小鼠生殖细胞移植与睾丸组织异种移植

摘要

本文描述了生殖细胞移植和睾丸组织异种移植的实验方案。生殖细胞移植可在受体睾丸中产生来源于供体的精子发生，是鉴定精原干细胞（SSCs）的一种功能性重建实验方法。睾丸组织异种移植可在受体小鼠体内重现多种供体物种的睾丸发育及精子发生过程。

摘要

生殖细胞移植技术由宾夕法尼亚大学的Ralph Brinster博士及其同事于1994年开发^1,2。这些开创性研究表明，将来自可育供体小鼠的生殖细胞显微注射到不育受体小鼠的曲细精管中，可在受体动物体内实现供体来源的精子发生和精子生成²。利用携带细菌β-半乳糖苷酶基因的雄性供体，可识别出供体来源的精子发生过程，并证实受体动物能将供体单倍型传递给后代¹。令人惊讶的是，移植到曲细精管管腔内的生殖细胞能够从管腔迁移至基底膜，而精原细胞通常位于该位置³。目前普遍认为，只有精原干细胞（SSCs）能够定植于干细胞微环境，并在受体睾丸中重新建立精子发生过程。因此，生殖细胞移植为研究睾丸中干细胞微环境以及鉴定潜在的精原干细胞提供了一种功能性方法。迄今为止，生殖细胞移植已被用于阐明干细胞生物学的基本机制，通过移植前对生殖细胞进行遗传操作来制备转基因动物^4,5，研究支持细胞（Sertoli细胞）与生殖细胞之间的相互作用^6,7、精原干细胞的归巢与定植过程^3,8，以及精原干细胞的自我更新与分化机制^9,10。

生殖细胞移植在大型物种中也是可行的¹¹。在这些物种中，该技术的主要应用包括生育力保存、优良遗传性状在动物群体中的传播，以及转基因动物的制备，因为利用该技术研究精子发生和精原干细胞（SSC）生物学相比啮齿类动物在操作上更为复杂且成本更高。将大型物种的生殖细胞移植到小鼠的曲细精管中，可实现供体细胞的定植和精原细胞的扩增，但无法完成完全分化，这可能是由于系统发育上相距较远的物种间，受体体细胞环境与供体生殖细胞之间存在不相容性¹²。另一种替代方法是将大型物种的生殖细胞与其周围的体细胞微环境一同移植。我们于2002年首次报道，将未成熟雄性个体的微小睾丸组织片段移植至免疫缺陷小鼠的背部皮肤下，这些组织能够存活并完成整个发育过程，产生成熟且具备受精能力的精子¹³。自此以后，睾丸组织异种移植已在多种物种中取得成功，并成为在小鼠体内研究大型动物睾丸发育和精子发生过程的一种重要替代手段¹⁴。

方案

A 部分. 小鼠生殖细胞移植

1. 受体小鼠的准备

1. 受体应对供体睾丸细胞具有免疫耐受性（即与供体基因型匹配或为免疫缺陷型）。
2. 受体应天然缺乏生精能力（例如 W/ W^v 小鼠），或已清除内源性生殖细胞。可通过照射或使用白消安等化疗药物清除内源性生殖细胞。本方案中，我们描述了使用白消安制备受体小鼠的方法。
3. 对4至6周龄的受体小鼠通过腹腔注射给予白消安处理。白消安的最佳剂量因小鼠品系而异。在常用的受体品系中，40–50 mg/kg的剂量足以清除内源性生殖细胞（例如裸鼠为44 mg/kg，B6/129 F1受体为50 mg/kg）。
4. 将白消安粉末溶于DMSO中，然后加入等体积无菌蒸馏水，配制成终浓度为4 mg/ml的溶液。使用前于35–40°C保温，以防止白消安析出。若观察到沉淀，则弃用该溶液。
5. 白消安处理后，需至少等待一个月方可使用受体小鼠。受体小鼠可在白消安处理后1至3个月内使用。

2. 显微注射移液管的制备

1. 选择外径为 1.0 mm、内径为 0.75 mm、长度为 3 英寸的硼硅酸盐玻璃移液管（毛细管）。
2. 使用 Sigmacote 对玻璃移液管进行硅化处理，用甲醇冲洗移液管并吹干。
3. 使用拉针仪拉制移液管。不同....

讨论

1. 生殖细胞移植

生殖细胞移植是明确证实细胞群体中存在精原干细胞（SSCs）的唯一功能性检测方法。只有精原干细胞能够归巢至基膜上的精原干细胞微环境，并定植其中，启动来源于供体的精子发生过程。生殖细胞移植使得以前所未有的方式研究和操控精原干细胞成为可能。该技术已被用于通过遗传修饰精原干细胞产生转基因动物⁴；阐明精原干细胞定植的模式、效率及动力学特征^3,8；研究调控精原干细胞自我更新与分化过程的信号通路^9,10；鉴定精原干细胞表面标志物以实现其识别^22,23；以及研究精原干细胞所处的微环境^6,7,24。此外，通过相互移植实验，可用于探究不育表型究竟是源于支持细胞缺陷还是生殖细胞自身缺陷^25,26。

为了使移植高效进行，受体动物的选择和处理至关重要。受体应与供体基因型匹配，或经过免疫抑制处理。受体还应缺乏内源性生精能力：这可能是由于基因突变所致，例如 W/ W^v 小.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶（IV型）	Sigma-Aldrich	C5138
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
台盼蓝染液	Invitrogen	15250-061
尼龙网细胞滤器	BD Biosciences	352340 (40µm) 352350 (70µm)
白消安	Sigma-Aldrich	B2635
薄壁玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	TW 100-3
BD Intramedic 聚乙烯导管（PE100）	BD Biosciences	CA-63018-725
Ethicon 6-0 丝线缝合线	Ethicon Inc.	706G
伤口夹	BD Biosciences	427631
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
亚铁氰化钾	Sigma-Aldrich	P9387
铁氰化钾	Sigma-Aldrich	P3667
氯化镁	Sigma-Aldrich	208337
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750
N,N-二甲基甲酰胺	Sigma-Aldrich	D4551
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896