利用钙离子敏感型指示剂染料的AM酯形式，可检测发育中神经元网络的自发活动。通过单光子或双光子成像技术，可观察到指示剂荧光的瞬时变化，从而反映细胞内钙离子浓度的改变，指示神经元的激活状态。该方案可适用于多种依赖发育阶段的神经元网络研究。 体外.
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摘要
摘要
发育中神经系统的活动具有一个典型特征，即自发的、同步化的网络活动。这种同步化活动已在完整的脊髓、脑干、视网膜、大脑皮层以及离体神经元培养体系中被观察到。在自发活动期间，神经元发生去极化，产生单个或成簇的动作电位，从而激活多种离子通道。去极化会激活树突和树突棘上的电压门控钙通道，介导钙离子内流。利用场电极可在局部神经元网络中记录到高度同步的电活动。该技术具有较高的时间采样率，但由于单个电极整合了多个神经元的信号，空间分辨率较低。通过在单个神经元上进行膜片钳电生理记录，可实现对神经元活动的单细胞分辨率测量。然而，该方法在同时记录网络中多个神经元活动方面存在局限，通常仅能同时记录一到两个神经元。利用钙离子依赖性荧光指示剂染料，使得在细胞网络范围内测量同步活动成为可能。该技术兼具高空间分辨率和足够的时间采样能力，可用于记录发育中神经网络的自发活动。
在产前和出生后早期发育过程中，新形成的皮层和海马网络的一个关键特征是出现自发的、同步的神经元活动（Katz & Shatz, 1996；Khaziphov & Luhmann, 2006）。这种相关的网络活动被认为对发育中的神经系统形成功能性神经环路至关重要（Spitzer, 2006）。在灵长类和啮齿类动物的大脑中，产前和产后均可在体内和体外观察到早期的电活动和钙网络波动（Adelsberger 等, 2005；Garaschuk 等, 2000；Lamblin 等, 1999）。这些早期活动模式已知可调控多种发育过程，包括神经元分化、突触形成以及可塑性（Rakic & Komuro, 1995；Spitzer 等, 2004），对于皮层环路的正常发育与成熟具有关键意义。
在本 JoVE 视频中，我们演示了用于成像发育中皮层网络自发活动的方法。钙离子敏感性指示剂（如 Fura 2-AM 酯）可扩散穿过细胞膜，细胞内酯酶活性将 AM 酯裂解，生成细胞膜不通透性的指示剂染料形式。该不通透性指示剂含有羧酸基团，可在细胞内检测并结合钙离子。当钙离子敏感性染料与钙结合时，其荧光会发生短暂改变。通过单光子或多光子成像技术，可检测染料发射光子的变化，从而反映细胞内钙离子浓度的改变。此外，这些依赖钙离子的指示剂还可与其他荧光标记物联合使用，以研究活跃网络中的细胞类型。
方案
1. 制备水平内嗅皮层-海马脑切片
根据Canto、Wouterlood和Witter（2008）发表的《神经可塑性》ID 3812439中提供的该区域三维概览解剖图谱，制作内嗅皮层-海马脑切片。
- 配制500ml切片液，用碳酰气（95%氧气，5%二氧化碳）充氧至少20分钟，然后将其中250ml冷冻至结冰。切片前几分钟，将制备好的切片冰与剩余250ml持续鼓泡的切片液混合并搅碎，用于解剖及切片室中的切片操作。
- 配制200ml r-ACSF（恢复期人工脑脊液）以及至少500ml e-ACSF（实验用人工脑脊液）溶液。在组织制备前，需持续用碳酰气（95%氧气，5%二氧化碳）对两种溶液充氧至少20分钟。
- 本方案适用于出生后第0天至最多3周龄的小鼠。根据当地伦理委员会的操作规程处死动物，并迅速将其脑组织在含有冰冻切片液的培养皿中取出（切片液配方见表1，含溶液与试剂）。
- 将脑组织转移至浸有切片液的滤纸上，用锋利的剃刀片分离两个半球。将其中一个半球重新放回冰冻切片液中。
- 去除另一半球的小脑部分。将脑组织翻转至中线面朝下，从顶部以略微向头端倾斜的角度切除脑上部。
- 将脑组织翻转至已切割的（背侧）表面，用棉签轻轻按压，将其倒置粘附于切片机的组织固定座上。
- 在步骤1制备的冰冻切片液中，以低频率和低速度切割300 μm厚的脑片。在本实验条件下，我们使用赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）的振动切片机（Microm, HM 650V），设置参数为0.05 mm/s和36 Hz。
- 每切出一片脑组织，应立即转移至含有充氧人工脑脊液（ACSF）（2.5 mM Mg2+，1.6 mM Ca2+；见表2）的切片储存槽（浸没式）中，于室温下保存。r-ACSF中较高的镁离子浓度可通过NMDA受体减少切片后神经元内钙离子的流入，根据我们的经验，这有助于获得更高质量的脑片用于后续实验。如有需要，可随后对第二个大脑半球进行切片。
- 让脑片在上述条件下恢复1小时。
| 切片溶液（单位：mM）– 10 | |
| 110 | 氯化胆碱 |
| 25 | NaHCO3 |
| 11.6 | 11.6 |
| 10 | D-葡萄糖 |
| 7 | MgCl2 |
| 3.1 | 丙酮酸钠 |
| 2.5 | KCl |
| 1.25 | NaH2PO4 |
| 0.5 | CaCl2 |
表1. 切片溶液配方。
| ACSF（单位：mM） | |
| 125 | NaCl |
| 26 | NaHCO3 |
| 10 | D-glucose |
| 3 | KCl |
| 2.5/1.5 | MgCl2（恢复/实验） |
| 1.6 | CaCl2 |
| 1.25 | NaH2PO4 |
表2. 恢复液（r-ACSF）和实验用液（e-ACSF）的配制配方。
2. 染色室的制备
为了使细胞负载钙依赖性指示剂或细胞特异性标记物，需要将脑片转移至染色用孵育 chamber 中。尽管有商用的孵育 chamber 可供选择，但使用常规实验室设备即可轻松组装，成本极低。此类孵育 chamber 的关键特性包括：脑片需维持在 30 至 35°C 的温度范围内，在持续供氧的培养基中孵育，并且整个 chamber 需避光。
- 使用加热的金属棒，在两个一次性聚苯乙烯培养皿（直径分别为35 mm和100 mm）的侧壁上各打一个小孔，孔径略大于硅胶管（直径约1.5 mm）的直径，以便硅胶管刚好能穿过。
- 将硅胶管从较小培养皿的孔中穿入，并在小培养皿内壁形成一个环状结构。
- 使用速干胶将硅胶管的开口端密封，并将管的其余部分粘附固定在培养皿的内壁上。
- 用针头在小培养皿内部的硅胶管壁上等距打若干微孔。
- 将较小的培养皿粘在较大的培养皿内部，使两者的开孔对齐；再将硅胶管的另一端穿过大培养皿侧壁的孔。
- 对于界面型培养皿，取一个带半透膜的细胞培养插入式小室，使用加热的手术刀片将其顶部约1 cm部分切除，留下一个浅皿用于孵育过程中承载脑片。
- 在大培养皿的盖子上打一个直径约0.5–1 cm的孔，以便通入碳氧混合气体（95% O2, 5% CO2）。
- 取一个5或10 mL的塑料注射器，使用加热的手术刀片斜向切割，去除注射器末端，保留带有尖嘴的几厘米管段。使用速干胶将该管段的切割面粘附在培养皿盖上，覆盖住直径0.5–1 cm的通气孔。
- 将硅胶管和管路连接头连接至注射器尖嘴；在进入培养皿底部的硅胶管上也安装另一个管路连接头。
- 将两根管路连接至碳氧混合气体（95% O2, 5% CO2）的气体调节阀。将染色孵育装置置于加热板上，孵育温度维持在30–35°C。确保整个孵育过程中装置可避光。该染色孵育装置现已组装完毕，可用于脑片孵育。
方法图1. 染色室的横截面图，显示切片孵育（上方）和钙敏感指示剂的应用（移液加入的绿色染料，下方）。
3. 切片染色
在操作荧光染料的任何过程中，为避免光漂白，应在低光照条件下操作，并在操作间隙将染料及染色组织置于黑暗环境中。
- 将染色室置于加热板（35°C）上，连接碳氧混合气体供应，并从切片持有器中加入约1.5 ml的r-ACSF。
- 将界面皿放入染色室内，并加入1 ml ACSF。
- 确保染色室中有充足的碳氧混合气体供应，使ACSF保持缓慢而稳定的鼓泡状态。
- 向一瓶50 μg Fura 2-AM中加入9 μl DMSO和1 μl Pluronic酸（20% DMSO储备液，Invitrogen），涡旋混合染料15分钟。
- 将脑片转移至界面皿中，并用移液器将染料直接滴加到r-ACSF中覆盖海马和内嗅皮层目标区域的位置（如方法图1所示，见上文），使染料终浓度达到50 mM。
- 盖上染色室盖子，根据动物年龄孵育20–40分钟（见表3）。
- 将脑片重新转移回切片持有器中。
| 年龄（出生后天数） | 孵育时间（分钟） |
| 20 | |
| p8-p9 | 25 |
| p10-p11 | 30 |
| p12-13 | 35 |
| >p13 | 40 |
表3. 不同年龄的孵育时间，由实验室经验确定。
4. 其他染料与陈旧组织
可能由于脑组织中髓鞘化程度增加，来自较年长啮齿类动物的脑片对Fura 2-AM酯的摄取能力显著降低。为了促进该染料的摄取，对于P13及更年长小鼠的脑组织，需使用Cremophor EL（Sigma）进行预孵育步骤11。Cremophor是一种非离子型表面活性剂，常作为辅料用于多种药物制剂中。若省略此步骤，我们发现皮层脑片中的细胞特异性标记效果极差且重复性不佳。
- 将旧切片转移至一个浅的预孵育皿中，皿内含有3 ml加热至35°C的r-ACSF溶液和8 μl 0.5%的克列莫佛尔（cremophor，Sigma），孵育3分钟。
- 将切片转移至界面皿中，并按照常规染色步骤操作（步骤4–7，见上文）。
在脑片制备过程中，钙染料可同时加载神经元和非神经元细胞。为了在神经网络中识别并区分这些细胞类型，可使用磺酰罗丹明101（SR101）对脑片中的星形胶质细胞进行标记。
使用 Sulforhodamine 101 对切片进行染色
按照之前的步骤1-3操作（第3节）。
从-20°C保存条件下取1 μl浓度为10 mM的磺基罗丹明（Sigma）储备液，溶于999 μl r-ACSF中，配制成10 μM的溶液。将紫色染料像之前一样滴加到脑片上（步骤5-7），使脑片在染料溶液中孵育15分钟。
使用 FITC 番茄凝集素染料标记小胶质细胞和内皮细胞
按照之前的步骤1-3操作。
取25 μl浓度为2 mg/ml的番茄凝集素（Lycopersicon esculentum lectin）FITC偶联物原液（L0401，Sigma），加入2.5 ml人工脑脊液（r-ACSF）中，使其终浓度为20 μg/ml。用移液器将染料加至脑片上（操作同步骤5-7），使脑片在该溶液中孵育45分钟。
需要注意的是，由于该染料与在光谱绿色范围发光的钙敏感指示剂（如 Fura 2-AM 或 Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1)）会发射波长重叠的光子，因此无法将二者联合使用。然而，其他钙指示剂染料（如 Calcium orange、Fura Red）可与适当的滤光片或 Texas-Red 标记的凝集素结合使用，从而与绿色光谱范围的钙指示剂染料联合应用。
5. 将切片固定到记录室
成像过程中，脑片需要在显微镜下保持稳定。通常使用金属网格压住组织，但这可能导致脑片表面受力不均，使得只有部分视野处于聚焦范围内。为避免这一问题，可使用聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）将脑片固定在记录 chamber 上。
- 配制PEI溶液（将1 ml聚乙烯亚胺溶液加入250 ml硼酸缓冲液中（表4））。确保PEI完全溶解（搅拌过夜）。
- 在记录槽中加入PEI溶液，使底部被液体覆盖，至少在放置脑片前一小时完成此步骤。
- 用蒸馏水清洗记录槽，然后用孵育槽中的r-ACSF冲洗。
- 将一片脑片转移至记录槽中。
- 用移液器吸除r-ACSF，并用毛刷将脑片置于记录槽中央位置。
- 用滤纸片吸除脑片周围的r-ACSF。为保证脑片稳定贴附，脑片周围应不再残留ACSF。
- 根据记录槽的大小，用移液器滴加约0.5–1 ml ACSF至脑片上，使液体刚好覆盖脑片表面即可。
- 将装有脑片的记录槽放入一个较大的、充满湿润碳合气（carbogen）的界面式孵育容器中，让脑片恢复至少一小时。
| PEI 溶液 | |
| 1ml | 聚乙烯亚胺溶液 |
| 溶于 250ml 硼酸缓冲液 | |
| 40mM | 硼酸 |
| 10mM | 十水合四硼酸钠 |
表4. PEI溶液配方。
6. 成像
可使用单光子或双光子显微镜对钙依赖性指示剂染料进行成像。双光子成像仅激活兴趣区域焦平面体积内的指示剂染料，从而减少组织中的光散射。此外，它还能使光更好地穿透至组织切片的深层。
进行功能性钙成像时，我们使用Coherent公司提供的钛蓝宝石激光器，耦合至配备20倍物镜（数值孔径0.95）的Olympus显微镜，并结合LaVision Biotec公司的Trimscope系统。该Trimscope系统能够同时利用64束光束进行帧扫描，并配备滨松C9100 EM-CCD相机，以实现高速的帧扫描速率。
- 将记录室置于显微镜下，并使用成像用e-ACSF（1.6 Ca2+/1.5 Mg2+ 比例（表2））建立稳定的灌流，加热至不低于30°C的更生理温度。
- 使用白光照明聚焦到感兴趣区域（ROI）。避免将脑片暴露于光照的时间超过必要时长。
- 根据您希望测量的组织和生物信号，选择合适的激发波长、成像视野、扫描频率、像素密度以及相应的软件设置。对于使用Fura 2-AM进行钙网络成像，我们通常选择820 nm的波长、250×250 μm的成像视野、1200 Hz的线扫描频率以及2×2 binning模式。这将获得约100 ms的帧时间，即约10 Hz的成像频率。
- 使用连续扫描模式和选定的激光波长检查您的感兴趣区域是否处于焦点。调节焦距和激光强度，以避免图像像素饱和和荧光漂白。
- 对您的感兴趣区域进行延时成像。我们通常采集两段各2000帧的延时视频。
- 为进行细胞检测与识别，以1 μm的步进间距采集Z轴堆栈图像，围绕成像焦点平面在±20 μm范围内进行成像。
7. 代表性结果：
使用双光子成像技术，在发育中的新皮层和内嗅皮层网络中，钙离子指示剂Fura 2-AM成功加载的结果如图1所示。部分染料仍以背景染色形式存在于组织中，但细胞胞体以及在某些情况下的近端树突清晰可见，并与周围的神经毡结构明显分离。如果加载不成功，则几乎观察不到细胞特异性的染色，而在脑片表面的死亡膜碎片上常可见到少量染料斑点的小簇状聚集。
在这些截图中，细胞网络在单个焦平面上清晰可见，可实现同时进行的细胞成像。使用金属琴架或脑片未能完全贴附于记录室时，可能导致成像的脑片表面不平整。
图1. Fura 2-AM 乙酯标记的发育中新皮层（A，左）和内嗅皮层（B，右）神经网络。 比例尺：100 μm。
为了区分神经元与星形胶质细胞，在网络中可共同使用磺酰罗丹明101（sulforhodamine 101）与Fura 2-AM乙酯，从而实现不同细胞类型的分离。
图2. 使用磺基罗丹明101标记星形胶质细胞。A Fura 2-AM酯与磺基罗丹明101的共标记。激发波长：820 nm。通过PMT收集图像，使用560/70 nm的二向色镜进行波长分离。B 来自神经元（上方）和星形胶质细胞（下方）的代表性荧光轨迹。标尺：60秒，ΔF 10（荧光任意单位）。
图3. 异硫氰酸荧光素标记的番茄凝集素（FITC-conjugated Lycopersicon esculentum lectin）染色。 小鼠发育中海马区（A）和浅层内嗅皮层（B）的小胶质细胞与内皮细胞标记。
钙离子指示剂染料用于同时读取发育中的大脑皮层和海马网络中多个细胞的活性。
图4. 海马和皮层网络中的动态钙瞬变。
视频 1：小鼠内嗅皮层在出生后第二周的 Fura 2-AM 乙酰甲酯负载。
点击此处查看视频 1
视频 2：出生后第一周小鼠海马组织中 Fura 2-AM 乙酸酯的负载。
点击此处查看视频 2
视频 3：出生后第一周小鼠皮层的 Fluo-4 负载。
点击此处观看视频 3。
对于Fura 2-AM乙酰甲酯而言，细胞激活过程中由去极化诱导的钙离子内流会导致染料荧光减弱。而对于Fluo-4等染料，则情况相反，细胞去极化表现为光子发射的增加。通常主要检测胞体内的钙瞬变，但在某些制备样本中，较大的近端树突内的活动也可观察到，如视频2所示。
网络活动的读出可通过商业软件或自主开发的软件脚本进行量化。在本实验室中，细胞鉴定及网络活动通过自主编写的Matlab（Mathworks）代码以半自动化的方式进行测量与分析。
图5. 来自发育中皮层网络的同步钙瞬变的代表性分析。 一个神经元的三维表示（A），用于从z轴层叠图像自动创建神经元掩模（B），以实现神经元的自动检测。钙瞬变的测量包括振幅、频率以及活跃细胞数量，这些参数可从单个神经元数据中读取（C）。不同轨迹之间的同步性可通过点阵图进行可视化（D）。
讨论
本文展示的方法提供了适用于小鼠和大鼠脑中发育期皮层及海马网络内可识别细胞的网络动态钙成像的合适方案。这些方法具有最佳的空间分辨率，可同时可视化局部细胞胞体网络，用于检测阈上活动。根据CCD相机的帧采集设置，可调整网络活动的时间分辨率，以优化发育神经系统中常见的长时间阈上事件的信噪比测量。这些方案不仅限于海马和皮层网络，还可标记整个发育中神经系统的细胞。该方法的局限性在于仅能记录阈上活动。
披露
LaVision Biotec GmBH（德国比勒费尔德）赞助了本文稿件的投稿费用。
致谢
本实验室的工作由荷兰科学组织（NWO）（917.10.372）资助，项目负责人为 RMM。JD 隶属于欧盟第七框架计划 BrainTrain 项目（www.brain-train.nl）。我们感谢 Pieter Laurens-Baljon 和 Sabine Schmitz（均来自阿姆斯特丹自由大学神经科学与认知研究所，CNCR）提供视频序列中使用的场电位多电极阵列波形图及神经元培养图像。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 溶液 | |||
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| 氯化胆碱 | Sigma | C7527 | |
| 克雷莫佛尔 | Fluka | 27963 | Cremophor EL® |
| DMSO（二甲基亚砜） | Sigma Aldrich | 472301 | |
| D-葡萄糖 | Sigma Aldrich | 16325 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F-1221 | 特殊包装 |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| NaHCO₃ | Sigma Aldrich | 31437 | |
| NaH2PO4 | 默克 | 106346 | |
| 泊洛沙姆® F-127 | Invitrogen | P-3000MP | DMSO 中的 20% 溶液 |
| 抗坏血酸钠 | Sigma | A7631 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma Aldrich | P2256 | |
| 番茄（Lycopersicon esculentum）凝集素 | Sigma | L0401 | |
| 磺酰罗丹明101酸氯化物 | Sigma | S3388 | |
| 聚乙烯亚胺溶液 | Fluka | P3143 | |
| 硼酸 | Sigma | B6768 | |
| 十水合四硼酸钠 | Sigma | B3545 | |
| PEI | |||
| 染色缸 | |||
| 注射器（5 或 10 ml） | Terumo | 带鲁尔锁 | |
| 6孔板用细胞培养小室，8.0 µm，透明PET膜 | BD Falcon™ | 353093 | |
| 培养皿（35 和 100 mm） | 一次性，聚苯乙烯 | ||
| 管路和连接件 | |||
| 超级胶水 | |||
| 支架与腔室 | |||
| 切片孵育槽 | 浸没的 | ||
| 染色缸 | 界面室 | ||
| 记录室 | 例如，MEA 探针 | ||
| 成像装置 | |||
| 钛宝石激光器（Chameleon） | 相干的 | ||
| 修剪范围 | LaVision | 64 束 | |
| 显微镜 | Leica | 高数值孔径镜头 |
参考文献
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
- Khazipov, R., Luhmann, H. J. Early patterns of electrical activity in the developing cerebral cortex of humans and rodents. Trends in Neurosciences. 29, 414-418 (2006).
- Spitzer, N. C. Electrical activity in early neuronal development. Nature. 444, 707-712 (2006).
- Adelsberger, H., Garaschuk, O., Konnerth, A. Cortical calcium waves in resting newborn mice. Nat. Neurosci. 8, 988-990 (2005).
- Garaschuk, O., Linn, J., Eilers, J., Konnerth, A. Large-scale oscillatory calcium waves in the immature cortex. Nat. Neurosci. 3, 452-459 (2000).
- Lamblin, Electroencephalography of the premature and term newborn. Maturational aspects and glossary. Neurophysiol. Clin. 29, 123-219 (1999).
- Rakic, P., Komuro, H. The role of receptor/channel activity in neuronal cell migration. J. Neurobiol. 26, 299-315 (1995).
- Spitzer, N. C., Root, C. M., Borodinsky, L. N. Orchestrating neuronal differentiation: patterns of Ca2+ spikes specify transmitter choice. Trends. Neurosci. 27, 415-421 (2004).
- Canto, C. B., Wouterlood, F. G., Witter, M. P. What does the anatomical organization of the entorhinal cortex tell us. Neural. Plast. , 381243-381243 (2008).
- Bureau, I., Shepherd, G. M., Svoboda, K. Precise development of functional and anatomical columns in the neocortex. Neuron. 42, 789-801 (2004).
- Ikegaya, Y., Le Bon-Jego, M., Yuste, R. Large-scale imaging of cortical network activity with calcium indicators. Neuroscience research. 52, 132-138 (2005).
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