使用延时视频显微镜对细胞随机迁移进行定量分析

摘要

该方法可实现对细胞的实时监测，并对细胞迁移的不同参数（如速度、位移和速率）进行定量测量。与传统方法不同，这种实时方法并非基于终点定量迁移测量，而是能够连续监测并计算各种参数。

摘要

细胞迁移是一个动态过程，在胚胎发育、组织修复、免疫系统功能以及肿瘤侵袭中具有重要作用^{1, 2}。在定向迁移过程中，细胞会快速移动，以响应细胞外的趋化信号，或响应由基本运动机制提供的内在信号³。当细胞的内在方向性较弱时，会发生随机迁移，使细胞能够探索其局部环境。

细胞迁移是一个复杂的过程，在初始反应中，细胞会发生极化，并向迁移方向伸出突起²。传统的迁移检测方法，如Boyden小室迁移实验，是一种在体外（in vitro）测量趋化性的简便方法，可用来测定迁移的终点结果。然而，该方法既无法测量单个迁移参数，也无法观察细胞在迁移过程中发生的形态学变化。

在此，我们介绍一种利用视频-时间推移显微镜实时监测细胞迁移的方法。由于细胞迁移与侵袭是癌症的标志性特征，该方法可广泛应用于癌症细胞迁移与侵袭的研究。 体外血小板的随机迁移被认为是血小板功能的参数之一 ⁴，因此该方法也可用于研究血小板功能。该检测方法具有快速、可靠、可重复的优点，且无需优化细胞数量。为维持细胞的生理适宜条件，显微镜配备有CO₂₂ 供液与温度恒温系统。通过显微镜连接的相机定期拍摄图像以监测细胞运动。利用Slidebook软件计算平均速度和平均位移，从而分析细胞迁移。

方案

1. 胶原蛋白包被板的制备

1. 用 Opti-Mem 培养基将胶原蛋白稀释至终浓度为 10 μg/ml。
2. 向每个孔中加入 1.5 ml 步骤 1 所得溶液，对 6 孔板进行胶原包被。于 4 °C 孵育过夜。
3. 次日，用 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤板 2 次，并将板保存在 PBS 中。

2. 细胞准备及在6孔板上的接种

注意：使用温热的培养基和 PBS 以确保细胞运动的最佳条件

1. 在含有10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中稀疏培养MDA-MB-231（一种侵袭性乳腺癌细胞系）。本示例中使用MDA-MB-231细胞，但该方法适用于任何贴壁的癌性和非癌性细胞系。
2. 用预热的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，并通过胰酶消化收集细胞。在显微镜下检查细胞，确保胰酶处理已使细胞充分脱离。
3. 加入含10% FBS的DMEM培养基终止消化，轻轻离心（1000 ×g，5分钟）收集细胞。轻柔地将细胞沉淀重悬于含10% FBS的DMEM培养基中。
4. 通过轻柔吹打使细胞沉淀充分分散。应尽可能将细胞团块解离为单个细胞。
5. 计数细胞，并用含10% FBS的DMEM培养基稀释至终浓度为50,000 个细胞/ml。每孔加入2 ml细胞悬液。
6. 将培养板置于37 °C细胞培养箱中孵育过夜，直至开始进行活细胞延时显微成像。
7. 为确保细胞迁移有足够的空间，使用移液枪头划线制造伤口，用1×PBS洗涤培养板以去除划伤产生的碎片，然后加入含10% FBS的DMEM培养基。在显微镜下检查是否有漂浮细胞。若漂浮细胞较多，应重复洗涤步骤。此时，培养板已准备好用于显微镜下的图像采集。

3. 显微镜设置与自动图像采集

有多种成像软件可用于控制显微镜以实现自动图像采集。本文中，我们使用 Slidebook 5.0 成像软件，在 Olympus 显微镜（Olympus IX81）上进行自动采集，该系统配备 EM-Hamamatsu C9100 相机，非常适合对采集速度和光毒性要求极低的活细胞实验。系统包含一个载物台顶部环境控制培养室（Neue Live Cell）和一个自动 XY 载物台控制器（Prior Proscan）。图像使用 10X UPLANFL Ph1/0.30 物镜在明场模式下采集，并设定固定的时间间隔。以下方案描述了图像采集过程。

1. 打开显微镜、相机和活细胞成像装置。将培养板放置在显微镜载物台上。用 Neue Live Cell 环境控制腔室覆盖培养板，该腔室连接有 CO₂ 供气系统和温度传感器。将恒温器设定为 37°C，CO₂ 浓度设定为 5%。
2. SlideBook 软件支持全自动物镜选择、波长选择，并可轻松在荧光与明场成像技术之间切换。为设置不同的焦距控制参数，请打开 SlideBook 软件 > 进入菜单栏 > 点击选择“焦距控制”> ，然后选择以下参数：
   1. 在“物镜”框中，通过下拉窗口选择物镜以定义物镜类型。请注意，我们使用的是相差物镜，并已手动在聚光镜中选择相应的相差环。如果使用配备自动聚光镜的系统，该设置将通过软件程序自动完成。或者，若物镜转盘和聚光镜均非自动化，则需手动分别选择。
   2. 在“滤光片组”框中：
      1. 从下拉框中选择设置，以将光路导向目镜或相机（在本系统中，“Live”对应目镜，“Widefield”对应相机），查看可用的滤光片。
      2. 选择适用于明场照明的滤光片（在本系统中，该选项标记为“DIC”，表示明场光路的开放位置）。
      3. 点击“Open Bright”以打开明场快门，选择光源。
3. 若需通过目镜观察样品，请在转盘上选择明场滤光片（在本系统中为位置“6”）。首先通过目镜初步观察样品，找到合适的视野并将样品调至清晰（步骤 3.2.1 至 3.2.2.3）。随后移动滤光片转盘，将光路切换至相机以进行图像采集（在本系统中为位置“1”）。
4. 自动载物台允许选择不同的 XY 坐标，以便在图像采集过程中捕获多个感兴趣区域。在 SlideBook 软件中，进入焦距控制，选择“XY”，通过目镜选择不同位置，然后点击“set point”锁定每个位置以进行图像采集（图 1）。
5. 精细调节屏幕上显示的相机图像的焦距。可通过显微镜的手动控制旋钮或计算机控制完成，后者可实现更精细的焦距调节。
6. 使用 “焦距控制” 窗口中的控件调节载物台的 z 轴位置。为获得最佳效果，应聚焦于靠近培养板接触面的平坦细胞突起。
7. 为辅助聚焦，可使用滑块调节曝光时间，使其处于适合聚焦的合理范围内。若已选择多个 XY 位置，则需对每个单独位置进行焦距调节：在焦距控制 > XY > visit point 中操作。注意：此步骤旨在确保各视野均正确聚焦，以获得最佳静态图像。
8. 使用软件设置图像采集窗口参数。在 SlideBook 中，通过菜单栏选择 打开采集界面。参见 图 2。然后检查以下参数：
   1. 检查采集类型 > 设为时间序列（time lapse）。
   2. 检查滤光片组：宽场（Wide field）：DIC（用于明场图像）。
   3. “时间序列采集”指将要采集的时间点数量（可根据细胞类型变化）。持续时间指实验的总时长。时间单位（毫秒（ms）、秒（s）、分钟（m）或小时（h））可从下拉菜单中选择。
   4. “时间间隔”指一个时间点开始到下一个时间点开始之间的延迟。输入其中任意两个值后，第三个字段将自动计算。
   5. 多点 XY 采集：若需采集超过一个 XY 位置，请选择“multipoint list”。
   6. 为文件命名。在本示例中，我们将其命名为“231”。
9. 为避免因采集大量图像导致计算机意外关机，建议使用“spool 选项”保存文件。此选项为可选，但强烈推荐。具体操作为：在采集 控制 > 选择高级（Advanced） > Spool > 采集至内存，并在每个时间点后保存至 spool 文件。浏览并选择保存 SlideBook 文件的位置（图 3）。生成的视频文件之后可从指定位置导入。显微镜设置步骤已汇总于 文件 3.1 中。

4. 迁移图像处理与分析：速度与位移的计算

在此示例中，图像处理由 SlideBook^{5, 6} 5.0 软件完成。还有多种其他程序可用于图像处理与分析，例如 ImageJ⁷。

1. 导入在不同时间点拍摄的不同视野的 SlideBook 文件。转到菜单栏> 图像> 导入>Slide book spool>选择所需文件（图 4a）。
2. 此处我们的目标是追踪单个细胞的运动。可通过自动追踪或手动追踪实现。在本示例中，我们采用手动追踪，因为这有助于更简便地排除伪影，而自动追踪则较难做到这一点。
3. 打开需要进行追踪的 SlideBook 文件。在菜单中：选择 Mask > Particle Tracking Protocol > Manual Particle Tracking Protocol（图 4b）。将弹出一个窗口，显示起始和结束时间点（图 4c）。
4. 通过点击每个细胞（细胞核）的中心开始追踪单个细胞的运动。从每段视频中追踪约 10 个细胞，并从不同位置至少选择三段不同的视频，以便从一次实验中分析约 30 个细胞。每项实验应重复三次。为确保无偏性，应从不同位置选择细胞，例如前部、中部、角落等区域的细胞。完成追踪后点击“OK”。
5. 可通过测量速度、速率或位移等参数的变化来分析随机迁移。为分析数据，请在菜单中> 选择 mask > particle tracking>particle tracking protocol。按以下说明选择追踪参数（图 5a）：
   1. Track with - 从下拉列表中选择您希望追踪的参数。在本示例中，我们使用了 Center of Area（对象中心的坐标）。
   2. 点击“track and continue”。追踪完成后，系统将自动进入下一步。
6. 选择每条轨迹所需的统计参数，例如位移和平均速度（见 图 5b）：
   1. 平均速度 - 总移动距离除以移动该距离所需的时间。
   2. 总位移 - 对象移动的总距离。
   3. 若要进入下一步，请点击“Calculate and Continue”；若仅需查看统计结果而不进入下一步，则选择“Calculate”。系统将生成一个文件，可将其保存为文本文件，并后续导出至 Excel。
7. 若要使用自动追踪协议追踪对象，首先需创建一个 Mask。
   1. 选择 Mask > Segment Image> 将出现分割窗口 > 调整至达到阈值，使各对象彼此分离 > 点击应用 > 确定（见 图 5c）。第 4.5.1 步与此相同。
   2. 移除小于 的对象 - 勾选此框，以选择性移除小于指定尺寸的对象。在编辑框中输入尺寸，并选择单位为微米或像素。此操作用于去除常由碎片引起的伪影。
   3. 最小移动 - 输入确定一条轨迹所需追踪的最少时间点数。
   4. 最大移动 - 输入任一对象在相邻时间点之间预期的最大移动距离。
   5. 数据分析步骤与手动追踪相同（参见步骤 4.5.2 至 4.6.2）。

5. 代表性结果

以速度和位移为量化指标的随机迁移分析示例（图6）。将文件导出至 Excel 后，使用箱形图（box and whiskers plot）绘制数据。采用 Mann-Whitney 检验对实验组与对照组之间的总位移和平均速度进行统计学比较。实验组的平均速度较对照组有所增加。实验组的总位移较对照组有所增加。

对照组与实验组的活细胞成像：将对照组 MDA-MB-231 细胞和实验组 MDA-MB-231 细胞接种于胶原蛋白包被的培养皿中，过夜培养。使用配备 EM-Hamamatsu 相机的 Olympus 显微镜进行延时视频显微观察。在细胞随机迁移过程中，每隔 1 小时采集一次图像，共持续 18 小时。请参见对照样本和实验样本随机迁移的视频 1和视频 2。

显微镜设置：

图 1. 设置多个图像采集点。

图 2. 采集控制操作步骤示意图。 点击此处查看高清大图。

图3. 如何保存多张图像。

迁移的图像处理与分析

图 4a. 导入图像进行数据分析的步骤。

图 4b. 使用颗粒追踪方案分析数据的步骤。

图 4c. 显示被追踪粒子路径长度的窗口。

数据分析步骤。

图5a. 粒子示踪分析流程参数的步骤示意图。

图 5b. 待分析路径统计参数的选择。

图 5c. 创建掩膜以实现自动追踪流程的步骤。

图 6. 平均速度（图 6a）和位移（图 6b）以须线图形式展示。与对照组相比，测试样本的速度和位移均有所增加。

视频

视频 1. 对照细胞的迁移。 点击此处观看视频。

视频 2. 测试细胞的迁移。 点击此处观看视频。

将对照组 MDA-MB-231 细胞和实验组 MDA-MB-231 细胞稀疏接种于胶原蛋白包被的培养皿中，过夜培养。使用配备 EM-Hamamatsu 相机的 Olympus 显微镜进行延时视频显微观察。在随机迁移过程中，每隔 1 小时拍摄一次图像，持续 18 小时。请参见对照组和实验组随机迁移的动态视频。

讨论

实时随机迁移实验能够准确、灵敏地分析细胞迁移参数，例如速度和位移。该方法不受终点测量值的限制，因此更具定量性。由于细胞在含血清的正常DMEM培养基中进行监测，从而减少了在无血清培养基中长时间孵育带来的不利影响。已有研究表明，细胞迁移依赖于细胞与基质之间接触的形成和解离⁸，因此该方法可用于研究不同基质对细胞迁移的影响。

其中一个关键步骤是将温度精确控制在37°C，并将CO₂维持在5%，以确保最佳的细胞迁移效果。该实验允许灵活选择所需的时间点来监测迁移反应；然而，可能需要优化时间点的数量。例如，迁移速率较低的细胞可能需要比迁移速率较高的细胞更长的监测时间。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	赛默飞世尔科技公司	SH30243.01
FBS	健明生物制品	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
胶原蛋白	BD Biosciences	354231
配备活细胞培养室的显微镜 &和自动XY轴载物台控制器	Olympus Corporation	Olympus 1X81
环境控制箱	纽厄	新型活细胞培养室	我们的设备配备了一个定制的矩形玻璃板顶盖，可实现通过腔室顶部的适当光学观测。矩形形状可兼容我们在许多实验中使用的多孔板。
自动XY载物台	Prior Scientific	先前的 Proscan	这使得在延时显微镜观察期间能够精确返回多个选定的XY位置。
相机		滨松EM相机C9100
软件	通常通过显微镜供应商（如 Olympus）购买	幻灯片手册 5