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方法文章

使用磁镊进行多重单分子力促蛋白水解测量

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DOI：

10.3791/3520

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2012年7月25日

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Stanford University

本文内容

摘要

本文中，我们描述了使用磁力镊子以高度可并行的方式在单分子水平上研究力对酶促蛋白水解作用的影响。

摘要

产生和感知机械力是细胞生理学中普遍存在的现象，与癌症转移1、动脉粥样硬化发生2以及伤口愈合3密切相关。在上述每种情况下，细胞既对其周围环境施加作用力，同时又通过酶促方式重塑细胞外基质（ECM）。因此，机械力对ECM的影响因其潜在的生物学和医学重要性而成为一个备受关注的研究领域4-7。

单分子技术（如光镊8、原子力显微镜9和磁镊10,11）使研究人员能够通过对单个蛋白质施加力来探究酶在分子水平上的功能。在这些技术中，磁镊（MT）因其成本低、通量高而尤为突出。MT 施加的力范围约为 ~1–100 pN，可实现毫秒级的时间分辨率，这些特性非常适合在单分子水平上研究酶的作用机制12。本文报道了一种高度可并行的磁镊检测方法，用于研究力对单个蛋白质分子降解过程的影响。我们以基质金属蛋白酶 1（MMP-1）降解三聚体胶原肽为例进行说明；然而，该检测方法可轻松适用于研究其他底物和蛋白酶。

方案

1. 流通池制备

  1. 使用超声处理清洗盖玻片（#1.5，22×22 mm 和 22×40 mm，VWR）。
    1. 将盖玻片放入一个可容纳盖玻片并能放入超声仪的小型玻璃容器中（见步骤2）。
    2. 向容器中加入异丙醇，并在浴式超声仪中超声处理20分钟。
    3. 倒掉异丙醇，并用大量 Barnsted MilliQ 装置或类似设备制备的去离子水冲洗盖玻片。将容器注满水后再次超声处理20分钟。
    4. 超声处理后，在无尘过滤空气流中干燥盖玻片。仅使用外观洁净（即无污迹）的盖玻片。
    5. 用火焰轻轻灼烧盖玻片数秒，以去除残留的灰尘和水分：将盖玻片通过本生灯产生的气体火焰，注意避免因过热导致盖玻片变形。此步骤可去除表面残留污染物。
  2. 使用双面胶带将两张盖玻片粘合在一起。裁剪胶带长度约3 cm，宽度约0.3 cm。将胶带粘在22×40 mm的盖玻片上，中间留出1.6 cm的通道。用移液器吸头轻轻按压盖玻片，确保胶带完全粘附。

2. 磁力镊子装置的设置与校准

  1. 使用永磁稀土磁铁搭建磁镊系统，具体方法如前所述10,12. 采用一个带有一个直径为1 mm小孔的铝制L形支架，并将其安装在垂直z向位移器（Thorlabs）上，以调节光镊的高度。在小孔两侧的支架上各固定一块永磁稀土磁体，以形成磁镊阱图1).
  2. DNA 制备：使用在 5' 和 3' 末端分别用生物素和地高辛标记的 λ 噬菌体 DNA（IDT DNA，San Diego，CA）对磁力镊子进行校准。
    1. 混合 50 μL 4 nM λ-DNA 与 2 μL 40 nM 生物素标记的寡核苷酸并加热 60 °C 10分钟。然后在室温下缓慢冷却1小时。
    2. 根据制造商说明书加入DNA连接酶，并在室温下连接3小时。
    3. 添加 2 μL 加入400 nM的地高辛标记寡核苷酸，室温孵育45分钟。
    4. 添加 1.5 μL 加入10 mM ATP，继续将地高辛标记的寡核苷酸连接至λ-DNA，反应3小时。
    5. 使用 100 kDa 离心滤膜（Microcon Ultracell YM-100）去除过量的寡核苷酸和 DNA 连接酶。通过 TE 缓冲液进行总计 1000 倍体积的缓冲液置换，足以去除过量的寡核苷酸。注意：切勿使用过高的离心速度 >500xG，因为它会导致DNA断裂。
    6. 通过0.7%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品，以确保DNA未发生变性或剪切。
    7. 测定DNA浓度。建议使用Nanodrop紫外-可见分光光度计（Thermo Scientific），因为可用的样品体积可能非常小。
  3. 按照第1节所述制备流动池。
  4. 为了将DNA连接到流动池，加入抗地高辛抗体（羊IgG； 1 μg mL-1；Roche Bioscience，Manheim，德国），使其在玻璃表面贴附15分钟。
  5. 通过加入 2 mg mL 的牛血清白蛋白（BSA）溶液，钝化流动池表面，防止 DNA 非特异性吸附。-1 含0.1% Tween-20 的1×PBS缓冲液中的BSA。室温孵育45分钟。
  6. 重复步骤 2.5。
  7. 加入50 pM的修饰λ-DNA，使其在盖玻片上结合15分钟。
  8. 用1×PBS洗去多余的DNA。
  9. 加入链霉亲和素包被的超顺磁性微珠（1 μm 珠粒 = 2 μg mL-1; 2.8 μm 珠粒 = 20 μg mL-1）并让它们与固定的DNA结合15分钟。
  10. 用1×PBS洗去多余的珠子。
  11. 磁力镊校准
    1. 将永久磁铁移至远离样品表面的位置（>15 mm
    2. 将制备好的流动池放置在显微镜下。
    3. 将永磁体移至流式池上方的指定位置。
    4. 通过聚焦远离两个玻璃表面的λ-DNA功能化微珠，选择焦平面。正确的焦平面应使目标微珠呈现明亮的中心。
    5. 以80 Hz或更高的频率拍摄500帧微珠运动的视频。
    6. 将磁铁逐渐靠近样品表面。当距离大于5 mm时，以1 mm为步长移动；当距离在1至5 mm之间时，以0.5 mm为步长移动；当距离小于1 mm时，以0.25 mm为步长移动。
    7. 在每个新的磁体位置重复步骤 2.11.5 和 2.11.6。
    8. 对每个数据集，使用二维高斯拟合追踪微珠的中心。
    9. 利用布朗涨落通过以下公式计算力：

    力平衡公式 F=kBT·L/⟨x²⟩ 示意图；统计力学，热涨落
    其中 kBT 是玻尔兹曼热能， L 是λ-DNA的长度，且 2> 是质心位置的方差。
    1. 通过功率谱洛伦兹拟合来验证力的计算准确性，以确定滚降频率。施加的力与滚降频率之间的关系由以下公式给出：

    流体动力学方程，公式 F = 12π²μaf₀L，与流动阻力分析相关。
    其中 ƒ0 是滚降频率， a 为珠粒半径，且 μ 流体黏度12.

3. 流通池上胶原肽的固定

为了具体说明本方法的应用，我们描述了实验室近期的一项工作，该工作表征了一种三聚体胶原模型肽的蛋白水解过程。我们预计，这种通用方法可广泛应用于其他蛋白质和多核苷酸的研究。

  1. 胶原模型肽由一个 N-末端6x His标签用于纯化，后接一个5x myc 标签，(GPP)10 为促进三螺旋结构的形成，胶原蛋白α1的第772-786位残基（GPQGIAGQRGVVGL）（构成MMP-1识别位点）、foldon序列（GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL）以及一个 C-末端KKCK，以促进与生物素马来酰亚胺的标记。Foldon来源于T4噬菌体纤维蛋白，当融合至胶原模型三聚体的任一端时，可稳定其结构 N- 或 C-末端13,14.
  2. 胶原蛋白肽和MMP-1蛋白的表达与纯化参照先前所述方法进行4,15.
  3. 加入抗-myc (15 μg mL-1) 加入流动池，在室温下孵育20分钟，使抗-myc 连接到流动池表面。
  4. 使用 5 mg mL 的溶液对流动池进行钝化处理，以防止蛋白质的非特异性结合-1 BSA，方法同步骤 2.5 所述。
  5. 加入150 pM胶原肽，使其通过抗体上的 myc 标记45分钟。
  6. 用 PBS 缓冲液洗去多余的胶原蛋白。
  7. 加入链霉亲和素包被的超顺磁性微珠（1 μm 珠粒 = 2 μg mL-1和 2.8 μm 珠子 = 20 μg mL-1）并使其与胶原分子结合45分钟。 1 μm 磁珠应使用 PBS 稀释至所需浓度。 3 μm 使用强磁铁将磁珠从溶液中分离，然后重悬于PBS中。此步骤需重复3次。我们注意到，该步骤对于获得 3 μm 微珠与固定于表面的胶原肽结合

4. 力量蛋白水解测定

  1. 当流动池组装完成并载有胶原肽和磁珠后，在磁阱中以较低的约 1 pN 的力对流动池进行成像。根据我们的经验，有时会有一部分磁珠以非特异性方式弱吸附在表面。施加适度的力可确保这些磁珠被释放。
  2. 向流动池中加入活化的酶。本实验中，MMP-1 通过添加 3.5 mM APMA（4-氨基苯基汞乙酸盐）进行预活化，并在 37 °C 下孵育 3 小时。活化效果通过 SDS-PAGE 验证。
  3. 一旦将流动池重新放入磁力镊子装置中，立即记录覆盖多个视野的视频，通常可获得数百个附着的磁珠。此时间点记为 t = 0。
  4. 在规律的时间间隔重复记录多个视野的过程（同时返回同一视野），直至所有磁珠脱落或不再观察到明显的蛋白水解现象。
  5. 动力学数据分析
    1. 在不同时间点统计各个视野中的磁珠数量并取平均值。通过将每个时间点的平均磁珠数除以 t = 0 时的磁珠数进行归一化处理。这样可确保我们能够比较不同实验之间的蛋白水解速率，因为每次实验的磁珠绝对数量可能不同。
    2. 将该比值对时间作图。本实验中，数据拟合为指数衰减加常数形式。

    用于数学建模与分析的指数衰减公式，f(t)=ae^(-bt)+c。
    其中 ƒ(t) 表示附着磁珠的比例（或未被蛋白水解的胶原分子比例），t 为时间，a 为通过胶原连接臂附着的磁珠比例，b 为衰减速率常数，c 为非特异性附着的磁珠比例。
    1. 在不同作用力和 MMP-1 浓度下重复相同实验，以阐明力对 MMP-1 介导的胶原蛋白水解的影响。

5. 代表性结果

上述方案描述了一种利用磁镊（图1）研究力对酶促蛋白水解作用影响的新方法。我们通过测量布朗运动波动的幅度以及在不同磁铁位置下滚降频率的计算，对1 μm和3 μm的微珠进行了磁镊校准（图2）。在力依赖性蛋白水解实验中，实验装置基本相同，唯一的区别是将DNA替换为胶原蛋白（图3、图4）。可通过将归一化后剩余微珠数量对时间作图，以确定蛋白水解速率（图5），该过程可在不同酶浓度和施加力条件下重复进行。

磁镊示意图，受力拉伸的λDNA，BSA包被表面，实验装置。
图1. 磁阱校准过程示意图（未按比例绘制）。两块永磁性稀土磁体产生磁场，作用于超顺磁性微珠。通过上下移动磁体可调节施加的力。使用常规明场显微镜对微珠成像，光线穿过位于两磁体之间的针孔。 插图：使用40倍空气物镜拍摄的图像。清晰且呈圆形的光点对应于附着在盖玻片表面的微珠。失焦的物体为未附着的微珠。

力-距离曲线，磁场对1.0 µm和2.8 µm颗粒的影响；数据分析结果。
图2. 校准力随磁体与样品表面距离变化的关系图 1 μm (左侧）和 2.8 μm (右侧）珠。数据拟合至经验函数 静力平衡方程；力 = a/(x² + bx + c)；物理学公式；数学分析，其中 x 是到磁体的距离。 a = 31.8, b= 5.61，且 c = 4.39 对于 1 μm 珠子和 a = 140, b = 3.10 且 c = 1.86 对于 3 μm 珠子。这些数值特定于我们所使用的仪器和实验几何构型，每台仪器都应单独校准。每个数据点的误差棒代表珠子间所施加力约10%的变异，该变异源于珠子尺寸的差异。所施加的力与珠子体积成正比，珠子体积相对于平均值的变异约为9%（根据制造商说明书）。

磁性纳米棒阵列、静态平衡、示意图、外加磁场下排列的偶极子
图3. 力蛋白水解实验装置示意图（未按比例绘制）。胶原蛋白模型三聚体通过myc/抗-myc偶联固定在盖玻片表面。包被链霉亲和素的超顺磁性微珠通过生物素-链霉亲和素连接与胶原蛋白三聚体结合。活化的MMP-1随时间推移切割胶原蛋白，导致微珠从表面脱落并移出焦平面。

随时间推移（t0至tf）粒子扩散过程示意图。
图4. 蛋白水解随时间变化的示意图。该示意图显示了蛋白水解过程中随时间推移的样本视野。随着时间的推移，MMP-1切割胶原蛋白，磁珠脱离并在磁场作用下移出焦平面。

胶原蛋白降解速率图；误差棒；时间（分钟）；胶原蛋白稳定性的动力学分析
图 5. 蛋白水解速率依赖于施加的力16。图中显示了在 1.0 pN（3 μM MMP-1；黑色）、6.2 pN（3 μM MMP-1；红色）和 13 pN（0.2 μM MMP-1；洋红色）条件下采集的数据。蛋白水解速率（拟合参数）分别为：0.22 ± 0.02 min-1（1 pN）、0.46 ± 0.09 min-1（6.2 pN）和 2.08 ± 0.18 min-1（13 pN）。在长时间点（> 15 分钟）未发生蛋白水解的微珠比例在不同实验中均保持相对恒定，约为 ~0.25。误差棒表示反映每个时间点观测次数的泊松统计结果。每个时间点的 n 个微珠的误差为 n1/2。附着微珠比例的误差通过误差传递计算得出。1.0 pN 和 6.2 pN 实验使用 1 μm 微珠，13 pN 实验使用 2.8 μm 微珠。

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讨论

本方案描述了一种经典单分子技术的创新应用。磁镊技术能够以较低成本实现中高通量的单分子检测。然而，与其他实验技术一样，该方法也存在一些挑战和潜在的陷阱。

磁镊技术的局限性

与光镊相比，磁镊装置的空间和时间分辨率较低。此外，此处所述的简单磁镊所产生的力为30皮牛或更小，明显低于原子力显微镜实验中常规可达到的力值。这一限制可能具有优势：磁镊非常适用于施加亚皮牛级别的力。

与光镊或原子力显微镜（AFM）不同，传统的磁镊（MT）无法对单个粒子进行操控，例如本文中的装置即是如此。光镊通常用于施加平行于盖玻片方向的力，而磁镊则最适合进行垂直方向的拉伸实验。电磁磁镊可克服这些局限性，但代价是系统复杂性增加。

镊子校准

布朗运动涨落法和功率谱分析法在力的标定中均存在一定的局限性。我们发现，布朗运动涨落法对相机模糊效应特别敏感。随着帧率的提高（曝光时间缩短），所计算出的力值会降低。在实际操作中...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作得到了科学界面伯勒斯威康职业奖（A.R.D.）、美国国立卫生研究院（NIH）院长新创新者奖计划 1-DP2-OD007078（A.R.D.）、小威廉·鲍斯斯坦福研究生奖学金（A.S.A.）以及斯坦福心血管研究所青年前博士生奖学金（J.C.）的支持。作者感谢詹姆斯·斯普迪奇（James Spudich）出借显微镜设备。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微盖玻片 #1.5 (22x22)VWR48366-067
显微盖玻片 #1.5 (22x40)VWR48393-048
λ DNAInvitrogen25250-010
T4 DNA 连接酶Invitrogen15224-041
Microcon Ultracel YM-100Millipore42413
抗地高辛Roche Diagnostics11-333-089-001
Tween 20SigmaP9416-100ML
抗-myc 抗体Invitrogen46-0603
牛血清白蛋白SigmaB4287-5G
Dynabeads M-280 链霉亲和素Invitrogen658.01D
Dynabeads MyOne T1 链霉亲和素Invitrogen658.01D
对氨基苯基汞乙酸盐Calbiochem164610
生物素-马来酰亚胺Sigma AldrichB1267
生物素标记寡核苷酸IDT DNA定制合成
地高辛标记寡核苷酸IDT DNA定制合成
胶原蛋白肽基因DNA 2.0定制合成
MMP-1 cDNA哈佛质粒数据库
z-位移器ThorlabsMTS50
位移器伺服控制器ThorlabsTDC001

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