使用延时视频显微镜对细胞随机迁移进行定量分析

摘要

该方法可实现对细胞的实时监测，并对细胞迁移的不同参数（如速度、位移和速率）进行定量测量。与传统方法不同，这种实时方法并非基于终点定量迁移测量，而是能够连续监测并计算各种参数。

摘要

细胞迁移是一个动态过程，在胚胎发育、组织修复、免疫系统功能以及肿瘤侵袭中具有重要作用^{1, 2}。在定向迁移过程中，细胞会快速移动，以响应细胞外的趋化信号，或响应由基本运动机制提供的内在信号³。当细胞的内在方向性较弱时，会发生随机迁移，使细胞能够探索其局部环境。

细胞迁移是一个复杂的过程，在初始反应中，细胞会发生极化，并向迁移方向伸出突起²。传统的迁移检测方法，如Boyden小室迁移实验，是一种在体外（in vitro）测量趋化性的简便方法，可用来测定迁移的终点结果。然而，该方法既无法测量单个迁移参数，也无法观察细胞在迁移过程中发生的形态学变化。

在此，我们介绍一种利用视频-时间推移显微镜实时监测细胞迁移的方法。由于细胞迁移与侵袭是癌症的标志性特征，该方法可广泛应用于癌症细胞迁移与侵袭的研究。 体外血小板的随机迁移被认为是血小板功能的参数之一 ⁴，因此该方法也可用于研究血小板功能。该检测方法具有快速、可靠、可重复的优点，且无需优化细胞数量。为维持细胞的生理适宜条件，显微镜配备有CO₂₂ 供液与温度恒温系统。通过显微镜连接的相机定期拍摄图像以监测细胞运动。利用Slidebook软件计算平均速度和平均位移，从而分析细胞迁移。

方案

1. 胶原蛋白包被板的制备

1. 用 Opti-Mem 培养基将胶原蛋白稀释至终浓度为 10 μg/ml。
2. 向每个孔中加入 1.5 ml 步骤 1 所得溶液，对 6 孔板进行胶原包被。于 4 °C 孵育过夜。
3. 次日，用 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤板 2 次，并将板保存在 PBS 中。

2. 细胞准备及在6孔板上的接种

注意：使用温热的培养基和 PBS 以确保细胞运动的最佳条件

1. 在含有10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中稀疏培养MDA-MB-231（一种侵袭性乳腺癌细胞系）。本示例中使用MDA-MB-231细胞，但该方法适用于任何贴壁的癌性和非癌性细胞系。
2. 用预热的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，并通过胰酶消化收集细胞。在显微镜下检查细胞，确保胰酶处理已使细胞充分脱离。
3. 加入含10% FBS的DMEM培养基终止消化，轻轻离心（1000 ×g，5分钟）收集细胞。轻柔地将细胞沉淀重悬于含10% FBS的DMEM培养基中。
4. 通过轻柔吹打使细胞沉淀充分分散。应尽可能将细胞团块解离为单个细胞。
5. 计数细胞，并用含10% FBS的DMEM培养基稀释至终浓度为50,000 个细胞/ml。每孔加....

讨论

实时随机迁移实验能够准确、灵敏地分析细胞迁移参数，例如速度和位移。该方法不受终点测量值的限制，因此更具定量性。由于细胞在含血清的正常DMEM培养基中进行监测，从而减少了在无血清培养基中长时间孵育带来的不利影响。已有研究表明，细胞迁移依赖于细胞与基质之间接触的形成和解离⁸，因此该方法可用于研究不同基质对细胞迁移的影响。

其中一个关键步骤是将温度精确控制在37°C，并将CO₂维持在5%，以确保最佳的细胞迁移效果。该实验允许灵活选择所需的时间点来监测迁移反应；然而，可能需要优化时间点的数量。例如，迁移速率较低的细胞可能需要比迁移速率较高的细胞更长的监测时间。

肿瘤微环境是致癌过程中的关键因素之一。癌症的发生源于肿瘤细胞与周围细胞（如内皮细胞、间质细胞和炎性细胞）之间的相互作用⁹。该实验方法可进行改进，用于研究肿瘤细胞的迁移如何受到微环境的影响。其中一种实现方式是，研究在不同细胞混合群体（如间质细胞和内皮细胞）中培养的荧光标记肿瘤细胞的迁移行为。该方法还可用于实时观.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	赛默飞世尔科技公司	SH30243.01
FBS	健明生物制品	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
胶原蛋白	BD Biosciences	354231
配备活细胞培养室的显微镜 &和自动XY轴载物台控制器	Olympus Corporation	Olympus 1X81
环境控制箱	纽厄	新型活细胞培养室	我们的设备配备了一个定制的矩形玻璃板顶盖，可实现通过腔室顶部的适当光学观测。矩形形状可兼容我们在许多实验中使用的多孔板。
自动XY载物台	Prior Scientific	先前的 Proscan	这使得在延时显微镜观察期间能够精确返回多个选定的XY位置。
相机		滨松EM相机C9100
软件	通常通过显微镜供应商（如 Olympus）购买	幻灯片手册 5