方法文章

通过13C标记的蛋白质源性氨基酸进行代谢通路的验证与发现

DOI：

10.3791/3583

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2012年1月26日

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1Department of Energy, Environmental and Chemical Engineering, Washington University, 2Department of Biology, Washington University, 3Department of Energy, Environmental and Chemical Engineering and Department of Biology, Washington University

本文内容

摘要

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13C-同位素标记是一种用于确定多种微生物细胞中心代谢的有效技术。在使用特定标记底物培养细胞后，通过GC-MS检测可基于蛋白质源性氨基酸中的独特标记模式，揭示功能性的代谢通路。

摘要

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微生物具有复杂的代谢途径，可通过生物化学和功能基因组学方法进行研究。研究细胞中心代谢并发现新酶的一种重要技术是 13C标记辅助的代谢分析 1. 该技术基于同位素标记，即通过向微生物提供含有 13C标记的底物。通过追踪生化网络中代谢物之间的原子转移路径，我们可以确定功能通路并发现新的酶。

作为转录组学和蛋白质组学的补充方法，同位素异构体辅助代谢通路分析包含三个主要步骤 2. 首先，我们用以下条件培养细胞 13C标记的底物。在这一步骤中，培养基的组成和标记底物的选择是两个关键因素。为了避免营养补充物中非标记碳带来的测量噪声，需要使用仅含单一碳源的最低培养基。此外，标记底物的选择取决于其对所分析代谢途径的解析效果。由于新酶通常涉及不同的反应立体化学或中间产物，因此一般来说，单一位点标记的碳底物在检测新代谢途径时比均匀标记的底物提供更丰富的信息3, 4. 第二我们采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析氨基酸的同位素标记模式。氨基酸在蛋白质中含量丰富，因此可通过生物量水解获得。在进行气相色谱分离前，氨基酸可经N-(叔丁基二甲基硅基)-N-甲基三氟乙酰胺（TBDMS）衍生化。TBDMS衍生化的氨基酸在质谱中可发生断裂，产生不同的碎片离子阵列。根据断裂与未断裂氨基酸的质荷比（m/z），我们可以推断出作为氨基酸前体的中心代谢物可能的标记模式。 第三我们追踪了所提出途径中13C碳的转化，并根据同位素异构体数据确认这些途径是否具有活性 2氨基酸的测定可提供中心代谢中八种关键前体代谢物的同位素标记信息。这些代谢关键节点能够反映相关中心代谢途径的功能。

13C辅助的代谢分析通过蛋白质源性氨基酸可广泛用于对尚未充分表征的微生物代谢进行功能表征1。在本方案中，我们将以集胞藻51142（Cyanothece 51142）作为模式菌株，演示如何利用标记碳底物来发现新的酶功能。

方案

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1. 细胞培养（图1）

  1. 在含有微量元素、盐类、维生素以及特异性标记碳源的最小培养基中培养细胞，所选碳源应最适合代谢通路研究。可使用摇瓶或生物反应器进行细胞培养。有机营养物质（如酵母提取物）可能干扰氨基酸标记的检测，因此不能存在于培养基中。
  2. 使用紫外-可见分光光度计在最佳波长下（例如，Cyanothece 51142 使用 OD730）测定培养液的光密度，以监测细胞生长情况。
  3. 可先将细胞在非标记培养基中预培养。选择对数生长中期的细胞用于接种（接种体积比为 3% (v/v)）标记培养基。标记培养物应以相同标记培养基进行传代培养（接种体积比为 3% v/v），以避免初始接种物引入非标记碳源。

2. 氨基酸提取

  1. 通过离心（10 分钟，8000×g）收集处于对数生长中期的继代培养细胞（10 mL）。
  2. 将沉淀重悬于 1.5 mL 6 M HCl 中，并转移至透明玻璃螺口 GC 小瓶。盖紧瓶盖，置于 100°C 烤箱中加热 24 小时，以将生物量中的蛋白质水解为氨基酸。生物量沉淀的水解可产生 20 种常见氨基酸中的 16 种（图 2）5。其中，半胱氨酸和色氨酸会被降解，谷氨酰胺和天冬酰胺则分别转化为谷氨酸和天冬氨酸。
  3. 将氨基酸溶液在 2 mL Eppendorf 管中以 20,000×g ....

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讨论

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本方案包括向细胞提供标记底物，并通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）检测氨基酸中产生的同位素标记模式。由于质谱数据（m/z 比值）仅能提供质谱离子整体标记程度的信息，因此我们需要通过分析未断裂离子（M-57）的 m/z 比值来评估氨基酸的同位素异构体分布+ 以及断裂的氨基酸（即 (M-159)+ 和 (f302)+）。此外，我们可以使用化学成分相同的培养基但标记模式不同的底物进行多种细胞培养（1st 位置标记，2nd 位置标记等信息。这些实验中获得的代谢物标记信息可被整合，以解析中心代谢途径中的实际碳原子转移路径。

在通路分析中，标记底物的选择至关重要。通常，当13C通过中心代谢通路传递时，单一位点标记的碳底物更易于追踪标记碳的去向，而多位点碳标记的底物则可能使碳流追踪变得复杂。此外，与均匀标记的底物相比，单一位点标记的底物在解析代谢物中独特分子结构方面更具信息价值。4  例如，(Re)-型柠檬酸合酶与.......

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披露

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未声明任何利益冲突。

致谢

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本研究得到了美国国家科学基金会职业奖（MCB0954016）和美国能源部生物能源研究奖（DEFG0208ER64694）的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
TBDMSSigma-Aldrich19915-
THFSigma-Aldrich34865-
标记碳底物Cambridge Isotope Laboratories根据实验需求而定网站：http://www.isotope.com
气相色谱仪Agilent TechnologiesHewlett-Packard，型号 7890A-
GC 柱J&W ScientificDB5 (30 m)-
质谱仪Agilent Technologies5975C-
Reacti-Vap 浓缩仪Thermo Fisher Scientific, Inc.TS-18825用于干燥氨基酸样品

参考文献

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  1. Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
  2. Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev

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标签

13C Cyanothece 51142 TBDMS

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