方法文章

使用磁镊进行多重单分子力促蛋白水解测量

DOI：

10.3791/3520

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2012年7月25日

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1Department of Chemical Engineering, Stanford University

本文内容

摘要

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本文中，我们描述了使用磁力镊子以高度可并行的方式在单分子水平上研究力对酶促蛋白水解作用的影响。

摘要

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产生和感知机械力是细胞生理学中普遍存在的现象，与癌症转移1、动脉粥样硬化发生2以及伤口愈合3密切相关。在上述每种情况下，细胞既对其周围环境施加作用力，同时又通过酶促方式重塑细胞外基质（ECM）。因此，机械力对ECM的影响因其潜在的生物学和医学重要性而成为一个备受关注的研究领域4-7。

单分子技术（如光镊8、原子力显微镜9和磁镊10,11）使研究人员能够通过对单个蛋白质施加力来探究酶在分子水平上的功能。在这些技术中，磁镊（MT）因其成本低、通量高而尤为突出。MT 施加的力范围约为 ~1–100 pN，可实现毫秒级的时间分辨率，这些特性非常适合在单分子水平上研究酶的作用机制12。本文报道了一种高度可并行的磁镊检测方法，用于研究力对单个蛋白质分子降解过程的影响。我们以基质金属蛋白酶 1（MMP-1）降解三聚体胶原肽为例进行说明；然而，该检测方法可轻松适用于研究其他底物和蛋白酶。

方案

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1. 流动池制备

  1. 使用超声波清洗盖玻片（#1.5，22×22 mm 和 22×40 mm，VWR）。
    1. 将盖玻片放入一个可容纳盖玻片并能放入超声仪中的小型玻璃容器中（见步骤2）。
    2. 向容器中加入异丙醇，并在水浴超声仪中超声处理20分钟。
    3. 倒掉异丙醇，用Barnsted MilliQ装置或类似设备制备的大量去离子水冲洗盖玻片。将容器注满水后再次超声处理20分钟。
    4. 超声处理后，在过滤的无尘空气流中干燥盖玻片。仅使用外观清洁（即无污迹）的盖玻片。
    5. 用火焰轻轻灼烧盖玻片数秒，以去除残留的灰尘和水分：将盖玻片通过本生灯产生的气体火焰，注意避免因过热而导致盖玻片变形。此步骤可去除表面残留污染物。
  2. 使用双面透明胶带将两张盖玻片粘合在一起。裁剪胶带长度约3 cm，宽度约0.3 cm。将胶带粘贴在22×40 mm的盖玻片上，中间留出1.6 cm的通道。用移液器吸头轻轻按压盖玻片，确保胶带已牢固粘附。

2. 磁力镊子装置的设置与校准

  1. 磁力镊子采用永磁性稀土磁铁搭建，具体方法如前所述10,12. 采用一个带直径1 mm小孔的铝制L型支架，并将其安装在垂直z轴位移器（Thorlabs）上，以调节光镊的高度。在小孔两侧的支架上各固定一块永磁性稀土磁体，以形成磁阱

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讨论

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本方案描述了一种经典单分子技术的创新应用。磁镊技术能够以较低成本实现中高通量的单分子检测。然而，与其他实验技术一样，该方法也存在一些挑战和潜在的陷阱。

磁镊技术的局限性

与光镊相比，磁镊装置的空间和时间分辨率较低。此外，此处所述的简单磁镊所产生的力为30皮牛或更小，明显低于原子力显微镜实验中常规可达到的力值。这一限制可能具有优势：磁镊非常适用于施加亚皮牛级别的力。

与光镊或原子力显微镜（AFM）不同，传统的磁镊（MT）无法对单个粒子进行操控，例如本文中的装置即是如此。光镊通常用于施加平行于盖玻片方向的力，而磁镊则最适合进行垂直方向的拉伸实验。电磁磁镊可克服这些局限性，但代价是系统复杂性增加。

镊子校准

布朗运动涨落法和功率谱分析法在力的标定中均存在一定的局限性。我们发现，布朗运动涨落法对相机模糊效应特别敏感。随着帧率的提高（曝光时间缩短），所计算出的力值会降低。在实际操作中.......

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披露

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未声明任何利益冲突。

致谢

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本工作得到了科学界面伯勒斯威康职业奖（A.R.D.）、美国国立卫生研究院（NIH）院长新创新者奖计划 1-DP2-OD007078（A.R.D.）、小威廉·鲍斯斯坦福研究生奖学金（A.S.A.）以及斯坦福心血管研究所青年前博士生奖学金（J.C.）的支持。作者感谢詹姆斯·斯普迪奇（James Spudich）出借显微镜设备。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微盖玻片 #1.5 (22x22)VWR48366-067
显微盖玻片 #1.5 (22x40)VWR48393-048
λ DNAInvitrogen25250-010
T4 DNA 连接酶Invitrogen15224-041
Microcon Ultracel YM-100Millipore42413
抗地高辛Roche Diagnostics11-333-089-001
Tween 20SigmaP9416-100ML
抗-myc 抗体Invitrogen46-0603
牛血清白蛋白SigmaB4287-5G
Dynabeads M-280 链霉亲和素Invitrogen658.01D
Dynabeads MyOne T1 链霉亲和素Invitrogen658.01D
对氨基苯基汞乙酸盐Calbiochem164610
生物素-马来酰亚胺Sigma AldrichB1267
生物素标记寡核苷酸IDT DNA定制合成
地高辛标记寡核苷酸IDT DNA定制合成
胶原蛋白肽基因DNA 2.0定制合成
MMP-1 cDNA哈佛质粒数据库
z-位移器ThorlabsMTS50
位移器伺服控制器ThorlabsTDC001

参考文献

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  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (....

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