一种用于在活体生物中随时间追踪细胞融合的方法。该方法利用 Cre-LoxP 通过细胞融合诱导荧光素酶表达的重组。所产生的发光信号可在活体生物中利用生物发光成像系统进行检测，其检测灵敏度为 ˜外周组织中的1,000个细胞。
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摘要
摘要
同一类型的两个或多个细胞具有相互融合的能力，这一特性在后生动物的进化过程中被广泛用于形成多种复杂器官，包括骨骼肌、骨组织和胎盘。近期研究表明，同类型细胞的融合能够赋予细胞更强的功能。例如，当胎盘中的滋养层细胞融合形成合体滋养层细胞时，合体滋养层相较于未融合的滋养层细胞，能更有效地在母胎屏障间转运营养物质和激素。1-4近期的研究表明，不同类型细胞的融合能够引导细胞命运的改变。过去认为，通过细胞融合实现的细胞命运“逆转”或重编程仅限于细胞培养系统。然而，随着干细胞移植技术的出现，我们及其他研究团队发现，干细胞能够与体细胞发生融合 体内 且该融合促进干细胞分化5-7因此，细胞融合是一种受调控的过程，能够促进细胞存活和分化，因而可能在发育、组织修复乃至疾病发病机制中具有核心重要性。
限制细胞融合研究的问题在于缺乏适当的技术：1）准确识别融合产物；2）长期追踪融合产物。本文提出一种新颖的方法，通过在融合发生时诱导生物发光，以克服上述两项局限图1）；生物发光可被高灵敏度地检测到 体内8-15. 我们使用一种编码萤火虫荧光素酶（Photinus pyralis) 基因置于由两侧包围的终止密码子附近 LoxP 序列 当表达该基因的细胞与表达 Cre 重组酶蛋白的细胞融合时， LoxP 位点被切割，终止信号被切除，从而允许荧光素酶的转录。 由于信号是可诱导的，因此假阳性信号的发生率非常低。与现有利用Cre/LoxP 系统16, 17我们引入了一种“活体”检测信号，从而首次提供了追踪细胞融合动力学过程的机会 体内.
为了展示该方法，将广泛表达Cre重组酶的小鼠作为受体，接受转染了携带荧光素酶报告基因构建体的干细胞，该构建体的荧光素酶表达位于floxed终止密码子的下游。 通过心肌内注射将干细胞移植，并在移植后进行活体成像分析，以随时间追踪心脏及周围组织中细胞融合产物的存在情况。该方法可适用于在发育、疾病或成体组织修复的任何阶段，分析任何组织类型中的细胞融合现象。
方案
1. 供体细胞转染
- 收获间充质干细胞（MSCs，源自H1胚胎干细胞，由Peiman Hematti博士惠赠； alternatively，任何假定会发生融合的任何物种的任何细胞类型） 体内 当细胞融合度达到70 - 80%时，使用1×胰蛋白酶（Mediatech，Manassas，VA）消化5分钟。 用不含抗生素的α-MEM完全培养基（Invitrogen，Carlsbad CA）灭活胰蛋白酶18离心，300 × g，5 分钟。
- 小心吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL 1×PBS中，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 转移 1.5 × 106 将细胞转移至1.5 mL离心管中，300 × g离心5分钟。
- 小心吸除上清液。将沉淀重悬于 300 μL Neon 转染系统（Invitrogen）的 R 缓冲液 6 μg (2 μg / 5.0 × 105 将p231 pCMVe-betaAc-STOP-luc（Addgene，美国马萨诸塞州剑桥市）质粒转染至细胞中。按照制造商说明书（Neon转染系统，Invitrogen），向电穿孔对接孔中加入3 mL E缓冲液（Invitrogen）。
- 将细胞-质粒溶液转移至 100 μL 使用Neon移液器吸头，以20 ms脉冲时长和1500伏电压进行电穿孔。将电穿孔后的细胞加入含有9.7 mL α-MEM完全培养基的15 mL锥形管中。
- 重复步骤1.5两次，合并转染细胞，终体积为10 mL。加入10 mL细胞悬液（1.5 x 106 细胞）接种至含有10 mL α-MEM完全培养基的T175培养瓶中。电穿孔后细胞活力约为30%，可获得约4.5 × 105 每T175培养瓶中的活细胞数
- 转染后24小时更换α-MEM完全培养基。
- 当转染细胞融合度达到70 - 80%时收集（电穿孔后约2 - 3天）。使用血细胞计数板进行细胞计数，并将细胞重悬至浓度为1.0 x 106 细胞50 μL α-MEM完全培养基。尽量缩短细胞处于悬浮状态的时间，以减少注射前的细胞死亡。
2. 心肌内注射
- 使用异氟烷（Phoenix Pharmaceuticals, Inc., St. Joseph, MO）对转基因小鼠进行麻醉，该小鼠经基因工程改造后可在每个细胞中持续表达Cre重组酶（B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J，Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）。
- 使用电动剃毛器或化学脱毛剂去除胸部区域的毛发。
- 插入18号导管（Becton Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ）进行气管插管，并将小鼠连接至呼吸机，呼吸频率设置为每分钟120–130次，潮气量为150 μL。
- 在第四肋间作横向切口，建立开胸术通路。
- 观察心脏后，使用1 mL注射器（Temuro Medical Corporation, Somerset, NJ）和28号针头（Becton Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ）进行两次心肌内注射，每次注射25 μL转染细胞悬液。为便于心肌内注射并防止对器官造成过度损伤，可将针头尖端弯曲约90度。
- 注射完成后，使用可吸收缝线（如Vicryl）缝合肋骨和肌肉层，皮肤则用4-0尼龙线或丝线缝合。
- 让小鼠从麻醉中恢复，并拔除气管插管。
- 对照组应包括仅接受培养基注射的Cre小鼠、接受相同浓度未转染细胞的Cre小鼠，以及接受转染细胞的野生型小鼠（或 alternatively，接受不易融合转染细胞的Cre小鼠）。
3. 生物光子成像
- 成像前5至15分钟，按每克小鼠体重10 μL的剂量，腹腔注射（IP）15 mg/mL的D-荧光素酶底物（D-Luciferin）（Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA）。
- 使用异氟烷对小鼠进行麻醉诱导，诱导浓度为4%，维持浓度为1 - 2%。
- 将小鼠仰卧置于成像盒中，通过面罩持续给予1 - 2%异氟烷以维持麻醉状态（Xenogen Biophotonic Imaging System, Hopkinton, MA）。可同时对多只小鼠进行成像。建议将假手术对照小鼠与实验小鼠一同成像，以便于发光信号的直观比较。
- 使用Living Image软件（Xenogen）设置合适的曝光时间（通常为60秒，参见结果部分），调整成像区域以适配小鼠体型，并在整个成像过程中保持区域一致，以避免灵敏度变化。将成像对象高度设为4.5 cm。
- 采集视野内小鼠的生物发光强度信号，并保存未经修改的原始图像文件。对图像进行处理，去除与对照组或未经处理小鼠相对应的背景信号。高于背景的信号强度反映动物体内融合细胞的存在。可使用Living Image软件（Xenogen）或开源图像分析软件进行强度分析。通常选择感兴趣区域（ROI）以比较不同动物及实验间的信号强度数据。
4. 代表性结果
为了确定Xenogen生物发光成像系统的灵敏度，将一种持续表达荧光素酶的细胞系（231-LUC-D3H1，Xenogen）注射至C57/Bl6小鼠（Jackson Laboratory）的心肌中。细胞注射浓度分别为1 × 106、1 × 103 或 1 × 101 个细胞。细胞移植后6小时，小鼠经腹腔注射荧光素底物，并使用Xenogen系统进行成像。当注射细胞数为1,000个时可检测到特异性信号（6只小鼠中有2只检测到信号，图2），而当细胞数为10,000个时检测结果更为可靠（6只小鼠均检测到信号）。重要的是，本研究还建立了荧光素酶表达细胞数量与信号强度之间的粗略相关性。
为验证所述方案在检测和追踪细胞融合方面的实用性，将转染了LoxP-Stop-LoxP-Luciferase质粒（Addgene）的MSCs递送至心肌组织 Cre表达该基因的小鼠。细胞移植后约一周，首先使用Xenogen系统对小鼠进行成像 无 D-荧光素注射。正如预期，未使用酶底物时，未检测到强度信号（图3。随后，腹腔注射 D-荧光素，检测到四只小鼠中有两只出现了与荧光素酶强度相对应的信号，表明发生了细胞融合。一周后，再次检测到类似的信号。图3），表明MSC偶联的融合产物可以被维持 体内. 在此情况下，研究被终止以评估心脏及周围组织，但可以设想进行更长期的分析和更频繁的成像，以追踪小鼠体内融合产物的维持、增殖以及可能的迁移。
图1. 检测细胞融合技术的示意图 在体实验. 如果表达Cre的小鼠细胞与移植的携带floxed荧光素酶质粒的细胞发生融合，则会表达荧光素酶。通过向小鼠体内注射荧光素酶底物D-荧光素（D-luciferin），随后使用Xenogen生物发光成像系统对小鼠进行成像，即可检测荧光素酶的表达（改编自文献19）。
图 2. 利用生物光子成像技术检测心肌组织中表达荧光素酶细胞的灵敏度。将稳定表达荧光素酶的细胞系（231-LUC-D3H1，Xenogen）以不同总细胞数量注射至C57/Bl6小鼠的心肌内。图像显示分别接受 1 × 106、1 × 103 和 1 × 101 个细胞的小鼠（从左至右），成像于注射后约6小时进行。
图3. 定量分析 体内 指示细胞融合的发光现象 MSCs 被转染了 LoxP-Stop-LoxP-Luciferase 质粒，并递送至心肌组织 Cre表达Cre的小鼠。细胞移植后约一周和两周，使用Xenogen生物发光成像系统对Cre小鼠进行成像，以检测指示细胞融合的发光强度。（A）假手术组及小鼠1-4（从左至右）在细胞移植后17天的 photograph 与发光强度叠加图像。（B）假手术组及小鼠1-4（从左至右）在细胞移植后17天的发光强度图像。选取对应于注射部位的感兴趣区域（黄色），并使用ImageJ（免费软件）软件测定发光强度水平。20（C）所有实验条件下，发光强度均以假手术小鼠相同感兴趣区域的信号进行归一化处理。术后一周，小鼠3和小鼠4显示出阳性发光信号，提示小鼠自身细胞与移植的间充质干细胞（MSC）发生了自发融合。该信号在小鼠3术后两周仍持续存在。为确定对应于小鼠3的信号在体内的器官特异性定位，暴露胸腔并切除主要器官进行成像。（D）小鼠3的照片与发光强度叠加图。注意发光信号定位于小肠。（E）小鼠3的发光强度图。（F）假手术小鼠的照片与发光强度叠加图。（G）假手术小鼠的发光强度图。
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讨论
本文所述方法首次实现了在包括小型动物在内的生物体中对细胞融合进行离散识别和时间动态分析。该方法结合了Cre-LoxP重组系统与后续的生物光子成像分析。该技术不仅适用于追踪细胞-细胞融合，还可用于病毒-细胞融合的监测，因此在追踪病毒感染过程中可能具有重要应用价值。成像过程快速，可同时对多个小型动物进行成像。融合的检测灵敏度受限于特定细胞伙伴在其相应微环境中的融合频率，以及LoxP-Stop-LoxP-荧光素酶质粒的转染效率。因此，若融合伙伴细胞中已整合LoxP-Stop-LoxP-荧光素酶序列，则可获得最佳实验结果。此外，成像时生物体必须保持静止，因此对小型动物需使用麻醉。
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致谢
作者谨此感谢威斯康星大学麦迪逊分校医学系的 Peiman Hemmati 博士慷慨提供 H1 MSCs，以及威斯康星大学心血管生理学核心设施的 Tim Hacker 博士、Gouqing Song 博士和 Jill Koch 女士协助完成小鼠手术。本研究工作得到了美国国家科学基金会向 Brian Freeman 提供的研究生研究奖学金以及 NIH R21 HL089679 项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Neon 转染系统 | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon 100 μL 试剂盒 | Invitrogen | MPK10025 | 包含 R 缓冲液和 E 缓冲液 |
| a-MEM 粉末 | Invitrogen | 12000-022 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory | 006054 | |
| 胰蛋白酶 10X | Fisher Scientific | MT-25-054-Cl | |
| L-谷氨酰胺 | Fisher Scientific | 25030-081 | |
| D-荧光素 | Caliper Life Sciences | 122796 | |
| Xenogen 生物发光成像系统 | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| 非必需氨基酸 | Invitrogen | 11140-050 |
参考文献
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