在过表达或敲低特定基因后评估Ramos B细胞中的体细胞高频突变

摘要

我们介绍了如何在人Ramos B细胞系中进行含有过表达或shRNA构建体的逆转录病毒或慢病毒感染，以及如何检测这些细胞中的体细胞高频突变。

摘要

B细胞通过V(D)J重排产生低亲和力抗体而开始其生命周期。然而，当检测到病原体时，免疫球蛋白（Ig）基因的可变区（V区）发生体细胞高频突变（SHM），其突变率比基因组其他区域高出约100,000倍，从而产生高亲和力抗体^1,2。此外，类别转换重组（CSR）可根据针对特定病原体所需的免疫反应类型，产生具有不同效应功能的抗体。CSR和SHM均由活化诱导的胞苷脱氨酶（AID）启动，AID将DNA中的胞嘧啶残基脱氨生成尿嘧啶。这些尿嘧啶通过易错的DNA修复通路进行加工，最终导致突变和重组事件的发生^1-3。

目前，关于体细胞超突变（SHM）和类别转换重组（CSR）分子机制的研究成果主要来源于小鼠、原代细胞、细胞系以及无细胞实验的综合研究。小鼠模型仍然是金标准，基因敲除实验已证明多种修复因子在其中发挥关键作用（例如 Ung、Msh2、Msh6、Exo1 和 DNA 聚合酶 η）^4-10。然而，并非所有基因都适用于敲除研究。例如，若干双链断裂修复蛋白的敲除会导致胚胎致死或损害B细胞的发育^11-14。此外，有时目标蛋白在SHM或CSR中的特定功能可能被基因敲除引起的更广泛的缺陷所掩盖。同时，由于小鼠实验周期较长，通过细胞系调控单个基因的表达已成为识别和表征候选基因日益常用的初步手段^15-18。

Ramos——一种持续发生体细胞超突变（SHM）的伯基特淋巴瘤细胞系——是研究SHM的常用细胞模型^18-24。Ramos细胞的一个优势在于其自身具备一种方便的半定量检测SHM的方法。野生型细胞表达IgM，随着突变的积累，部分突变会导致IgM表达丧失。因此，通过荧光激活细胞分选（FACS）检测IgM的丢失情况，可快速反映SHM水平。通过直接测序抗体基因，可以获得更为定量的SHM测量结果。

由于Ramos细胞难以转染，我们通过使用含有过表达元件或短发夹RNA（shRNA）的逆转录病毒或慢病毒载体感染细胞，从而构建出特定基因表达升高或降低的稳定细胞系。本文中，我们描述了如何感染Ramos细胞，并利用这些细胞研究特定基因在体细胞高频突变（SHM）中的作用（图1）。

方案

1. 样品和细胞的准备

1. 对过表达或含shRNA的载体以及逆转录病毒包装载体pKat2，或慢病毒包装载体pVSV-G、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev²⁵进行中等规模的DNA制备（中提）。每种构建体质粒使用6 μg DNA，若用于逆转录病毒感染，则使用4 μg pKat2；若用于慢病毒感染，则pVSV-g、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev三种包装质粒各使用1.5 μg DNA。
2. 准备BOSC 23细胞培养基。转染时需使用未添加任何成分的DMEM（Dulbecco′s改良Eagle′s培养基）以及完全DMEM。配制完全DMEM时，向一瓶DMEM中加入1% HEPES缓冲液、1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PGS）和10%新生牛血清（NCS）。
3. 准备Ramos细胞培养基。感染步骤中，通过向RPMI-1640培养基（RPMI）中添加1% HEPES、1% PGS和10%胎牛血清（FBS）配制完全RPMI培养基。在单细胞铺板步骤中，需制备“条件培养基”：将Ramos细胞在完全RPMI中培养2天，随后以400 × g离心4分钟，将上清液经0.2 μm滤器过滤至无菌瓶中。与其它完全培养基相同，条件培养基在4°C保存，待用时取出。
4. 转染前一天，将3 × 10⁶个BOSC 23细胞接种于含10 mL完全DMEM的100 mm培养皿中，使转染当天细胞融合度达到50–60%。每种拟转染的载体需单独准备一个培养皿。需注....

讨论

如前所述，用于抗体多样性的细胞系模型已成为识别影响抗体多样化各个步骤的新蛋白的常用起点。本文介绍了一种方法，即通过病毒感染在 Ramos B 细胞系中敲低或过表达特定蛋白，进而检测其对体细胞高频突变（SHM）的影响。

在这些研究中，我们同时使用野生型Ramos细胞和AID^hi Ramos细胞。野生型细胞可用于研究参与AID靶向或表达的因子以及修复AID诱导的DNA损伤的相关机制，而AID^hi细胞则排除了影响AID表达的因素。

还应注意，此处通过检测初始为IgM⁺的细胞群体中IgM的丢失来测量SHM。或者，也可以从IgM^-细胞开始，在回复突变检测中寻找获得IgM⁺的细胞²³。

通过使用不同的筛选标记（例如嘌呤霉素、潮霉素、GFP或Thy1.1），我们还可以采用相同的实验方案同时进行多重感染。然而，我们发现当使用两种不同的抗生素筛选标记时，细胞的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
推荐试剂——其中大多数可替换为其他供应商的类似产品。
6孔透明TC处理培养板	Corning	3516
10 mL BD Luer-Lok注射器	BD Biosciences	309604
24孔透明TC处理培养板	Corning	3526
96孔透明平底聚苯乙烯TC处理微孔板	Corning	3596
100 mm TC处理培养皿	Corning	430167
Acrodisc注射器滤器，0.45 μm	Pall Corporation	4604
琼脂	TEKnova, Inc.	A7777
琼脂糖	GeneMate	E-3120-500
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A0166	100 mg/mL 水溶液
BD FACSCanto II 流式细胞仪	BD Biosciences		或类似仪器
BD Falcon 圆底聚苯乙烯管	BD Biosciences	352054	用于FACS
BOSC 23 细胞	ATCC	CRL-11270
CO2 培养箱，可维持37°C
DMEM（Dulbecco′s 改良 Eagle′s 培养基）	Sigma-Aldrich	D6429
FBS（胎牛血清）	Gemini Bio Products	100-106
FITC α-大鼠 CD90/小鼠 CD90.1 抗体	BioLegend	202503	FITC α-Thy1.1
FuGENE 6 转染试剂	Roche Group	11814443001
HEPES 缓冲液	Invitrogen	15630-080
KAPA HiFi DNA 聚合酶	KAPA Biosystems	KK2101
LB 肉汤（溶菌肉汤 - Luria）粉末	Difco Laboratories	240230
MISSION TRC shRNA 细菌甘油菌种	Sigma-Aldrich		shRNA 载体
NCS（新生牛血清）	Gemini Bio Products	100-504
PBS（磷酸盐缓冲液）	Invitrogen	70011	用水稀释至1x
PE α-人 IgM 抗体	BioLegend	314508
PGS（青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液）	Gemini Bio Products	400-110
聚凝胺（六亚甲基溴化铵）	Sigma-Aldrich	107689	10 mg/mL 水溶液
PureYield 质粒中量提取系统	Promega Corp.	A2495
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P8833	250 μg/mL 水溶液
QIAquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28706
Ramos (RA 1) 细胞	ATCC	CRL-1596
RPMI-1640 培养基	Sigma-Aldrich	R8758
SuperScript II	Invitrogen	18064-022
SYBR FAST qPCR 试剂盒	KAPA Biosystems	KK4601
Taq DNA 聚合酶	Invitrogen	18038-042
TOPO TA 克隆试剂盒	Invitrogen	K4520-01
TRIzol	Invitrogen	15596-026
Wizard SV 基因组DNA纯化系统	Promega Corp.	A2361
X-Gal [5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷]	Growcells	C-5687	40 mg/mL DMSO 溶液