产生细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNFα）和IL - 1，激活内皮细胞（EC）和上皮细胞，并进一步增强炎症反应 7 。血管内皮功能障碍是一种急性炎症的建立功能。巨噬细胞促进血管内皮功能障碍，在炎症的机制仍不清楚。 • -和各种促炎性细胞因子，从而触发在相邻细胞的病理信号 8激活巨噬细胞外释放的O 2的结果。 NADPH氧化酶是ROS的主要的主要来源，在大多数的细胞类型。最近，它是我们和其他9,10所示，由NADPH氧化酶产生的活性氧诱导线粒体ROS在许多病理生理条件的生产。因此，测量线粒体ROS产生同样重要的是，除了测量胞质ROS的。巨噬细胞产生ROS的黄素酶NADPH氧化酶在炎症反应中起着主要作用。一旦被激活，吞噬细胞NADPH氧化酶产生丰富的O 2• - 11,12在宿主防御机制的重要。虽然旁分泌衍生Ø 2• -扮演重要的作用，在血管疾病的发病机制，包括CA 2旁分泌ROS诱导的细胞内信号可视化 +动员仍然是假说。我们已经开发出了激活巨噬细胞作为氧源•使用模型-信号转导的一个相邻的内皮细胞。使用这个模型，我们表明，巨噬细胞源性Ø 2• -在邻近的内皮细胞钙信号。

方案

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活性氧可测氧化敏感染料（1＆2）使用或使用质粒传感器（3＆4），共聚焦显微镜的活细胞。

1。 J774细胞胞质ROS的可视化

  1. 生长在玻璃底部35 mm培养皿（哈佛大学仪器），48小时J774.1小鼠单核细胞衍生的巨噬细胞（10 6细胞/ ml）
  2. 挑战细胞TLR激动剂（2微克/毫升，磷壁酸锂TLR2激动剂;10μg/ml，保利（I:C）- TLR3激动剂; 1微克/ ml的LPS - TLR4的激动剂）为6小时37 ° C
    注:类似条件下处理的巨噬细胞共培养模型的Ca 2 +动员。
  3. 添加氧化敏感的染料H 2 DCF - DA（Invitrogen公司）给ECM终浓度为10μm（外介质:121毫米氯化钠，碳酸氢钠3，5毫米10毫米钠HEPES，氯化钾4.7毫米，1.2毫米的KH 2 PO 4，硫酸镁 1.2毫米，2毫米氯化钙2，10葡萄糖和2.0％右旋糖酐，pH值7.4;取得所有自Sigma）含2％BSA的菜肴和共聚焦显微镜下可视化的前20分钟的孵育细胞。
  4. 染料加载后，可视化放在一个适当的成像系统上的一个温度控制阶段的细胞。我们使用卡尔蔡司LSM 510 META激光共聚焦成像系统，氩离子激光源加上488 DCF的荧光纳米40....

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讨论

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这里介绍的方法，允许快速和定量测量活性氧，在活细胞使用的氧化敏感的染料或质粒传感器。的Toll样受体激动剂（Toll样受体）的化合物，通过TLRs的细胞表面上的刺激细胞和触发下游信号通路15。在我们的协议中，我们使用三种不同的TLR激动剂，即，锂，磷壁酸TLR2激动剂;聚（I:C）。TLR3激动剂; LPS - TLR4的激动剂据报道，作为一个模型系统诱导ROS证明活性氧测量。使用氧化剂敏感染料的活性氧的测量迅速，可用于测量各种活性氧物种。使用质粒基于传感器超选择性检测H 2 O 2的水平。 H 2 O 2是更稳定的氧化剂和超CYTO和Hyper - dMito在一个稳定的细胞设置的使用也增加了对照片自动氧化活性氧敏感的荧光染料的优势。超不引起artifactual ROS生成，可用于检测各种生理和病理条件下下不同的细胞车厢的H 2 O 2浓度的快速变化。细胞稳定表达的Hyper传感器用于人口的克隆选择的H 2 O 2水平，提供了更为可靠和准确的测量。重要的是，这种方法还介绍了检测和定量测量的Ca 2 +触.......

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披露

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没有利益冲突的声明。

致谢

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这项工作是支持批卫生研究院（R01 HL086699，HL086699 01A2S1，1S10RR027327 - 01）的MM。我们的文章部分是由卡尔蔡司显微成像公司的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂 公司 目录编号
Attofluor细胞室 Invitrogen公司 A7816
抗霉素A 西格玛爱秩序 A8674
DMEM低血糖液 Invitrogen公司 10567-014
内皮生长因子的补充（ECGS） 上州 02-102
胎牛血清 Invitrogen公司 12662011
G418 Invitrogen公司 10131-027
明胶西格玛爱秩序 G1393
H 2 DCFDA Invitrogen公司 D - 399
脂多糖西格玛爱秩序 L4516
陆路交通管理局西格玛爱秩序 L2515
MitoSOX红 Invitrogen公司 M36008
OPTI - MEM我降低血清培养基 Invitrogen公司 51985091
PEN /链球菌（10X） Invitrogen公司 15140163
pHyPer - CYTO Evrogen FP941
pHyPer - dMito Evrogen FP942
保利（I:C） 西格玛爱秩序 P0913
Prism软件5.0 GraphPad软件公司
SigmaPlot 11.0 SYSTAT软件公司
胰蛋白酶EDTA（10X） Invitrogen公司 15400054
T - 25培养瓶康宁 430639
T - 75培养瓶屋宇署猎鹰 353136
96孔TC微型孔板屋宇署猎鹰 353072
禅2009软件卡尔蔡司510元共聚焦显微镜

参考文献

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  1. Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
  2. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Re....

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