一种用于在活体生物中随时间追踪细胞融合的方法。该方法利用 Cre-LoxP 通过细胞融合诱导荧光素酶表达的重组。所产生的发光信号可在活体生物中利用生物发光成像系统进行检测，其检测灵敏度为 ˜外周组织中的1,000个细胞。
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摘要
摘要
同一类型的两个或多个细胞具有相互融合的能力，这一特性在后生动物的进化过程中被广泛用于形成多种复杂器官，包括骨骼肌、骨组织和胎盘。近期研究表明，同类型细胞的融合能够赋予细胞更强的功能。例如，当胎盘中的滋养层细胞融合形成合体滋养层细胞时，合体滋养层相较于未融合的滋养层细胞，能更有效地在母胎屏障间转运营养物质和激素。1-4近期的研究表明，不同类型细胞的融合能够引导细胞命运的改变。过去认为，通过细胞融合实现的细胞命运“逆转”或重编程仅限于细胞培养系统。然而，随着干细胞移植技术的出现，我们及其他研究团队发现，干细胞能够与体细胞发生融合 体内 且该融合促进干细胞分化5-7因此，细胞融合是一种受调控的过程，能够促进细胞存活和分化，因而可能在发育、组织修复乃至疾病发病机制中具有核心重要性。
限制细胞融合研究的问题在于缺乏适当的技术：1）准确识别融合产物；2）长期追踪融合产物。本文提出一种新颖的方法，通过在融合发生时诱导生物发光，以克服上述两项局限图1）；生物发光可被高灵敏度地检测到 体内8-15. 我们使用一种编码萤火虫荧光素酶（Photinus pyralis) 基因置于由两侧包围的终止密码子附近 LoxP 序列 当表达该基因的细胞与表达 Cre 重组酶蛋白的细胞融合时， LoxP 位点被切割，终止信号被切除，从而允许荧光素酶的转录。 由于信号是可诱导的，因此假阳性信号的发生率非常低。与现有利用Cre/LoxP 系统16, 17我们引入了一种“活体”检测信号，从而首次提供了追踪细胞融合动力学过程的机会 体内.
为了展示该方法，将广泛表达Cre重组酶的小鼠作为受体，接受转染了携带荧光素酶报告基因构建体的干细胞，该构建体的荧光素酶表达位于floxed终止密码子的下游。 通过心肌内注射将干细胞移植，并在移植后进行活体成像分析，以随时间追踪心脏及周围组织中细胞融合产物的存在情况。该方法可适用于在发育、疾病或成体组织修复的任何阶段，分析任何组织类型中的细胞融合现象。
方案
1. 供体细胞转染
- 收获间充质干细胞（MSCs，源自H1胚胎干细胞，由Peiman Hematti博士惠赠； alternatively，任何假定会发生融合的任何物种的任何细胞类型） 体内 当细胞融合度达到70 - 80%时，使用1×胰蛋白酶（Mediatech，Manassas，VA）消化5分钟。 用不含抗生素的α-MEM完全培养基（Invitrogen，Carlsbad CA）灭活胰蛋白酶18离心，300 × g，5 分钟。
- 小心吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL 1×PBS中，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 转移 1.5 × 106 将细胞转移至1.5 mL离心管中，300 × g离心5分钟。
- 小心吸除上清液。将沉淀重悬于 300 μL Neon 转染系统（Invitrogen）的 R 缓冲液 6 μg (2 μg / 5.0 × 105 将p231 pCMVe-betaAc-STOP-luc（Addgene，美国马萨诸塞州剑桥市）质粒转染至细胞中。按照制造商说明书（Neon转染系统，Invitrogen），向电穿孔对接孔中加入3 mL E缓冲液（Invitrogen）。
- 将细胞-质粒溶液转移至 100 μL 使用Neon移液器吸头，以20 ms脉冲时长和1500伏电压进行电穿孔。将电穿孔后的细胞加入含有9....
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讨论
本文所述方法首次实现了在包括小型动物在内的生物体中对细胞融合进行离散识别和时间动态分析。该方法结合了Cre-LoxP重组系统与后续的生物光子成像分析。该技术不仅适用于追踪细胞-细胞融合，还可用于病毒-细胞融合的监测，因此在追踪病毒感染过程中可能具有重要应用价值。成像过程快速，可同时对多个小型动物进行成像。融合的检测灵敏度受限于特定细胞伙伴在其相应微环境中的融合频率，以及LoxP-Stop-LoxP-荧光素酶质粒的转染效率。因此，若融合伙伴细胞中已整合LoxP-Stop-LoxP-荧光素酶序列，则可获得最佳实验结果。此外，成像时生物体必须保持静止，因此对小型动物需使用麻醉。
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致谢
作者谨此感谢威斯康星大学麦迪逊分校医学系的 Peiman Hemmati 博士慷慨提供 H1 MSCs，以及威斯康星大学心血管生理学核心设施的 Tim Hacker 博士、Gouqing Song 博士和 Jill Koch 女士协助完成小鼠手术。本研究工作得到了美国国家科学基金会向 Brian Freeman 提供的研究生研究奖学金以及 NIH R21 HL089679 项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Neon 转染系统 | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon 100 μL 试剂盒 | Invitrogen | MPK10025 | 包含 R 缓冲液和 E 缓冲液 |
| a-MEM 粉末 | Invitrogen | 12000-022 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory | 006054 | |
| 胰蛋白酶 10X | Fisher Scientific | MT-25-054-Cl | |
| L-谷氨酰胺 | Fisher Scientific | 25030-081 | |
| D-荧光素 | Caliper Life Sciences | 122796 | |
| Xenogen 生物发光成像系统 | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| 非必需氨基酸 | Invitrogen | 11140-050 |
参考文献
- Bernirschke, K. K. P. Pathology of the Human Placenta. , Springer. New York. (2000).
- Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol.
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