我们描述了一组用于分析H1连接子组蛋白表达水平的检测方法。通过基于随机引物的逆转录反应，随后进行实时PCR，可对各个H1基因的mRNA进行定量检测；而H1组蛋白的蛋白质定量则通过高效液相色谱（HPLC）分析实现。
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摘要
摘要
连接组蛋白H1结合核小体核心颗粒和连接DNA，促进染色质折叠成更高级的结构。H1对哺乳动物的发育至关重要1，并在体内调节特定基因的表达in vivo2-4。在高度保守的组蛋白家族中，H1连接组蛋白家族是异质性最强的一组。哺乳动物中有11种H1亚型，它们在发育过程及不同细胞类型中受到差异性调控。这些H1亚型包括5种体细胞H1（H1a-e）、替代型H10、4种生殖细胞特异性H1亚型以及H1x5。多种H1亚型在DNA结合亲和力和染色质压缩能力方面存在差异6-9，这为染色质功能的调控提供了额外的调节层次。因此，对各个H1亚型的mRNA和蛋白质进行定量表达分析，对于深入理解染色质高级结构与功能的调控机制十分必要。
本文描述了一组用于分析各H1亚型表达水平的检测方法（图1）。通过一组高灵敏度、定量的逆转录PCR（qRT-PCR）检测方法测定多种H1变异体基因的mRNA表达水平，该方法相比Northern印迹分析等传统方法更快、更准确，且所需样本量更少。与其他大多数细胞mRNA不同，包括大多数H1基因在内的组蛋白基因mRNA缺乏长的polyA尾，但在其3'非翻译区（UTR）含有一个茎环结构10。因此，cDNA的合成采用随机引物而非oligo-dT引物对总RNA进行逆转录。使用针对每种H1亚型特异的引物（表1）进行实时PCR检测，以实现对各H1亚型mRNA水平的高度定量测量。同时分析管家基因的表达，作为归一化对照。
通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析从哺乳动物细胞中提取的总组蛋白，可获得每种H1亚型及核心组蛋白的相对丰度11-13。本文所述的HPLC方法和洗脱条件可实现小鼠H1亚型的最佳分离。通过对HPLC图谱进行定量分析，我们可计算H1家族中各H1亚型的相对比例，并确定细胞中H1与核小体的比率。
方案
1. 样品制备与RNA提取
- 在进行RNA提取之前，所有工作台面和移液器均需用70%乙醇擦拭，并使用RNase去污染溶液（如RNase Zap）处理。该操作可降低RNase污染和RNA降解的风险。所有操作过程中均需佩戴手套。
- 若从鼠类组织中提取RNA，需从安乐死的小鼠中分离目标器官，并用预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS：0.13 M NaCl，5 mM 磷酸氢二钠七水合物，5 mM 磷酸二氢钠七水合物，pH 7.4）清洗组织。随后立即进入步骤1.4进行RNA提取。若不立即处理新鲜组织用于RNA提取，则应将组织样本迅速在液氮中冷冻，并于-80 °C保存以备后续使用。
- 若从贴壁细胞培养物中提取RNA，需吸除培养基，用足量PBS冲洗，然后直接向培养板中加入Trizol试剂（Invitrogen），并进入步骤1.4。对于悬浮生长的细胞，需通过离心收集细胞并形成沉淀，弃去培养基，用PBS短暂冲洗沉淀，再次离心收集细胞。加入Trizol试剂后进入步骤1.4。
- 使用足量的Trizol试剂是获得高质量RNA的关键。每50–100 mg组织、5–10 × 106个细胞（悬浮培养）或每3.5 cm培养板（贴壁培养）使用1 ml Trizol试剂。使用Polytron PT2100匀浆器（或同等设备）在Trizol试剂中充分匀浆组织。随后按照Trizol试剂（Invitrogen）的制造商说明书操作，从组织样本或细胞中提取RNA。
- 使用Nanodrop 1000（Thermo Scientific）测定RNA浓度，并通过凝胶电泳分析RNA质量。典型得率范围为每毫克组织1–10 μg RNA，或每1 × 106个培养细胞5–15 μg RNA。为消除RNA样品中可能残留的微量基因组DNA污染，需按照制造商说明使用无RNase的DNase（Sigma AMP-D1）处理RNA样品。重复测定RNA浓度并进行凝胶电泳，以确认该处理未引起RNA降解。提取的RNA应储存于-80 °C。
*注意：也可根据试剂盒说明书使用RNAeasy试剂盒（Qiagen）提取RNA，或使用DNA/RNA试剂盒（Qiagen）同时提取DNA和RNA。
2. 定量逆转录 PCR（qRT-PCR）
- 使用 Superscript III First-strand Synthesis System（Invitrogen）将总 RNA 逆转录为 cDNA。由于大多数 H1 基因的 mRNA 缺乏 poly-A 尾巴，因此在 cDNA 合成中必须使用 随机六聚体引物（random hexamers）而非 oligo-dT 作为引物。然而，如果同时需要分析低水平表达的具有多聚腺苷酸化 mRNA 的基因，则应在逆转录（RT）反应中使用随机六聚体与 oligo-dT 的混合物，以提高多聚腺苷酸化 mRNA 的逆转录效率。
- 按照制造商说明书进行 RT 反应。简要步骤如下：
- 在 0.5 ml PCR 管中，加入 5 μg 总 RNA、1 μl 浓度为 50 ng/μl 的随机六聚体引物、1 μl 浓度为 10 mM 的 dNTP 混合物，并用 DEPC 处理的 H2O 补充至总体积为 10 μl。充分混匀后，在 65 °C 孵育 5 分钟，随后立即置于冰上孵育 1 分钟。
- 配制 10 μl 的 cDNA 合成混合液：包含 2 μl 10xRT 缓冲液、4 μl 25 mM MgCl2、2 μl 0.1 M DTT、1 μl RNaseOut（40 U/μl）和 1 μl SuperScript III RT（200 U/μl），然后将其加入 RNA/引物混合物中。
- 先在 25 °C 孵育 10 分钟，接着在 50 °C 孵育 50 分钟，最后在 85 °C 终止反应 5 分钟。
- 每个反应通常可产生 100–250 ng/μl 的 cDNA 产物。将 cDNA 产物储存于 -20 °C，或直接用于实时定量 PCR（qPCR）。
- qPCR 能够以高效率和高重复性准确量化目标序列拷贝数14。我们选择使用 SYBR Green 染料检测的 qPCR 方法，该染料仅在嵌入双链 DNA（dsDNA）时发出荧光信号。尽管其特异性不如 Taqman 检测法14，但该方法成本更低，在实验室中更易于实施，且具有更高的灵活性。因此，必须通过分析 qPCR 的扩增曲线（图 2A）以及 qPCR 产物的导数熔解曲线（图 2B），以确保反应的效率和特异性。
| 组蛋白亚型 | 小鼠组蛋白命名法 | 人类组蛋白命名法 | ||
| 基因名称 | 登录号 | 基因名称 | 登录号 | |
| 组蛋白 H1a | Hist1h1a | NM_030609 | HIST1H1A (H1.1) | NM_005325 |
| 组蛋白 H1b | Hist1h1b | NM_020034 | HIST1H1B (H1.5) | NM_005322 |
| 组蛋白 H1c | Hist1h1c | NM_015786 | HIST1H1C (H1.2) | NM_005319 |
| 组蛋白 H1d | Hist1h1d | NM_145713 | HIST1H1D (H1.3) | NM_005320 |
| 组蛋白 H1e | Hist1h1e | NM_015787 | HIST1H1E (H1.4) | NM_005321 |
| 组蛋白 H1° | H1f0 | NM_008197 | H1F0 | NM_005318 |
| 组蛋白 H1oo | H1foo | NM_183811 | H1FOO | NM_153833 |
| 组蛋白 H1t | Hist1h1t | NM_010377 | HIST1H1T | NM_005323 |
| 组蛋白 H1t2 | H1fnt | NM_027304 | H1FNT | NM_181788 |
| 组蛋白 H1x | H1fx | NM_198622 | H1FX | NM_006026 |
| 组蛋白 Hils1 | Hils1 | NM_081792 | HILS1 | AY286318 |
表1. 小鼠和人类组蛋白H1亚型的命名法。
- 针对每个 H1 基因设计特异性的正向和反向 PCR 引物（表 1）。由于体细胞 H1 基因之间具有高度的序列相似性，尤其是在对应中心球状结构域的区域，因此必须确保为特定 H1 亚型设计的引物不会与其他 H1 基因发生序列比对，或交叉扩增其他 H1 亚型。还需注意，大多数 H1 基因不含内含子，因此通常用于 RT-PCR 以避免基因组污染的跨内含子引物不可行。取而代之的是，RNA 样本应预先用 DNase 处理（见 1.5）以消除任何微量的基因组污染。此外，应平行进行无逆转录酶的 qPCR（RT(-)-qPCR），以验证 cDNA 样本中无基因组污染。
- 同时设计内部参照基因的引物，其表达水平在各样本间保持稳定。通常选择看家基因，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和 β-肌动蛋白基因，作为参照基因。看家基因的 qPCR 信号用作归一化对照。
- 按以下方式配制每份 PCR 反应体系（总体积 25 μl）：12.5 μl 的 2× IQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）（含 dNTPs、50 U/ml iTaq DNA 聚合酶、6 mM MgCl2、SYBR Green I 和 20 nM 荧光素），2 μl 浓度为 4 ng/μl 的 cDNA，1.25 μl 浓度为 10 nM 的正向/反向引物混合液，以及 9.25 μl ddH2O，在 Microseal 96 孔 PCR 板中充分混匀。使用 Microseal 'B' 粘性封膜（Bio-rad）确保板盖与 PCR 板密封。轻敲或短暂涡旋混匀 PCR 板，然后短暂离心使反应液沉至管底。将 PCR 板放入 MyIQ 单色实时 PCR 检测系统（Bio-rad）中进行 qPCR。
- 我们采用以下 qPCR 程序：95 °C 预变性 3 分钟，随后进行 40 个循环（95 °C 变性 10 秒，60 °C 退火 20 秒，72 °C 延伸 30 秒）。检查扩增曲线（图 2A）以评估 PCR 扩增效率和 Ct 值（循环阈值）。阈值线可由 IQ5 光学系统软件 2.0 版本自动设定。
- 可通过标准曲线实验检测引物效率及所需的最佳 cDNA 浓度，该实验使用基因组 DNA 的系列稀释液进行 qPCR，并将 Ct 值对模板 DNA 量的对数作图。优化良好的 qPCR 实验应得到线性标准曲线，其决定系数（R2）> 0.98。应避免使用扩增片段长度超过 200 bp 的引物，因其扩增效率通常较低。
- 由于 SYBR Green 可结合任何双链 DNA，因此在 qPCR 后必须进行熔解曲线分析，以确保仅目标扩增产物被扩增和检测，而非引物二聚体或其他污染物。进行熔解曲线分析时，设定 qPCR 仪以 0.5 °C 递增的方式将样品从 55 °C 加热至 95 °C，并在每个温度点采集数据。MyIQ（Bio-rad）仪器的默认熔解曲线分析程序如下：95 °C 1 分钟，55 °C 1 分钟，随后进行 81 个循环（每个循环在设定温度 55 °C 下保持 10 秒，进行熔解曲线分析，温度递增 0.5 °C，每循环由相机采集数据）。
- 由于双链 DNA 的熔解温度（Tm）取决于扩增片段的长度和 GC 含量，不同扩增产物具有不同的 Tm 值。通过分析 qPCR 产物的导数熔解曲线，确认目标扩增产物的特异性熔解温度，并确保无非特异性扩增峰（图 2B）。
- 每个检测应设置重复或三复孔，以便进行统计分析。qRT-PCR 实验中应包含阴性对照，例如 RT(-)-qPCR（以 RNA 为模板但未进行逆转录的 qPCR）以及 PCR 体系中未添加 cDNA、RNA 或 DNA 模板的 qPCR。RT(-)-qPCR 可作为潜在基因组 DNA 污染的对照（图 2 和 图 3 中的 RT(-)）。
- 使用 IQ5 光学系统软件 2.0 版本（Bio-rad）分析 qPCR 数据。将 H1 亚型基因的表达值用看家基因（如 GAPDH、ß-actin、HPRT）的表达值进行归一化，以获得 H1 基因的相对表达水平。
3. 总组蛋白的制备
* 所有操作均应在冰上或 4 °C 下进行。
- 解剖小鼠组织，用预冷的PBS冲洗。（若不能立即进行提取，则按步骤1.2所述迅速冷冻并储存样品。）用刀片将组织切成小块。将切碎的组织转移至Dounce匀浆器（B型杵）。每克组织加入10 ml蔗糖缓冲液（0.3 M蔗糖，15 mM NaCl，10 mM HEPES [pH 7.9]，2 mM EDTA，0.5 mM PMSF，Complete Mini蛋白酶抑制剂混合片剂，现用现加）。用10–15次冲程匀浆组织。
- 将匀浆液转移至15 ml离心管中，在500 rpm下离心30秒（离心机型号：Eppendorf 5810R）；小心将上清液转移至新管中（弃去沉淀——组织碎片），在2000 rpm下离心5分钟，以沉淀细胞。继续进行步骤3.4。
- 若需从单层培养的细胞中提取组蛋白和染色质，用 PBS 洗涤细胞，向培养皿中加入 PBS，用细胞刮收集细胞，并通过离心收集细胞沉淀。对于悬浮培养的细胞，通过离心收集细胞沉淀。
- 将细胞沉淀重悬于 10 ml 蔗糖缓冲液中，缓冲液中添加 0.5% NP-40（按每克起始组织量或 10⁸ 个细胞计）。将样品转移至 Dounce 匀浆器（B 型杵）中，在 20 分钟孵育时间内匀浆 10 次。此时可获得细胞核。在显微镜下检查细胞核的质量。以 2000 rpm 离心 5 分钟收集细胞核沉淀，弃去上清液。
- 将核沉淀重悬于3 ml高盐缓冲液（0.35 M KCl，10 mM Tris [pH 7.2]，5 mM MgCl₂）中2，每克组织或10^8个细胞加入含0.5 mM PMSF（每次使用前新鲜添加）的裂解液。将样品转移至小型Dounce匀浆器（B型杵）中，用5–10次 strokes 进行匀浆。
- 将悬液分装至3个Eppendorf管中（每管1 ml），冰上孵育20分钟，随后在14,000 rpm离心10分钟以沉淀染色质。弃去上清液。
- 加入 0.8 ml 0.2 N H2SO4 向每份染色质沉淀中加入适量溶液。使用Eppendorf管专用研杵进行Dounce匀浆，充分研磨直至沉淀完全解离。将样品置于旋转平台上孵育 4 °C 过夜。此酸处理步骤用于提取总组蛋白。
- 以 14,000 rpm 离心 10 分钟。将上清液（组蛋白提取物）转移至两个 Eppendorf 管中400 μl/tube). 弃去沉淀。向每根离心管中加入2.5倍体积（1 ml）的预冷乙醇。将样品置于-20 °C 过夜。
- 在14,000 rpm下离心10分钟以沉淀总组蛋白，弃去上清液。用70%乙醇洗涤沉淀物三次，在室温放置20–30分钟使其风干。将干燥后的蛋白质于-80 °C 或将其溶解于ddH₂O中2O，并立即进行HPLC分析。干燥的蛋白质可在-80 °C 长达1年。
4. 连接组蛋白的高效液相色谱分析
- 根据反相柱的容量和HPLC仪器的要求，将组蛋白沉淀重悬于推荐体积的ddH2O中。我们使用C18反相柱（250 x 4.6 mm，Vydac）和Äktapurifier UPC 900仪器（GE healthcare）进行HPLC分析。通常将50–100 μg总组蛋白溶解于100 μl ddH2O中用于分析。
- 以14,000 rpm离心5分钟，去除不溶性残渣。采用Bradford蛋白定量法测定上柱蛋白量。向HPLC系统的反相柱中上样50–100 μg总蛋白。应避免上样过量蛋白，以防柱子堵塞。
- 按照表2所列的乙腈梯度递增程序，分离连接组蛋白与核心组蛋白。
| 时间（分钟） | 乙腈/0.1% TFA (%) | 0.1% TFA/ddH2O (%) |
| 0 | 0 | 100 |
| 1 | 5 | 95 |
| 11 | 25 | 75 |
| 26 | 30 | 70 |
| 45 | 35 | 65 |
| 66 | 40 | 60 |
| 75 | 43 | 57 |
| 126 | 55 | 45 |
| 131 | 90 | 10 |
| 136 | 5 | 95 |
表2. 随时间增加乙腈浓度的梯度变化。
- 在 214 nm 处监测流出液，并使用 Äktapurifier UPC 900（GE Healthcare）及 UNICORN 5.11 软件（GE Healthcare）记录和分析高效液相色谱图谱 （图 4）。也可使用自动组分收集器（Frac-920 - GE）收集蛋白组分，用于后续分析，例如 SDS-PAGE 和质谱分析。
- 各 H1 亚型和 H2B 峰的 A214 值通过相应组蛋白蛋白的肽键数量进行归一化处理。根据这些归一化的 A214 值，可计算 H1 家族内各个 H1 组蛋白亚型的相对比例，以及 H1 亚型与核小体核心颗粒的比率 （图 5）。
5. 代表性结果
哺乳动物H1亚型列表、整体流程图以及各个组蛋白H1基因表达分析的代表性结果分别见表1、图1和图2-5。图2A显示了使用从小鼠肝脏和小鼠胚胎干细胞（mESCs）制备的cDNA进行H1a基因qPCR反应的典型扩增曲线，而图2B显示了相应扩增产物的导数熔解曲线。熔解曲线在86 °C的熔解温度（Tm）处呈现单一特征性峰，且无非特异性背景峰，表明H1a qPCR检测具有高特异性。对扩增曲线（图2A）的评估显示，每个样本的三个重复qPCR反应产生了几乎相同Ct值的一致信号，表明该实验具有高度可重复性。RT(-)-qPCR反应中未出现扩增产物的累积，表明基因组DNA污染不存在或可忽略不计。利用H1基因和看家基因（如GAPDH）的Ct值，计算出各个H1基因的相对RNA表达水平。H1°和H1a基因的计算结果示例见图3。与小鼠肝脏相比，H1a mRNA的相对表达水平在mESCs中更高，而H1°的表达水平在肝脏中显著高于mESCs。
从小鼠胚胎干细胞（mESC）与成年小鼠肝脏中组蛋白H1a或H1°的表达差异可明显看出HPLC组蛋白谱图的不同（图4）。H1°是与分化相关的H1亚型，在成熟组织中大量积累，在成年肝脏中占总H1的27.2%（图5A）。相比之下，未分化的mESC中几乎检测不到H1°蛋白（图4B）。另一方面，H1a在mESC中无论是在mRNA转录本还是蛋白水平均高表达（图3和4B）。通过定量HPLC谱图中H1的峰面积，可确定H1家族中各H1亚型的相对比例（图5A）。此外，可通过相应H1亚型（或总H1）的标准化A214峰面积值与H2B标准化A214值的一半之比，计算每个核小体中各H1亚型（或总H1）的含量（图5B）。
图1. 哺乳动物连接组蛋白亚型表达分析的整体方案。
图2. H1a qPCR检测的代表性结果。（A）H1a qPCR检测的扩增曲线。图中显示了由IQ5光学系统软件设定的阈值线和Ct值。（B）qPCR产物的导数熔解曲线，对应于（A）中的产物。
图 3. 小鼠胚胎干细胞（mESCs）和成年小鼠肝脏中 H1a 和 H1° mRNA 水平的定量逆转录 PCR（qRT-PCR）分析。Y 轴表示 H1 基因相对于参考基因 GAPDH 的相对表达水平。RT(-) 样本（未进行逆转录的 RNA）的 qPCR 结果显示极低或无信号。
图 4. 从小鼠哺乳动物细胞中提取的组蛋白的高效液相色谱分析。对从成年小鼠肝脏（A）和小鼠胚胎干细胞（B）中提取的100 μg总组蛋白进行反相高效液相色谱分析。X轴：洗脱时间。Y轴：mAU，毫吸收单位。
图5. 成年小鼠肝脏中H1亚型组成及每个核小体对应的H1比例。各H1亚型和H2B的峰面积A214值使用UNICORN 5.11软件（GE Healthcare）计算，并根据相应组蛋白蛋白中的肽键数量进行归一化处理。所有H1亚型归一化A214值的总和作为总H1的数值。每种H1亚型占总H1的百分比（A），以及H1与核小体（以H2B归一化A214值的一半表示）的比例（B），均根据图4A所示的高效液相色谱图谱计算得出。
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讨论
本文所介绍的一系列检测方法可实现对哺乳动物连接组蛋白亚型表达水平的全面分析。设计合理的qRT-PCR检测能够对任意哺乳动物组蛋白H1基因的RNA转录本进行高灵敏度和高准确度的定量。针对连接组蛋白亚型基因的qRT-PCR检测，其关键步骤在于使用随机引物进行逆转录以制备cDNA。大多数组蛋白基因（包括大多数H1基因）的mRNA不含有其他细胞mRNA中常见的长poly-A尾结构，因此使用oligo-dT引物的传统逆转录方法无法高效生成H1的cDNA。对于少数mRNA含有poly-A尾的H1基因（如H10），采用基于随机六聚体的qRT-PCR同样可获得有效的表达分析结果（图3），这可能归因于H1 RNA的高丰度。尽管如此，为提高低拷贝数的polyadenylated mRNA的逆转录效率，可在逆转录反应中联合使用oligo-dT引物与随机六聚体，从而拓宽qRT-PCR可检测的基因范围。实验中同时检测内参基因（如看家基因GAPDH）的qRT-PCR结果，以便比较不同组织或细胞类型中特定H1基因的相对表达水平（图3）。通过将qRT-PCR与标准曲线分析相结合，...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM085261 及佐治亚癌症联盟杰出学者奖（授予 Y.F.）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Trizol 试剂 | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| 无水乙醇 | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| 脱氧核糖核酸酶 I | Sigma-Aldrich | AMP-D1 | |
| Microseal 96 孔 PCR 板 | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Microseal ’B’ 黏性封膜 | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| 蔗糖 | Acros Organics | AC40594 | |
| 磷酸氢二钠七水合物 (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| 氯化钠 (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 | |
| 磷酸二氢钠七水合物 (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Complete Mini 蛋白酶抑制剂混合片 | Roche Group | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | |
| 苯甲基磺酰氟 (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 | |
| 壬基酚聚氧乙烯醚-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 | |
| 氯化钾 (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [羟甲基氨基甲烷] | American Bioanalytical | AB02000 | |
| 氯化镁 (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| 硫酸 (H2SO4) | VWR international | VW3648-3 | |
| 氢氧化铵 (NH4OH) | Acros Organics | AC42330 | |
| Bradford 蛋白检测试剂盒 | Bio-Rad | 500-0001 | |
| 乙腈 | EMD Millipore | AX0145-1 | |
| 三氟乙酸 (TFA) | JT Baker | 9470-01 |
参考文献
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