小鼠生殖细胞移植与睾丸组织异种移植

摘要

本文描述了生殖细胞移植和睾丸组织异种移植的实验方案。生殖细胞移植可在受体睾丸中产生来源于供体的精子发生，是鉴定精原干细胞（SSCs）的一种功能性重建实验方法。睾丸组织异种移植可在受体小鼠体内重现多种供体物种的睾丸发育及精子发生过程。

摘要

生殖细胞移植技术由宾夕法尼亚大学的Ralph Brinster博士及其同事于1994年开发^1,2。这些开创性研究表明，将来自可育供体小鼠的生殖细胞显微注射到不育受体小鼠的曲细精管中，可在受体动物体内实现供体来源的精子发生和精子生成²。利用携带细菌β-半乳糖苷酶基因的雄性供体，可识别出供体来源的精子发生过程，并证实受体动物能将供体单倍型传递给后代¹。令人惊讶的是，移植到曲细精管管腔内的生殖细胞能够从管腔迁移至基底膜，而精原细胞通常位于该位置³。目前普遍认为，只有精原干细胞（SSCs）能够定植于干细胞微环境，并在受体睾丸中重新建立精子发生过程。因此，生殖细胞移植为研究睾丸中干细胞微环境以及鉴定潜在的精原干细胞提供了一种功能性方法。迄今为止，生殖细胞移植已被用于阐明干细胞生物学的基本机制，通过移植前对生殖细胞进行遗传操作来制备转基因动物^4,5，研究支持细胞（Sertoli细胞）与生殖细胞之间的相互作用^6,7、精原干细胞的归巢与定植过程^3,8，以及精原干细胞的自我更新与分化机制^9,10。

生殖细胞移植在大型物种中也是可行的¹¹。在这些物种中，该技术的主要应用包括生育力保存、优良遗传性状在动物群体中的传播，以及转基因动物的制备，因为利用该技术研究精子发生和精原干细胞（SSC）生物学相比啮齿类动物在操作上更为复杂且成本更高。将大型物种的生殖细胞移植到小鼠的曲细精管中，可实现供体细胞的定植和精原细胞的扩增，但无法完成完全分化，这可能是由于系统发育上相距较远的物种间，受体体细胞环境与供体生殖细胞之间存在不相容性¹²。另一种替代方法是将大型物种的生殖细胞与其周围的体细胞微环境一同移植。我们于2002年首次报道，将未成熟雄性个体的微小睾丸组织片段移植至免疫缺陷小鼠的背部皮肤下，这些组织能够存活并完成整个发育过程，产生成熟且具备受精能力的精子¹³。自此以后，睾丸组织异种移植已在多种物种中取得成功，并成为在小鼠体内研究大型动物睾丸发育和精子发生过程的一种重要替代手段¹⁴。

方案

A 部分. 小鼠生殖细胞移植

1. 受体小鼠的准备

1. 受体应对供体睾丸细胞具有免疫耐受性（即与供体基因型匹配或为免疫缺陷型）。
2. 受体应天然缺乏生精能力（例如 W/ W^v 小鼠），或已清除内源性生殖细胞。可通过照射或使用白消安等化疗药物清除内源性生殖细胞。本方案中，我们描述了使用白消安制备受体小鼠的方法。
3. 对4至6周龄的受体小鼠通过腹腔注射给予白消安处理。白消安的最佳剂量因小鼠品系而异。在常用的受体品系中，40–50 mg/kg的剂量足以清除内源性生殖细胞（例如裸鼠为44 mg/kg，B6/129 F1受体为50 mg/kg）。
4. 将白消安粉末溶于DMSO中，然后加入等体积无菌蒸馏水，配制成终浓度为4 mg/ml的溶液。使用前于35–40°C保温，以防止白消安析出。若观察到沉淀，则弃用该溶液。
5. 白消安处理后，需至少等待一个月方可使用受体小鼠。受体小鼠可在白消安处理后1至3个月内使用。

2. 显微注射移液管的制备

1. 选择外径为 1.0 mm、内径为 0.75 mm、长度为 3 英寸的硼硅酸盐玻璃移液管（毛细管）。
2. 使用 Sigmacote 对玻璃移液管进行硅化处理，用甲醇冲洗移液管并吹干。
3. 使用拉针仪拉制移液管。不同拉针仪的设置参数各不相同，因此需测试若干组参数。通常，可尝试使用与制备去核移液管相似的设置。
4. 使用前，在解剖显微镜下折断移液管尖端，使尖端直径约为 50 μm。

3. 移植供体细胞的制备

1. 供体小鼠品系的选择取决于所研究的实验问题。若以精子发生过程的定量分析为终点指标，建议使用带有易于识别的遗传标记的供体，例如 Lac-Z（如 Jackson Laboratory 提供的 B6.129S7-Gt(ROSA)26Sor/J）或 GFP（如 Jackson Laboratory 提供的 C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J）。
2. 准备 7 ml 浓度为 1 mg/ml 的胶原酶 DMEM 溶液、4 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液（含 0.25% 胰蛋白酶和 1 mM EDTA），以及 2 ml 浓度为 7 mg/ml 的脱氧核糖核酸酶（DNase）DMEM 溶液。上述试剂用量适用于消化 2 只供体小鼠的睾丸组织。
3. 无菌条件下采集睾丸，去除白膜。用精细镊子轻轻铺开曲细精管，以利于后续酶消化处理。
4. 将曲细精管转移至胶原酶溶液中，在 37 °C 下孵育 5–10 分钟，并频繁振荡。
5. 用 PBS（不含 Ca²⁺）洗涤曲细精管两次，每次以 200–300 g 离心 3 分钟，弃上清后重悬沉淀。
6. 将组织重悬于胰蛋白酶-EDTA 溶液中，持续振荡直至溶液变得黏稠且浑浊。在 37 °C 下密切观察消化过程，通常应在 1–2 分钟内完成。
7. 加入 DNase 并充分混匀，继续孵育 1–2 分钟。
8. 加入 3 ml 胎牛血清（FBS）以终止酶反应。
9. 使用孔径为 40–70 μm 的尼龙滤网过滤细胞悬液，去除细胞团块或组织碎片。
10. 以 600 g 离心 5 分钟收集细胞，并用少量 DMEM（<100 μl）重悬细胞。
11. 计数细胞并调整至所需终浓度（通常为 100 × 10⁶ 个/ml）。使用前将细胞悬液置于冰上保存。
12. 每只经白消安处理的小鼠睾丸仅需注入 10–15 μl 细胞悬液。考虑到可能存在的损耗和泄漏，建议每只睾丸准备 30–50 μl 细胞悬液。

4. 移植步骤（图1）

1. 按照批准的方案对受体动物进行麻醉。
2. 将动物置于仰卧位，并对外腹部区域进行外科准备。沿腹中线做约1 cm的切口以暴露腹壁。使用小镊子在白线位置轻轻提起腹壁，避免意外损伤腹腔内器官，随后在腹壁中线处做约0.5 cm的切口，以暴露腹膜腔。
3. 用一把虹膜镊固定腹壁，用另一把虹膜镊在腹膜腔内寻找附着于附睾和睾丸的脂肪垫。轻柔地牵拉脂肪垫，直至睾丸被完全翻出，且睾丸动脉和附睾清晰可见。每次仅操作一侧睾丸。
4. 在脂肪垫/睾丸下方放置由经高压灭菌的索引卡制成的薄层无菌铺巾，以提高视觉辨识度（可选）。该铺巾还可用于吸收液体。
5. 向细胞悬液中加入一滴台盼蓝染料，小心地将细胞悬液装入连接1 ml注射器的聚乙烯导管中。将拉制好的移液管插入导管，并通过轻压注射器活塞，将细胞悬液缓慢推入移液管中。
6. 识别输出小管（连接睾丸与附睾的管道），并轻柔地清除其周围的脂肪组织。操作时需格外小心，因这些管道及其周围膜组织呈半透明状。
7. 小心地将移液管插入输出小管束中的一根管道，并向睾丸方向轻柔推进数毫米。
8. 在保持注射移液管不动的同时，操作注射器，轻柔下压活塞，确保悬液流入睾丸网并开始填充曲细精管。
9. 细胞悬液的注射速度和流动通过拇指施加的压力进行调节。避免压力突然增加，并密切观察悬液在管道内的流动情况。
10. 当几乎所有表面管道均已填充，且睾丸尚未出现缺血迹象时，停止注射。
11. 将睾丸放回腹膜腔内。对对侧睾丸重复上述操作。使用6-0丝线缝合腹壁，并用金属伤口夹闭合皮肤。将小鼠置于加热垫上监测，直至完全恢复。

5. 受体睾丸的分析

1. 移植后需等待 2-4 个月再进行分析。
2. 根据动物护理与使用指南处死受体小鼠，并将睾丸和附睾收集至 PBS 中。若使用了 Lac-Z 转基因供体品系，附睾可作为阳性染色对照，因其具有内源性 β-半乳糖苷酶活性。
3. 为通过 Lac-Z 染色检测供体细胞，将睾丸在 4 °C 下用含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 固定 1-2 小时，在 lacZ 漂洗缓冲液中室温漂洗 3 次，每次 30 分钟。
4. 在 lacZ 染色液中 37 °C 过夜孵育。睾丸可整体染色，也可在分散曲细精管后进行染色。
5. 用 10% 中性缓冲福尔马林固定并保存。如需切片，使用中性红快红作为复染剂。

第二部分 B. 小鼠异位异种移植

（引自 Dobrinski 和 Rathi 2008¹⁵，以及 Rodriguez-Sosa 等. 2011¹⁶）。

1. 供体组织的采集

1. 从供体雄性动物通过阉割或活检获取睾丸组织。
2. 将睾丸组织置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，或将活检组织置于培养基中，保持无菌条件。
3. 将采集的组织置于冰上，并运送至实验室。

2. 供体组织的制备

1. 在组织培养罩内操作，以保持无菌环境。
2. 将每个睾丸用含抗生素的冰冻 PBS 清洗两到三次，然后转移至含有 PBS 的培养皿中。对于活检组织，用含抗生素的冰冻培养基清洗睾丸组织碎片两到三次，每次以 150g 离心 2 分钟，并重悬于新鲜的冰冻培养基中。
3. 对于完整的睾丸，沿表面做切口以去除鞘膜（tunica vaginalis），挤出睾丸组织。去除睾丸上所有附属结构（精索、附睾、结缔组织）。用冷 PBS 清洗睾丸一次，然后转移至含有 PBS 的培养皿中。
4. 使用解剖刀片和剪刀小心去除睾丸的白膜（tunica albuginea）。若睾丸非常小，可用小型镊子夹住白膜一端，另一端做一小切口，通过挤压将睾丸组织从白膜中挤出，从而去除白膜。
5. 根据睾丸大小，可直接用弯头镊和解剖刀片在冰冻培养基中将整个睾丸组织切成约 1–2 mm³ 的小块；或先从睾丸上取下较大组织块，再进一步切割为较小碎片。所有操作均应在无菌条件下，在小型培养皿（60 × 15 mm）中进行。
6. 将制备好的组织碎片转移至置于冰上的小培养皿中的冰冻培养基内，直至进行移植。

3. 受体小鼠去势手术

1. 按上述方法麻醉小鼠，并通过剪毛（裸鼠无需剪毛）、用70%乙醇和碘伏溶液擦拭，准备无菌手术区域。
2. 在腹侧正中做一道0.5–1 cm的皮肤切口，暴露腹壁。
3. 仔细暴露睾丸、睾丸动脉和附睾，操作方法见A部分4.2–4.3节所述。
4. 用钝性分离法将附睾尾部从提睾肌中分离。
5. 用丝线结扎睾丸动脉、输精管及其伴随血管，然后在睾丸与结扎线之间切断已结扎的结构。
6. 对另一侧睾丸重复上述操作。
7. 用一到两针外科缝线缝合腹壁。
8. 用一到两个米歇尔夹（Michel clips）闭合皮肤切口。

4. 异位移植

1. 将小鼠置于仰卧位，并按上述方法在其背部制备无菌手术区域。
2. 根据需要植入的移植物数量（通常为每只小鼠4-8个），在小鼠背部中线两侧分别做长约0.5 cm的皮肤切口。
3. 用镊子夹住皮肤切口边缘，使用剪刀分离结缔组织，以创建皮下腔隙。
4. 用虹膜镊将一块睾丸组织深入放置至皮下腔隙内，同时用另一把虹膜镊固定皮肤切口边缘。
5. 用一个Michel夹闭合皮肤切口，并将小鼠置于加热垫上，直至其开始从麻醉状态恢复。
6. 将小鼠转移至带有额外保温垫和覆盖物的笼中，持续监测直至小鼠完全恢复。

5. 用于分析和精子采集的睾丸异种移植组织的收集

1. 根据动物护理与使用指南实施宿主小鼠的安乐死，沿背部从尾部至颈部做正中皮肤切口并翻开皮肤。此操作可暴露移植物，移植物可能位于皮下组织或附着于皮肤上。
2. 使用一对镊子和一把剪刀小心取出移植物。
3. 记录回收移植物的数量、单个移植物的大小和重量。
4. 从小鼠腹腔内取出精囊，并记录其重量，作为移植物组织产生睾酮的指标。
5. 用于组织学分析
   1. 将异种移植物悬浮于含有Bouin's溶液（或其他固定液）的样品管中，固定液体积约为移植物体积的10倍，并正确标记管子。
   2. 在冰箱中孵育过夜，随后在70%乙醇中至少清洗3次，建议每次间隔24小时。
   3. 继续进行后续处理，并包埋于石蜡中。
6. 用于精子采集
   1. 通过在300×g离心1分钟将异种移植物沉淀，弃上清，再用含抗生素的培养基重悬。
   2. 将移植物切成小块，在含有3–5 mL培养基的组织培养皿中用镊子小心剪碎。
   3. 将剪碎的组织通过40 μm细胞滤网过滤。

C 部分. 代表性结果

1. 生殖细胞移植

如果移植的供体细胞悬液中含有携带遗传标记（如LacZ转基因）的精原干细胞，则移植后2-3个月，可通过X-gal染色在受体睾丸中观察到生精小管内明显的蓝色区段，从而可视化供体精原干细胞的定植情况³（图2A）。一个发育良好的克隆应表现为长条状深蓝色区段，完全充满且具有两层或更多层靠近中央的蓝色细胞，而在两端则呈现较弱的染色区域，可见单个、成对或小簇状的蓝色细胞网络³（图2B）。深蓝色生精小管区域的横切面应显示出结构良好、排列有序的精子发生过程，其中包含处于不同分化阶段的蓝色生殖细胞（图2C）。

2. 睾丸组织异种移植

移植后睾丸组织的存活率与供体的发育阶段呈负相关；使用新生雄性个体的组织可获得最佳效果，而成年个体的组织则极易发生退化和死亡^17-21。通常情况下，随着供体组织经历第一次精子发生过程中的减数分裂，异种移植的成功率会逐渐降低。不成熟供体组织发育至完全精子发生所需的时间具有物种特异性，且通常比体内睾丸发育时间略短。完成完整精子发生的生精小管数量因物种而异。在绵羊、山羊和猪中，该比例超过50%；而在牛和猫中则低于15%¹⁴（图3）。

图 1. 生殖细胞移植操作流程。 麻醉后将受体动物置于仰卧位，沿腹中线做长约 0.4 英寸的切口（A）。牵拉附着于附睾和睾丸的脂肪垫以暴露睾丸，并在脂肪垫/睾丸下方放置一层薄的无菌敷料以利于清晰识别（B）。调整睾丸与附睾的位置，使埋藏在脂肪垫内的输出小管清晰可见（C, D, E）。辨认输出小管，并轻柔地去除导管周围的脂肪组织。可在导管下方放置一张彩色纸片或塑料片以增强视觉对比（G）。根据导管大小折断或研磨移液枪头尖端，并将细胞悬液吸入移液枪头中（H）。将移液枪头小心插入输出小管束中的一根小管，轻柔地向睾丸方向推进数毫米（H 图中的箭头指示移液枪注射与插入的方向）。图中显示了成功将细胞注入曲细精管的睾丸（I）。Ts：睾丸；Ep：附睾。

图 2. 生殖细胞移植的代表性结果 A) 经 X-gal 染色的注射睾丸。曲细精管中的蓝色片段代表转基因供体精原干细胞（SSC）（LacZ 转基因）形成的定植克隆。B) 移植后 3 个月的 SSC 克隆高倍放大图像。中心深蓝色区域代表完整的精子发生过程，两端浅蓝色区域代表克隆正在向外延伸生长。C) 深蓝色曲细精管的组织切片（移植后 3 个月）显示精子发生结构排列良好。B 和 C 中的比例尺分别为 200 μm 和 30 μm。（图改编自 Annu Rev Cell Dev Biol. 2008;24:263-86 和 Biol Reprod. 1999 Jun;60(6):1429-36）。

图 3. 大型动物未成熟睾丸组织异位异种移植至免疫缺陷小鼠体内。 将未成熟供体睾丸组织碎片（约 1 mm³）移植至免疫缺陷小鼠背部皮肤下（A），组织可存活并对小鼠促性腺激素产生反应。结果，睾丸组织完成全部发育过程，包括形成具有受精能力的精子（B）。一旦获取睾丸异种移植物（C），即可用于分析，或获取精子（D）用于胞质内单精子注射（ICSI）（E）及胚胎生产（F）。标尺：(B, E 和 F) 50 μm 或 (D) 10 μm。（改编自 Rodriguez-Sosa 和 Dobrinksi 2009¹⁴）。

讨论

1. 生殖细胞移植

生殖细胞移植是明确证实细胞群体中存在精原干细胞（SSCs）的唯一功能性检测方法。只有精原干细胞能够归巢至基膜上的精原干细胞微环境，并定植其中，启动来源于供体的精子发生过程。生殖细胞移植使得以前所未有的方式研究和操控精原干细胞成为可能。该技术已被用于通过遗传修饰精原干细胞产生转基因动物⁴；阐明精原干细胞定植的模式、效率及动力学特征^3,8；研究调控精原干细胞自我更新与分化过程的信号通路^9,10；鉴定精原干细胞表面标志物以实现其识别^22,23；以及研究精原干细胞所处的微环境^6,7,24。此外，通过相互移植实验，可用于探究不育表型究竟是源于支持细胞缺陷还是生殖细胞自身缺陷^25,26。

为了使移植高效进行，受体动物的选择和处理至关重要。受体应与供体基因型匹配，或经过免疫抑制处理。受体还应缺乏内源性生精能力：这可能是由于基因突变所致，例如 W/ W^v 小...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶（IV型）	Sigma-Aldrich	C5138
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
台盼蓝染液	Invitrogen	15250-061
尼龙网细胞滤器	BD Biosciences	352340 (40µm) 352350 (70µm)
白消安	Sigma-Aldrich	B2635
薄壁玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	TW 100-3
BD Intramedic 聚乙烯导管（PE100）	BD Biosciences	CA-63018-725
Ethicon 6-0 丝线缝合线	Ethicon Inc.	706G
伤口夹	BD Biosciences	427631
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
亚铁氰化钾	Sigma-Aldrich	P9387
铁氰化钾	Sigma-Aldrich	P3667
氯化镁	Sigma-Aldrich	208337
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750
N,N-二甲基甲酰胺	Sigma-Aldrich	D4551
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896