哺乳动物连接组蛋白亚型的表达分析

摘要

我们描述了一组用于分析H1连接子组蛋白表达水平的检测方法。通过基于随机引物的逆转录反应，随后进行实时PCR，可对各个H1基因的mRNA进行定量检测；而H1组蛋白的蛋白质定量则通过高效液相色谱（HPLC）分析实现。

摘要

连接组蛋白H1结合核小体核心颗粒和连接DNA，促进染色质折叠成更高级的结构。H1对哺乳动物的发育至关重要¹，并在体内调节特定基因的表达in vivo^2-4。在高度保守的组蛋白家族中，H1连接组蛋白家族是异质性最强的一组。哺乳动物中有11种H1亚型，它们在发育过程及不同细胞类型中受到差异性调控。这些H1亚型包括5种体细胞H1（H1a-e）、替代型H1⁰、4种生殖细胞特异性H1亚型以及H1x⁵。多种H1亚型在DNA结合亲和力和染色质压缩能力方面存在差异^6-9，这为染色质功能的调控提供了额外的调节层次。因此，对各个H1亚型的mRNA和蛋白质进行定量表达分析，对于深入理解染色质高级结构与功能的调控机制十分必要。

本文描述了一组用于分析各H1亚型表达水平的检测方法（图1）。通过一组高灵敏度、定量的逆转录PCR（qRT-PCR）检测方法测定多种H1变异体基因的mRNA表达水平，该方法相比Northern印迹分析等传统方法更快、更准确，且所需样本量更少。与其他大多数细胞mRNA不同，包括大多数H1基因在内的组蛋白基因mRNA缺乏长的polyA尾，但在其3'非翻译区（UTR）含有一个茎环结构¹⁰。因此，cDNA的合成采用随机引物而非oligo-dT引物对总RNA进行逆转录。使用针对每种H1亚型特异的引物（表1）进行实时PCR检测，以实现对各H1亚型mRNA水平的高度定量测量。同时分析管家基因的表达，作为归一化对照。

通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析从哺乳动物细胞中提取的总组蛋白，可获得每种H1亚型及核心组蛋白的相对丰度^11-13。本文所述的HPLC方法和洗脱条件可实现小鼠H1亚型的最佳分离。通过对HPLC图谱进行定量分析，我们可计算H1家族中各H1亚型的相对比例，并确定细胞中H1与核小体的比率。

方案

1. 样品制备与RNA提取

1. 在进行RNA提取之前，所有工作台面和移液器均需用70%乙醇擦拭，并使用RNase去污染溶液（如RNase Zap）处理。该操作可降低RNase污染和RNA降解的风险。所有操作过程中均需佩戴手套。
2. 若从鼠类组织中提取RNA，需从安乐死的小鼠中分离目标器官，并用预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS：0.13 M NaCl，5 mM 磷酸氢二钠七水合物，5 mM 磷酸二氢钠七水合物，pH 7.4）清洗组织。随后立即进入步骤1.4进行RNA提取。若不立即处理新鲜组织用于RNA提取，则应将组织样本迅速在液氮中冷冻，并于-80 °C保存以备后续使用。
3. 若从贴壁细胞培养物中提取RNA，需吸除培养基，用足量PBS冲洗，然后直接向培养板中加入Trizol试剂（Invitrogen），并进入步骤1.4。对于悬浮生长的细胞，需通过离心收集细胞并形成沉淀，弃去培养基，用PBS短暂冲洗沉淀，再次离心收集细胞。加入Trizol试剂后进入步骤1.4。
4. 使用足量的Trizol试剂是获得高质量RNA的关键。每50–100 mg组织、5–10 × 10⁶个细胞（悬浮培养）或每3.5 cm培养板（贴壁培养）使用1 ml Trizol试剂。使用Polytron PT2100匀浆器（或同等设备）在Trizol试剂中充分匀浆组织。随后按照Trizol试剂（Invitrogen）的制造商说明书操作，从组织样本或细胞中提取RNA。
5. 使....

讨论

本文所介绍的一系列检测方法可实现对哺乳动物连接组蛋白亚型表达水平的全面分析。设计合理的qRT-PCR检测能够对任意哺乳动物组蛋白H1基因的RNA转录本进行高灵敏度和高准确度的定量。针对连接组蛋白亚型基因的qRT-PCR检测，其关键步骤在于使用随机引物进行逆转录以制备cDNA。大多数组蛋白基因（包括大多数H1基因）的mRNA不含有其他细胞mRNA中常见的长poly-A尾结构，因此使用oligo-dT引物的传统逆转录方法无法高效生成H1的cDNA。对于少数mRNA含有poly-A尾的H1基因（如H1⁰），采用基于随机六聚体的qRT-PCR同样可获得有效的表达分析结果（图3），这可能归因于H1 RNA的高丰度。尽管如此，为提高低拷贝数的polyadenylated mRNA的逆转录效率，可在逆转录反应中联合使用oligo-dT引物与随机六聚体，从而拓宽qRT-PCR可检测的基因范围。实验中同时检测内参基因（如看家基因GAPDH）的qRT-PCR结果，以便比较不同组织或细胞类型中特定H1基因的相对表达水平（图3）。通过将qRT-PCR与标准曲线分析相结合，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNase Zap	Applied Biosystems	AM9780
Trizol 试剂	Invitrogen	15596-018
SuperScriptIII	Invitrogen	18080-051
无水乙醇	Fisher Scientific	BP2818-4
IQ SYBR Green	Bio-Rad	170-8880
RNeasy Mini 试剂盒	Qiagen	74104
脱氧核糖核酸酶 I	Sigma-Aldrich	AMP-D1
Microseal 96 孔 PCR 板	Bio-Rad	MSP-9605
Microseal ’B’ 黏性封膜	Bio-Rad	MSB-1001
蔗糖	Acros Organics	AC40594
磷酸氢二钠七水合物 (Na2HPO4·7H2O)	Fisher Scientific	BP332
氯化钠 (NaCl)	American Bioanalytical	AB01915
磷酸二氢钠七水合物 (NaH2PO4·7H2O)	Fisher Scientific	BP-330
HEPES	Fisher Scientific	BP310
Complete Mini 蛋白酶抑制剂混合片	Roche Group	11836153001
EDTA	Sigma-Aldrich	E-5134
苯甲基磺酰氟 (PMSF)	American Bioanalytical	AB01620
壬基酚聚氧乙烯醚-40 (NP-40)	American Bioanalytical	AB01425
氯化钾 (KCl)	Fisher Scientific	BP366
Tris [羟甲基氨基甲烷]	American Bioanalytical	AB02000
氯化镁 (MgCl2)	Fisher Scientific	BP214
硫酸 (H2SO4)	VWR international	VW3648-3
氢氧化铵 (NH4OH)	Acros Organics	AC42330
Bradford 蛋白检测试剂盒	Bio-Rad	500-0001
乙腈	EMD Millipore	AX0145-1
三氟乙酸 (TFA)	JT Baker	9470-01