随机使用时移视频显微镜细胞迁移的定量分析

Summary

这种方法允许在不同的细胞迁移参数，如速度，位移和速度的实时性和定量测量细胞的监测。实时方式与传统方法不同的是，这不是基于端点的定量迁移测量;相反，它允许不同的参数，不断监测和计算。

Abstract

细胞迁移是一个动态的过程，这是非常重要的胚胎发育，组织修复，免疫系统的功能，与肿瘤的侵袭^1，2。在定向迁移，细胞外趋化信号的响应，或响应内在线索³的基本动力机械提供快速移动。随机迁移发生时，细胞具有低固有的方向性，使细胞探索当地环境。

细胞迁移是一个复杂的过程，在最初的反应细胞，经过极化和中迁移的方向延伸的突起。传统的方法来衡量，如Boyden小室迁移实验迁移是一个简单的方法来衡量在体外 ，从而使一个终点的结果作为衡量迁移的趋化。不过，这种做法既不允许个体迁移参数的测量，也不允许到visualization的细胞在迁移过程中经历的形态学变化。

在这里，我们提出了一种方法，使我们能够监测细胞迁移，在实际使用视频时间 - 时间的推移显微镜。由于细胞迁移和侵袭癌的标志，这种方法适用于研究癌症细胞迁移和体外侵袭。随机迁移的血小板已考虑为血小板功能的⁴参数之一，因此这种方法也可以是血小板功能的研究很有帮助。此法的优点是快速，可靠，重现性好，不需要手机号码的优化。为了维持细胞生理适当的条件下，在显微镜配备CO ₂供应和温控器。细胞的运动进行监测使用安装在显微镜定期相机拍照。细胞迁移可以通过测量平均时速和计算verage位移，这是由Slidebook软件计算。

Protocol

1。胶原涂层板的制备

1. 胶原蛋白稀释到终浓度为10微克/毫升的Opti-MEM媒体。
2. 大衣胶原的6孔板，从第1步，每孔加入1.5毫升。孵育过夜在4°C
3. 翌日，1X磷酸的2倍缓冲液（PBS）洗板，将它们存储在PBS。

2。在6孔板细胞的制备及幼苗

注:用温水媒体和PBS，以确保细胞运动的最佳条件

1. 成长的MDA-MB-231（浸润性乳腺癌细胞株）在杜尔贝科的改良Eagle培养基（DMEM培养基），10％胎牛血清（FBS），人口稀少。在这个例子中，我们使用的MDA-MB-231，然而，这种方法可以应用到任何附着的癌变和非癌变细胞株。
2. 温暖1X PBS洗涤细胞两次和收集由胰蛋白酶。检查细胞在显微镜下，使苏重新正确胰蛋白酶处理细胞分离。
3. 收集细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，轻轻地旋转5分钟，在1000Ğ细胞。重悬于含10％胎牛血清的DMEM培养基中的细胞沉淀轻轻。
4. 移液器上下轻轻打破细胞沉淀。重要的是尽可能地分解成单个细胞的细胞团。
5. 计数细胞，并与10％胎牛血清的DMEM培养基50,000个细胞/毫升的终浓度稀释。免除2毫升到每口井。
6. 板在37°C，在组织文化的孵化器孵育过夜，直到出发的时间推移显微镜。

Discussion

实时随机的移民法能够准确，灵敏的细胞迁移的参数，如速度和位移分析。此方法不仅限于结束点的测量值，因此它是更多的量化。由于细胞在正常培养液血清培养基监测，它减少了有害影响较长的潜伏期在无血清媒体。它已被证明的格式和基质^8，因此，这种方法可以用来研究不同基质对移民的影响，打破了细胞接触依赖的细胞迁移。

的关键步骤之一，包括适当的控制温度为37°C和5％的CO _2，以确保最佳迁移。该法允许灵活性，以监视迁徙反应所需的时间点，但是，它可能需要优化的时间点。例如，一些细胞迁移率较低，可能要为劳监测nger时间相比，细胞具有较高的迁移率。

肿瘤微环境是致癌的重要因素之一。从癌肿瘤细胞周围的细胞，如内皮细胞，间质炎性细胞和⁹互动结果。此法可进行修改，以研究如何对肿瘤细胞迁移的微环境的影响。它可以实现的方式之一是通过研究荧光标记的肿瘤细胞生长在不同的细胞，如气孔和内皮细胞混合的人口迁移。这种方法还可以用于研究实时伤口愈合。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
DMEM培养液	Thermo Scientific的	SH30243.01
胎牛血清	双子座生物产品	100-106
OPTI-MEM	Invitrogen公司	31985-070
胶原	屋宇署	354231
显微镜与活细胞室及自动XY平台控制器	奥林巴斯	奥林巴斯1X81
环境控制腔	NEUE	NEUE活细胞商会	我们已通过适当的光学腔的顶部建立一个自定义的矩形玻璃板的顶部。长方形容纳许多在我们的实验中使用的多孔板TS。
自动XY平台	预先	在此之前Proscan	这允许乘以选定的XY位置，在时间的推移显微镜精确的回报。
相机		滨松电磁相机C9100
软件	通常购买厂商，如奥林巴斯显微镜	幻灯片书5