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方法文章

细胞内复性实验

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DOI：

10.3791/3540

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2012年1月24日

 , 
1Institute of Toxicology and Genetics, Karlsruhe Institute of Technology

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于测量热激后细胞内蛋白质重折叠的方法。该方法可用于研究分子伴侣及其辅助因子，或能够影响其活性的化合物等折叠酶类。通过检测萤火虫荧光素酶的活性作为报告信号，以衡量分子伴侣的重折叠活性。

摘要

本方案描述了一种在基于细胞的系统中测量分子伴侣酶活性以及具有抑制/激活活性化合物可能影响的方法。分子伴侣是参与调控蛋白质折叠的蛋白质1，在应对热休克2、营养缺乏以及化学物质/毒素暴露等应激损伤时，对促进细胞存活具有关键作用3。因此，分子伴侣被发现参与肿瘤发生、癌细胞的化疗耐药性4以及神经退行性病变5等过程。设计能够抑制或激活这些酶活性的小分子，因此成为癌症治疗7和神经退行性疾病9中最受关注的策略之一。此处描述的检测方法可用于测量特定分子伴侣的重折叠活性，并研究化合物对其活性的影响。在该方法中，将待研究的分子伴侣基因与编码萤火虫荧光素酶基因的表达载体共同转染细胞。已有文献报道，变性的萤火虫荧光素酶可被分子伴侣重新折叠10,11。作为转染归一化对照，同时转染编码海肾荧光素酶基因的载体。本方案中所有转染均使用X-treme Gene 11（Roche）在HEK-293细胞中进行。第一步，通过环己酰亚胺处理抑制蛋白质合成。随后，在45°C下进行30分钟热休克以诱导蛋白质去折叠。在37°C恢复期间，蛋白质重新折叠为具有活性的构象，以萤火虫荧光素酶的活性作为检测读数：产生的光信号越强，表明越多蛋白质恢复至原始构象。未进行热休克的细胞设为参照（重折叠荧光素酶为100%）。

方案

1. 接种细胞

  1. 开始前，将培养基、1× PBS 和胰蛋白酶在 37°C 水浴中预热。
  2. 从培养箱中取出细胞，吸除培养基。
  3. 轻柔地向细胞中加入 5 mL 1× PBS 进行洗涤。
  4. 吸除 1× PBS，加入含 0.025% EDTA 的胰蛋白酶 1 mL。
  5. 轻柔地旋转培养皿，使胰蛋白酶均匀分布。
  6. 将细胞置于 37°C 培养箱中孵育 5–10 分钟（根据细胞类型而定），期间可轻摇培养皿，观察细胞是否已脱落。
  7. 用 10–20 mL 培养基重悬细胞，并收集至 50 mL 离心管中。
  8. 使用 Beckman 细胞计数仪对细胞进行计数，细胞数量应足以确保接种后融合度达到约 60–70%。
  9. 接种细胞，并静置培养 6–8 小时使其贴壁。

2. 转染

  1. 转染前，将一份无血清培养基在37 °C水浴中预热。
  2. 将X-treme Gene 9恢复至室温。
  3. 用移液器将无血清培养基分别加入两个离心管中（1个管=1次转染）。
  4. 将X-treme Gene 9加入无血清培养基中，注意枪头不要接触离心管的管壁，室温孵育5分钟。在此期间准备两份DNA混合物：在一个管中混合海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶和空载体对照的质粒，在另一个管中混合海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶和分子伴侣的质粒。
  5. 将每份DNA混合物分别加入含有无血清培养基和X-treme Gene 9的离心管中，涡旋混匀后室温孵育20分钟。
  6. 将每种混合物逐滴加入对应的培养板中，于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。

3. 细胞传代

  1. 转染后24小时，按照1.4–1.6步骤消化细胞，并将细胞稀释至最终60–70%汇合度，接种于6孔板中。
  2. 准备一块培养板用于非休克对照组，另根据需分析的恢复时间点数量准备相应数量的培养板，如图2所示。

4. 热激

  1. 热激处理时，将含有血清的培养基在37°C水浴中预热。
  2. 通过在含血清的培养基中稀释环己酰亚胺，配制终浓度为 20 µg/ml 以及将 MOPS 调至 20 mM。
  3. 从培养箱中取出培养板，吸除培养基。
  4. 每孔加入 1 mL “热激缓冲液”，在 37˚C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟2 （此处理中也包括参考板）。这将停止 从头合成 蛋白质合成
  5. 同时打开水浴锅，并将温度设置为45˚C。
  6. 孵育后，用预先切成条状的封口膜（Parafilm）密封板的盖子。参考板（100% 复性萤火虫荧光素酶）保留在培养箱中。
  7. 将培养板在 45˚C 下孵育 30 分钟.
  8. 从水浴中取出培养皿，移除封口膜，将培养皿放回培养箱中继续恢复培养。
  9. 在每个时间点收集细胞，用1× PBS洗涤，4˚C下以2000×g离心1分钟。

5. 细胞裂解与荧光素酶检测

  1. 为了高效裂解细胞，将细胞沉淀在液氮中快速冷冻。
  2. 在玻璃试管中加入 200 µl 用双蒸水按 1:5 稀释的被动裂解缓冲液。
  3. 在 96 孔板中每孔加入 30 µl 细胞裂解物。每个样本需设三个复孔。
  4. 仅使用“未热激”的对照样品检测海肾荧光素酶活性，因为此步骤用于验证转染效率是否一致。
  5. 准备检测所需溶液。将荧光素用 Gly-Gly 缓冲液稀释至终浓度为 0.2 mM，配制荧光素溶液；将 DTT 和 ATP 用 Gly-Gly 缓冲液稀释至终浓度为 1 mM，配制反应缓冲液；将腔肠素用腔肠素缓冲液稀释至终浓度为 0.2 µM，配制腔肠素反应缓冲液。荧光素溶液和腔肠素反应缓冲液需避光保存。
  6. 将 96 孔板放入发光仪中，启动程序“Wallac 1420 Workstation”。
  7. 将 Pump1 插入含有腔肠素溶液的离心管中，并盖紧管盖，避免光线接触溶液。
  8. 从菜单中选择“Dispenser maintenance”选项，并勾选 Pump1。
  9. 选择“Fill”选项。
  10. 如需编辑板布局，请在菜单中选择“Explore protocol and results”选项，选中相应程序后双击打开，然后选择需要读取的孔位。
  11. 返回“Wallac Manager”界面并点击“Start”。海肾荧光素酶与其底物腔肠素反应后发出的光波长峰值为 482 nm。
  12. 读数完成后，进入“Dispenser maintenance”菜单，选择“Empty”并选择 Pump1，将残余溶液全部排回原管中。
  13. 将 Pump1 的管路移至盛有水的离心管中，并勾选“Flush”进行冲洗。
  14. 冲洗完成后，选择“Empty”将管路中的水排空。
  15. 将 Pump1 的管路放入反应缓冲液的离心管中，Pump2 的管路放入荧光素溶液的离心管中。
  16. 更改板布局设置。
  17. 在“Dispenser Maintenance”菜单中，分别为 Pump1 和 Pump2 选择“Fill”选项。
  18. 选择相应程序并开始读数。萤火虫荧光素酶与其底物荧光素反应后发出的光波长峰值为 560 nm。
  19. 读数结束后，对 Pump1 和 Pump2 重复执行“排空-冲洗-排空”的操作流程。
  20. 结果将显示在“Wallac 1420 Explorer”中。
  21. 每项实验均关联一个检测编号、用户名、开始日期和结束日期。
  22. 结果现在可导出为 Excel 文件。
  23. 在数据分析时，细胞分为三组：1. 未热激的对照样品（设定为 100% 折叠的萤火虫荧光素酶活性）；2. 不表达分子伴侣且经热激处理的细胞；3. 表达分子伴侣且经热激处理的细胞。

6. 代表性结果

蛋白质的重折叠与恢复时间直接相关，因此为了检测系统是否正常工作，必须在不同时间点收集细胞进行检测。重折叠时间与重折叠百分比之间的直接相关性表明实验操作正确，因而可作为限制性因素。然而，必须始终考虑到，热激后的重折叠是一个趋于饱和的过程，因此在开始任何实验之前，应先进行适当的时间过程分析。

荧光素酶检测示意图；转染、热激、恢复过程；实验流程。
图1.  实验概述。体内复性检测需要3至4天完成。第1天进行细胞接种和转染。次日将细胞传代至较小规格的培养容器中，第3天进行热激处理。此时可在收获细胞后立即进行荧光素酶检测，也可将细胞沉淀保存于-80°C，待后续时间再进行检测

转染过程示意图：对照组与分子伴侣组、恢复阶段、多孔板分析。
图 2.  细胞传代。在第2天将细胞接种至6孔板中。每个转染样品将被稀释后加入一个孔中，以便将所有转染样品置于同一块板上。每块板对应一个特定的恢复时间点，另设一块未经热激处理的对照板。

蛋白质复性过程；复性率（%）与恢复时间的关系；含分子伴侣数据的柱状图。
图 3.  典型的良好结果。A. 通过萤火虫荧光素酶活性直接测定的复性百分比。每个柱状图表示在不同恢复时间点，无（黑色柱）和有（红色柱）分子伴侣存在时的复性百分比。B. 无（黑线）和有（红线）分子伴侣时，时间与复性之间的相关性。决定系数（r²）值表明具有良好的相关性。

在图3A中显示了一个代表性结果，即在热激后15、30、45、60和120分钟收集细胞，分别在无分子伴侣（黑色柱状图）和有分子伴侣（红色柱状图）的条件下进行实验。复性荧光素酶的百分比随着恢复时间的延长以及分子伴侣的转染而增加。对照组（图3B，黑色线）和转染分子伴侣的细胞（图3B，红色线）中复性与时间之间的相关性如图所示。

蛋白质复性分析；A：柱状图；B：散点图；分子伴侣对复性回收的影响。
图4.  典型的失败结果。A. 通过荧光素酶活性直接测定的复性百分比。每个柱状图表示在不同回收时间点，无（黑色柱）和有（红色柱）分子伴侣存在时的复性百分比。B. 无分子伴侣和有分子伴侣（红线）条件下，时间与复性之间的相关性。决定系数（r²）值表明相关性差。

图4A 显示了一项未正确执行的实验的代表性结果。对照组（黑色柱状图）和转染分子伴侣的细胞（红色柱状图）均未显示出随时间推移蛋白质复性增加的现象。此外，转染分子伴侣并未导致复性水平升高。这一较差的相关性在图4B中得到证实，对照组（黑线）和转染分子伴侣的细胞（红线）的决定系数（r平方值）分别为0.6619和0.1882。

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讨论

本研究介绍了一种用于测量分子伴侣胞内重折叠活性的实验方案。整个检测可在3至4天内完成，具体流程如图1所示。

萤光素酶和海肾萤光素酶产生的光信号具有良好的稳健性和线性，为本实验方案的可重复性提供了坚实基础。

该实验的关键步骤是选择一种高效的转染试剂，以确保分子伴侣和萤火虫荧光素酶的过表达。报告基因也可通过其他方法递送，例如腺病毒转染12或电穿孔。另一种选择是使用转基因细胞系，其中分子伴侣的表达可通过化学诱导（例如四环素响应启动子）13，而萤火虫荧光素酶基因则稳定转染。这一系列可选方案使得该检测方法可应用于多种细胞系，包括原代细胞。

此外，如果某种细胞系对环己酰亚胺处理特别敏感，可使用可阻遏/可诱导系统来终止萤火虫荧光素酶的蛋白质翻译。

由于不同分子伴侣的重折叠活性可能存在差异，因此应始终对转染的分子伴侣用量进行滴定。一旦在特定细胞系...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Danilo Maddalo 获得了卡尔斯鲁厄理工学院青年研究者小组（Young Investigator Group, YIG）的研究奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论

Perkin Elmer 公司的 Luminometer “1420 Luminescence Counter” Vector Light′ 被使用

荧光计程序：

Renilla：泵 1，100 μ注射

反应缓冲液：Pump1，70 μ注射

荧光素：Pump2, 30μ注射

对于缓冲液，使用双蒸水配制以下贮存液：

  • - 1 M MgSO₄4 ：246.48 g MgSO₄4*7H2O 在 1 升中
  • - 0.5 M EGTA：190.18克EGTA定容至1升
  • - 1 M KH2PO4：136.09 g KH2PO4 在1升中
  • - 1 M K2HPO4：228.23 g K2HPO4*3H2O 在 1 升中
  • - 5M NaCl：292.2 g NaCl 溶于 1 升水中
  • - 0.5 M EDTA：186,12 g EDTA*2H₂O2O 在 1 升中

GLY-GLY缓冲液：

  • - 25 mM 甘氨酰甘氨酸
  • - 15 mM MgSO₄4
  • - 4 mM EGTA

每升使用 3.3 g 甘氨酰甘氨酸、15 ml 1 M MgSO4 溶液和 8 ml 0.5 M EGTA 溶液。溶于水，调节 pH 至 7.8，定容至 1 升。

海肾荧光素酶反应缓冲液–腔肠素缓冲液：

  • - 13.4 mM KH2PO4
  • - 86.6 mM KH2PO4
  • - 0.5 M NaCl
  • - 1 mM EDTA

1升溶液使用13.4毫升1M KH2PO4 溶液，86.6 ml 的 1M K2HPO4 溶液，100 ml 的 5 M NaCl 溶液和 2 ml 的 0.5 M EDTA 溶液。

DMEM （1× 丹尼尔·马尔科姆·伊格尔培养基）GIBCO41966029
优等胎牛血清PAAA15-151
X-treme Gene 9 DNA转染试剂罗氏06365809001
PBS 1× 磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）GIBCO14190-094
MOPS 3-(N-吗啉代)丙磺酸SIGMA-ALDRICHM1254
环己酰亚胺SIGMA-ALDRICHC7698
5× 被动裂解缓冲液普洛麦格E194A

甘氨酰甘氨酸 EGTA MgSO₄4 (MgSO₄)47H2O)

SIGMA-ALDRICH Roth RothG7278 3054.2 P027.1

KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) 氯化钠 EDTA

Roth Roth Roth Roth3904.1 6878.2 3957.1 8043.1
荧光素（萤火虫）BiosynthL8200
C–腔肠素BiosynthC7000
DTT 二硫苏糖醇Roth6908.2
ATP （三磷酸腺苷）罗氏10519987001

参考文献

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