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方法文章

一种新型合成的7-去氧水仙环素C-1类似物联合他莫昔芬增强人乳腺腺癌和神经母细胞瘤细胞的凋亡与自噬诱导

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DOI：

10.3791/3586

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2012年5月30日

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 2Chemistry Department and Centre for Biotechnology, Brock University

本文内容

摘要

我们合成了一个与天然 pancratistatin 具有相当抗肿瘤活性的新型类似物；有趣的是，JCTH-4 与他莫昔芬联合治疗可显著增强线粒体靶向诱导的细胞凋亡和自噬，同时对非癌变成纤维细胞影响极小。因此，JCTH-4 与他莫昔芬联用可能提供一种安全的抗癌治疗方案。

摘要

乳腺癌是北美女性中最常见的癌症之一。目前许多抗癌疗法，包括电离辐射，均通过DNA损伤诱导细胞凋亡。然而，这类疗法对癌细胞缺乏选择性，对正常细胞也会产生类似的毒性。我们已报道天然化合物平颅菌素（pancratistatin, PST）可选择性地诱导癌细胞凋亡。最近，一种新型PST类似物——7-去氧平颅菌素的C-1乙酰氧甲基衍生物（JCTH-4）通过从头合成获得，其在多种癌细胞系中表现出与PST相当的选择性诱导凋亡活性。近年来，自噬在恶性肿瘤中被发现具有双重作用，既可作为化疗应答中的促存活机制，也可作为促死亡机制。他莫昔芬（Tamoxifen, TAM）在多种癌症中始终表现出诱导促存活自噬的作用。本研究评估了JCTH-4单独使用以及与TAM联合使用在人乳腺癌（MCF7）和神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞中诱导细胞死亡的效力。单独使用TAM可诱导自噬，但几乎不引起细胞死亡；而单独使用JCTH-4则显著诱导凋亡，并伴随一定程度的自噬诱导。有趣的是，联合治疗显著增强了凋亡和自噬的诱导作用。我们利用延时显微镜监测了MCF7细胞在TAM诱导自噬、JCTH-4诱导凋亡与自噬，以及联合治疗加速细胞死亡过程中的时间依赖性形态学变化。我们已证实这些化合物通过靶向线粒体在这些癌细胞中诱导凋亡/自噬。重要的是，这些处理对非癌性人成纤维细胞的存活无影响。因此，这些结果表明，JCTH-4与TAM联合使用可作为针对乳腺癌和神经母细胞瘤细胞的一种安全且高效的抗癌疗法。

方案

引言

细胞凋亡，即I型程序性细胞死亡，是一种生理过程，可通过死亡配体与死亡受体结合的外源途径或内源途径发挥作用。细胞凋亡的内源途径由细胞内应激（如DNA损伤和线粒体功能障碍）启动；最终导致线粒体通透性增加、线粒体膜电位（MMP）消散、促凋亡因子从线粒体膜间隙释放，以及随后细胞凋亡的执行1。

自噬是一种细胞在维持质膜完整性的前提下，对自身细胞内组分进行断裂、降解和再循环的过程；该过程可由多种类型的细胞应激触发，包括氧化应激、缺氧、蛋白质聚集体、营养缺乏、生长因子缺乏以及受损细胞器2。在该过程的初始阶段，细胞质成分被自噬体（一种双层膜囊泡）包裹，随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体。溶酶体融合后，先前被自噬体摄取的细胞质成分被溶酶体酶降解2。该通路的广泛激活会导致细胞内组分的大规模降解，进而可能引发自噬性细胞死亡，即II型程序性细胞死亡3。

逃避免疫介导的细胞死亡被认为是癌症的标志性特征之一4。癌症是一种以细胞不受控制地生长和增殖为特征的疾病5。特别是，神经母细胞瘤起源于神经嵴来源的交感神经系统发育中的神经细胞6。它是儿童中最常见的实体瘤，约占所有儿童癌症的9%7。尽管迄今为止已取得诸多进展，但该疾病对基础科研人员和临床医生而言仍具挑战性。另一方面，乳腺癌是女性中最常见的癌症8。他莫昔芬（TAM）作为雌激素受体（ER）拮抗剂，常用于激素反应性乳腺癌的治疗9。然而，其他研究也提供了证据，表明TAM还可通过独立机制诱导细胞凋亡。特别是，TAM可在黄素单核苷酸（FMN）位点与线粒体呼吸链（MRC）复合物I相互作用10。

PST 是一种从 Hymenocallis littoralis 植物中分离得到的天然化合物。与目前使用的许多化疗药物不同，PST 已被证明可通过靶向线粒体，以非基因毒性的方式选择性诱导多种癌细胞类型的凋亡11-15。然而，由于其来源受限，临床前和临床研究进展受到阻碍：该化合物在其天然来源中含量极低，且其化学合成存在诸多困难。我们合成了 7-去氧 pancratistatin 的一系列类似物并进行筛选，发现其中一种 C-1 乙酰氧甲基衍生物 JC-TH-乙酸酯-4（JCTH-4）具有类似的抗癌活性16。目前我们已获得一种具有强效抗癌活性的合成 PST 类似物，其合成工艺已实现标准化，并可放大生产，足以满足临床前和临床研究所需的数量。由于天然 PST 和 TAM 均靶向线粒体，因此研究 PST 的合成类似物与 TAM 联合应用对人乳腺癌细胞和神经母细胞瘤细胞的共同作用将具有重要意义。

本文报道了JCTH-4在人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）和乳腺腺癌（MCF7）细胞中具有选择性细胞毒性。JCTH-4可通过靶向线粒体在两种细胞系中诱导细胞凋亡；JCTH-4导致这些癌细胞分离的线粒体中线粒体膜电位（MMP）耗散，并增加活性氧（ROS）的产生。此外，JCTH-4在MCF7细胞中还可诱导自噬。有趣的是，在SH-SY5Y和MCF7细胞中，TAM与JCTH-4联合使用可增强JCTH-4的上述作用。通过相差或明场图像的时间推移显微镜观察MCF7细胞在单独使用JCTH-4、单独使用TAM以及两者联合处理下所诱导的形态学变化。正常人胚成纤维细胞（NFF）对单独使用JCTH-4或JCTH-4与TAM联合使用的敏感性显著降低。因此，这些结果表明，JCTH-4单独使用或与TAM联合使用，均是一种针对乳腺癌和神经母细胞瘤安全有效的化疗药物。

材料与方法

1. 细胞培养

  1. 使用添加了2 mM L-谷氨酰胺、10%胎牛血清（FBS）和10 mg/mL庆大霉素（Gibco BRL, VWR, 加拿大密西沙加）的杜尔贝科改良伊格尔培养基F-12 HAM（Sigma-Aldrich, 加拿大密西沙加）培养SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞（ATCC，货号CRL-2266，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。细胞维持在37 °C、5% CO2条件下培养。
  2. 使用添加了10%标准胎牛血清（Thermo Scientific, 美国沃尔瑟姆）和10 mg/mL庆大霉素（Gibco BRL, VWR, 加拿大密西沙加）的RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich Canada, 加拿大密西沙加）培养MCF7人乳腺腺癌细胞（ATCC，货号HTB-22，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。细胞维持在37 °C、5% CO2条件下培养。
  3. 使用添加了15%胎牛血清和10 mg/mL庆大霉素（Gibco BRL, VWR, 加拿大密西沙加）的高糖杜尔贝科改良伊格尔培养基（Thermo Scientific, 美国沃尔瑟姆）培养表观正常的人类胎儿成纤维细胞（NFF）系（Coriell医学研究所，货号AG04431B，美国新泽西州卡姆登）。细胞维持在37 °C、5% CO2条件下培养。

2. 药物制备

  1. 称取他莫昔芬（TAM）柠檬酸盐（Sigma-Aldrich，货号：T9262，加拿大安大略省密西沙加）并溶于DMSO中，配制10 mM的储备液。将储备液于-20 °C保存，直至使用。本研究中所有对照溶剂中的DMSO浓度均低于0.5%。
  2. 重复步骤2.1，通过溴苯的化学酶法合成制备JC-TH-乙酸盐-4（JCTH-4），并将其溶于DMSO中配制1 mM的储备液16。将储备液于-20 °C保存，直至使用。本研究中所有对照溶剂中的DMSO浓度均低于0.5%。

3. 时间序列显微镜观察

  1. 在 II 级生物安全柜的无菌条件下，将约 2.0 x 105 个 MCF7 细胞接种于 35 mm 玻璃底培养皿（MatTek Corporation，货号 P35G-014-C，美国马萨诸塞州阿什兰）中，并在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养细胞。
  2. 当细胞融合度达到 60% 至 70% 时，在 II 级生物安全柜中单独或联合使用溶于 DMSO 的 1 μM JCTH-4（母液浓度为 1 mM）和 10 μM TAM（母液浓度为 10 mM）进行处理。
  3. 处理细胞 48 小时后，将培养皿置于 Leica DMI6000 荧光显微镜（Leica Microsystems，德国韦茨拉尔）载物台上配备的加热腔室中，保持 37 °C 和 5% CO2 条件。
  4. 使用 LAS AF6000 软件设置显微镜，以 400 倍放大倍数每隔 5 分钟采集一次相差或明场显微图像，持续 18 小时。

4. 细胞核染色

  1. 在II级生物安全柜中，将约2.0 × 105个MCF7或SH-SY5Y细胞接种至6孔透明底组织培养板的每个孔中，并在37 °C和5% CO2条件下培养。
  2. 当细胞融合度达到60%至70%时，在II级生物安全柜中使用DMSO溶解的1 mM储备液加入1 μM JCTH-4，以及使用DMSO溶解的10 mM储备液加入10 μM TAM，分别单独处理及联合处理细胞。
  3. 将细胞在37 °C和5% CO2条件下，分别孵育48小时（SH-SY5Y细胞）或72小时（MCF7细胞）以进行上述处理。
  4. 药物处理并孵育后，直接向处理组细胞的培养基中加入Hoechst 33342染料（Molecular Probes, Eugene, OR, USA），终浓度为10 μM，用于细胞核染色。
  5. 避光孵育细胞与Hoechst染料5至10分钟。
  6. 将培养板置于Leica DM IRB倒置荧光显微镜（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）载物台上。
  7. 以400倍放大倍数拍摄荧光和相差显微图像。

5. Annexin V 结合实验

  1. 在 II 级生物安全柜中，将约 5.0 × 105 个 MCF7、SH-SY5Y 或 NFF 细胞接种于 10 mL 培养皿中，并在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养。
  2. 当细胞融合度达到 60% 至 70% 时，在 II 级生物安全柜中分别或联合使用 DMSO 溶解的 1 mM 原液配制的 1 μM JCTH-4 和 DMSO 溶解的 10 mM 原液配制的 10 μM TAM 进行处理。
  3. 将细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下，分别与上述处理物孵育 48 小时（SH-SY5Y 细胞）或 72 小时（MCF7 和 NFF 细胞）。
  4. 用 ddH2O 配制 Annexin V 结合缓冲液，其中含 10 mM HEPES、10 mM NaOH、140 mM NaCl 和 1 mM CaCl2，调节 pH 至 7.6，配制后置于 4 °C 保存，直至使用。
  5. 药物处理并孵育细胞后，从含有悬浮细胞的培养皿中移除培养基，并将其转移至分别标记了对应处理条件的 15 mL 圆底离心管中，每种处理组单独存放。
  6. 使用胰蛋白酶消化贴壁细胞，使其脱离培养皿表面。
  7. 待胰蛋白酶作用使细胞从培养皿脱落之后，吸出第 5 步中保存于 15 mL 圆底离心管中的培养基，并将其重新加入原培养皿中，与含胰蛋白酶的细胞悬液混合。
  8. 使用电子移液器和血清移液管将培养基与胰蛋白酶细胞悬液充分混匀，然后将混合液转移回对应的 15 mL 圆底离心管中。
  9. 在 4 °C 下以 600 × g 离心 5 分钟，弃去各管上清液，并将细胞用 PBS 重悬。
  10. 再次在 600 × g 下离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于已标记的微量离心管中，每管加入约 50 至 70 μL Annexin V 结合缓冲液。
  11. 加入 Annexin V AlexaFluor-488（1:50）（Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada）和 Hoechst 染料，使终浓度为 10 μM，避光孵育 15 分钟。
  12. 孵育结束后，涡旋混匀其中一支微量离心管，取 7 至 10 μL 细胞混合液滴加至显微镜载玻片上，盖上盖玻片，在 Leica DM IRB 倒置荧光显微镜（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）下以 400 倍放大倍数采集每一样品视野的 Annexin V 和 Hoechst 荧光图像。对剩余各微量离心管中的每个实验样品重复此操作。

6. 细胞活力的水溶性四唑盐（WST-1）检测法

  1. 在II级生物安全柜中，对MCF7、SH-SY5Y或NFF细胞的汇合T75培养瓶或10 cm组织培养皿进行胰蛋白酶消化处理。
  2. 待细胞脱落后，向胰蛋白酶中加入5至10 mL培养基，将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。
  3. 以600 × g离心5分钟，将离心管放回生物安全柜中，吸除上清液，并根据细胞沉淀的大小，用约1至3 mL培养基重悬细胞。
  4. 取10 μL细胞悬液加入微量离心管中，加入10 μL台盼蓝染液（Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada），用微量移液器混匀。
  5. 取10 μL含台盼蓝的细胞悬液加入血细胞计数板（Hausser Scientific, USA），进行细胞计数，并计算原始15 mL锥形管中细胞悬液的细胞浓度。
  6. 根据该浓度计算所需原始细胞悬液的体积，以制备用于接种的稀释细胞悬液：MCF7和SH-SY5Y细胞浓度为1.5 × 105 个细胞/mL，NFF细胞浓度为5.0 × 104 个细胞/mL。
  7. 将稀释后的细胞悬液每孔加入100 μL至96孔透明底组织培养板中，使MCF7或SH-SY5Y细胞每孔接种15 × 103 个，NFF细胞每孔接种5.0 × 103 个。将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
  8. 在II级生物安全柜中，对MCF7和NFF细胞用1 μM JCTH-4和10 μM TAM单独或联合处理72小时，对SH-SY5Y细胞处理48小时。
  9. 药物处理及孵育结束后，向每孔加入10 μL WST-1试剂（Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA），将培养板在37 °C、5% CO2条件下继续孵育4小时。
  10. 使用Wallac Victor3 1420多标记计数仪（PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canada）在450 nm波长下测定吸光度，并以溶剂对照组为基准计算相对百分比。

7. 四甲基罗丹明甲酯（TMRM）染色

  1. 在生物安全柜 II 级中，将盖玻片放入 6 孔透明底组织培养板的每个孔中，并在每个孔中接种 MCF7 细胞。于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养细胞。
  2. 当细胞融合度达到 60% 至 70% 时，在生物安全柜 II 级中，使用 DMSO 溶解的 1 mM 原液配制 1 μM JCTH-4 处理细胞，同时使用 DMSO 溶解的 10 mM 原液配制 10 μM TAM 处理细胞，分别单独处理及联合处理。
  3. 将细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下，用上述处理方式孵育 72 小时。
  4. 药物处理及孵育后，直接向处理组细胞的培养基中加入 Hoechst 33342 染料（Molecular Probes, Eugene, OR, USA），终浓度为 10 μM，用于细胞核染色；同时加入四甲基罗丹明甲酯（TMRM）（Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada），终浓度为 200 nM。
  5. 将细胞在 5% CO2 和 37 °C 条件下，避光孵育染料 45 分钟。
  6. 用移液器吸取 8 μL 培养基或 PBS 滴加至显微镜载玻片上，从 6 孔板中取出盖玻片，用镊子将其细胞面朝下放置于载玻片的液滴上。
  7. 使用 Leica DM IRB 倒置荧光显微镜（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany），在 400 倍放大倍数下拍摄每视野的荧光显微图像，包括 Hoechst 和 TMRM 荧光图像。

8. 线粒体分离

  1. 配制约 10 mL 低渗缓冲液（1 mM EDTA、5 mM Tris-HCl、210 mM 甘露醇、70 mM 蔗糖、10 μM 亮氨酸蛋白酶抑制剂、10 μM 蛋白酶抑制剂 A 和 100 μM PMSF），同时准备反应缓冲液，并将两种溶液均置于冰上保存。
  2. 取约 8 至 10 个汇合度良好的 T75 组织培养瓶中的 SH-SY5Y 细胞，用胰蛋白酶消化细胞，加入培养基中和胰蛋白酶，将细胞悬液收集至 50 mL 圆底离心管中，并在 4 °C 下以 600 × g 离心 5 分钟。
  3. 弃去上清液，用约 10 至 20 mL 冷 PBS 重悬细胞沉淀，在 4 °C 下以 600 × g 离心 5 分钟，并重复此洗涤步骤一次。
  4. 弃去上清液，用冷的低渗缓冲液重悬细胞。使用玻璃组织研磨器手动匀浆细胞，然后在 4 °C 下以 600 × g 离心 5 分钟，收集细胞裂解液。
  5. 将所得上清液在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 15 分钟。收集胞质上清液，并将线粒体沉淀用冷的反应缓冲液重悬。

9. Amplex Red 检测法

  1. 从细胞中分离线粒体后，使用已知浓度为1 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）标准曲线，通过BioRad蛋白检测试剂盒（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）测定分离线粒体样品的蛋白浓度。
  2. 根据所测定的分离线粒体溶液的蛋白浓度，计算提供20 μg蛋白所需的溶液体积。用移液器将该体积加入不透光的96孔板的每个孔中，使每孔上样蛋白量为20 μg。
  3. 用反应缓冲液将每孔补至总体积100 μL，并加入药物处理（终浓度为1 μM JCTH-4 和/或 10 μM TAM，或250 μM PQ（Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada）作为阳性对照）、Amplex Red试剂（终浓度50 μM）以及辣根过氧化物酶（HRP）（Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada），其用量比例为6 U/200 μL。
  4. 孵育2小时后，使用荧光分光光度计（SpectraMax Gemini XPS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA）在激发波长560 nm、发射波长590 nm处读取荧光值。

10. 细胞裂解液制备

  1. 将MCF7细胞在10 cm组织培养皿中培养至60%至70%汇合度。
  2. 分别用1 μM JCTH-4和10 μM TAM单独处理，以及联合处理细胞72小时，每组处理使用约10至15个培养皿。
  3. 配制细胞裂解缓冲液（10 mM Tris HCl，pH 7.2，5 mM KCl，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，1% Triton-X-100；10 μM Leu-pep，10 μM Pep-A，和100 μM PMSF），并于4 °C保存备用。
  4. 使用细胞刮刀将细胞从培养皿表面机械刮下，并收集至标记好的50 mL锥形管中。
  5. 在4 °C下以600 × g离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于约10至20 mL冷PBS中，再次在4 °C下以600 × g离心5分钟，并重复该洗涤步骤一次。
  6. 弃去上清液，将细胞重悬于冷的细胞裂解缓冲液中。使用玻璃组织研磨器手动匀浆，然后在4 °C下以600 × g离心5分钟。
  7. 弃去沉淀，将细胞裂解液于-20 °C保存备用。

11. 蛋白质印迹分析

  1. 使用 BioRad 蛋白检测试剂盒（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA）测定细胞裂解液的蛋白浓度。将蛋白样品进行 SDS-PAGE 电泳，并将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。
  2. 转移完成后，用 5% w/v 脱脂牛奶 TBST（Tris-缓冲盐水 Tween-20）溶液在室温下封闭膜 1 小时。
  3. 在 4 °C 下，用兔源抗 LC3 抗体（1:500）（Novus Biologicals, 货号 NB100-2220, Littleton, CO, USA）或鼠源抗 β-Actin 抗体（1:1000）（Santa Cruz Biotechnology, Inc., 货号 sc-81178, Paso Robles, CA, USA）孵育膜过夜。
  4. 用 TBST 溶液对膜进行一次 15 分钟和两次 5 分钟的洗涤，随后在 4 °C 下与辣根过氧化物酶标记的抗鼠（1:2000）或抗兔（1:2000）二抗（Abcam, 货号 ab6728 & ab6802, Cambridge, MA, USA）孵育 1 小时。
  5. 用 TBST 溶液对膜连续洗涤三次，每次 5 分钟，然后使用增强型化学发光试剂（Sigma-Aldrich, 货号 CPS160, Mississauga, ON, Canada）显影蛋白条带。
  6. 使用 ImageJ 软件进行密度分析。

12. 单丹酰尸胺（MDC）染色

  1. 在II级生物安全柜中，将盖玻片放入6孔透明底组织培养板的每个孔内，并在每个孔中接种MCF7细胞。于37 °C、5% CO2条件下培养，使其生长。
  2. 当细胞融合度达到60%至70%时，在II级生物安全柜中分别或联合使用1 μM JCTH-4（以DMSO溶解的1 mM储存液配制）和10 μM TAM（以DMSO溶解的10 mM储存液配制）处理细胞。
  3. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下，用上述处理方式孵育72小时。
  4. 药物处理及孵育后，直接向每孔中加入单丹磺酰尸胺（Monodansylcadaverine, MDC）（Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada），使其终浓度为0.1 mM，作用15分钟。
  5. 将细胞在5% CO2、37 °C条件下避光孵育15分钟，以使染料充分作用。
  6. 取30 μL培养基或PBS滴加至显微镜载玻片上，用镊子从6孔板中取出盖玻片，细胞面朝下放置于载玻片的液滴上。
  7. 使用Leica DM IRB倒置荧光显微镜（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany），在400倍放大倍数下，对每个视野分别采集MDC荧光图像和相差显微图像。

13. 代表性结果

JCTH-4 对人乳腺腺癌和神经母细胞瘤细胞选择性诱导凋亡：TAM 增强其活性

天然PST在多种癌细胞中显示出选择性诱导凋亡的作用（图1a）11-13。由于PST的可获得性较低，我们合成了7-去氧 pancratistatin 的类似物（JCTH-4，图1b），并在人乳腺腺癌细胞（MCF7）和神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中筛选其是否具有类似的抗肿瘤活性。在实验的第一阶段，我们希望监测MCF7细胞在单独或联合使用JCTH-4与TAM处理后随时间推移的形态学变化。如通过延时相差显微镜生成的视频1所示，经溶剂处理（对照组）的MCF7细胞在48小时内未表现出明显的形态学改变。相比之下，在1 μM JCTH-4处理48小时后，这些细胞表现出与凋亡相关的形态学变化，如细胞收缩、出泡以及凋亡小体的形成，如视频2所示。另一方面，TAM单独处理MCF7细胞则导致一种非常独特的形态，包括点状包涵体，提示存在与自噬相关的自噬体（视频3）。仅观察到极少的凋亡形态，细胞总体上表现出与溶剂对照组处理的MCF7细胞相似的健康形态。有趣的是，在TAM存在的情况下，JCTH-4诱导凋亡的作用显著增强，表现为48小时后MCF7细胞中凋亡形态明显增加，如视频4所示。

在实验的第二阶段，我们利用荧光染料评估细胞凋亡的诱导情况。分别在 MCF7 和 SH-SY5Y 细胞中经 1 μM JCTH-4 处理 72 小时和 48 小时后，使用 Hoechst 染料监测细胞核形态。结果显示，MCF7 和 SH-SY5Y 细胞中出现染色强烈且浓缩的细胞核，并伴有凋亡小体，提示发生了细胞凋亡（图 2a, b）。单独使用 TAM 处理时，MCF7 和 SH-SY5Y 细胞中仅观察到极少的凋亡样核形态；细胞核较大、呈圆形，Hoechst 染色较弱，与溶剂对照组相似（图 2a, b）。与 视频 4 结果一致，在联合处理 72 小时后，MCF7 和 SH-SY5Y 细胞的细胞核表现出显著增加的凋亡形态（图 2a, b）。

为验证凋亡诱导，通过Annexin V结合实验检测细胞磷脂酰丝氨酸外翻情况，这是凋亡的一个标志17。分别经1 μM JCTH-4单独处理或联合10 μM TAM处理72小时的MCF7细胞和48小时的SH-SY5Y细胞均呈Annexin V结合阳性，表现为绿色荧光，证实了凋亡的诱导（图3a, b）。单独使用TAM处理的MCF7和SH-SY5Y细胞，以及经上述所有处理组处理72小时后的NFF细胞，均未观察到明显的磷脂酰丝氨酸外翻现象（图3c）。因此，JCTH-4单独使用或与TAM联用可选择性地在MCF7和SH-SY5Y细胞中诱导凋亡。

为了定量分析JCTH-4单独作用及其与TAM联用的效果，采用基于WST-1的比色法检测细胞活力，该方法可反映细胞活跃代谢水平，实验处理MCF7和NFF细胞72小时，SH-SY5Y细胞48小时。与溶剂对照组相比，1 μM JCTH-4使细胞活跃代谢水平降低超过50%，而10 μM TAM单独处理在MCF7和SH-SY5Y细胞中均未引起显著差异（图4a, b）。有趣的是，在MCF7和SH-SY5Y细胞中，TAM与JCTH-4联合处理导致细胞代谢进一步协同下降。NFF细胞对JCTH-4单独处理以及JCTH-4与TAM联合处理的敏感性显著更低（图4c）。因此，JCTH-4在MCF7和SH-SY5Y细胞中表现出与TAM的选择性协同活性。

JCTH-4 的线粒体靶向

为了检测 JCTH-4 是否靶向线粒体以诱导细胞凋亡，监测了完整细胞中的线粒体膜电位以及分离线粒体中的活性氧（ROS）生成情况。MCF7 细胞经处理 72 小时后，用 TMRM 染色。1 μM JCTH-4 导致线粒体膜电位（MMP）下降，表现为红色荧光减弱（图 5a）。然而，当联合使用 10 μM TAM 时，MMP 的降低更为显著，而单独使用 10 μM TAM 对 MMP 无明显影响。

由于活性氧（ROS）生成增加与线粒体膜通透化及凋亡诱导相关，因此使用Amplex Red染料检测经1 μM JCTH-4和10 μM TAM单独或联合处理的SH-SY5Y细胞分离线粒体中的ROS生成18-20。荧光读数以相对荧光单位（RFU）表示。单独使用JCTH-4和TAM均观察到ROS生成增加（图5b）。有趣的是，联合处理导致ROS生成进一步显著升高。作为线粒体中ROS生成的已知诱导剂，PQ被用作阳性对照。

JCTH-4 和 TAM 诱导自噬

已有多种化合物被证实可因化疗损伤而诱导自噬3。为评估自噬的诱导情况，对经1 μM JCTH-4和10 μM TAM单独或联合处理72小时的MCF7细胞进行了MDC染色。在经JCTH-4和TAM单独或联合处理的MCF7细胞中均可见提示自噬体形成的蓝色斑点状荧光（图6a）。值得注意的是，联合处理组的MDC染色强度最强，其次为TAM单独处理组，再次为JCTH-4单独处理组。

在自噬过程中，微管相关蛋白1轻链3（LC3）通常位于细胞质中（LC3-I），经磷脂酰乙醇胺脂化后定位于自噬体膜上（LC3-II）2。为验证自噬的诱导，通过Western印迹分析检测了经处理72小时的MCF7细胞中LC3-II的水平。1 μM JCTH-4轻微诱导了LC3-I向LC3-II的转化，而10 μM TAM诱导的自噬反应更强（图6b）。有趣的是，联合处理导致自噬诱导最为显著，LC3-II与LC3-I的比值超过3。因此，这些结果表明JCTH-4和TAM单独或联合处理均可在MCF7细胞中诱导自噬，其中联合处理组的反应最强。

补充视频 1. 经溶剂对照处理的 MCF7 细胞的细胞形态。使用相差显微镜进行延时成像，监测 MCF7 细胞在溶剂对照处理（DMSO）后 48 至 66 小时内的变化。细胞培养环境保持在 37 °C 和 5% CO2。图像以 400 倍放大倍数采集。 点击此处观看视频。

补充视频 2. 使用 JCTH-4 处理的 MCF7 细胞中凋亡细胞形态的诱导。采用相差显微镜进行活细胞成像，监测经 1 μM JCTH-4 处理后 48 至 66 小时内的 MCF7 细胞，成像过程中维持细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下。图像以 400 倍放大倍数采集。点击此处观看视频。

补充视频 3. 用 TAM 处理的 MCF7 细胞中自噬性细胞形态的诱导。采用相差显微镜进行延时成像，监测经 10 μM TAM 处理后 48 至 66 小时内的 MCF7 细胞。细胞保持在 37 °C 和 5% CO2 条件下。图像以 400 倍放大倍数采集。点击此处观看视频。

补充视频 4. JCTH-4 与 TAM 联用在 MCF7 细胞中增强的凋亡形态。采用相差显微镜进行延时成像，监测经 1 μM JCTH-4 和 10 μM TAM 处理后 48 至 66 小时内的 MCF7 细胞。细胞维持在 37 °C 和 5% CO2 环境中。图像以 400 倍放大倍数采集。点击此处观看视频。

化学结构式：Pancratistatin (PST) 和 JC-TH-乙酸酯-4 (JCTH-4) 示意图。
图 1. PST 与其合成的 7-脱氧类似物的结构比较。（a） 花洒碱（pancratistatin, PST）的化学结构。（b） JC-TH-乙酸酯-4（JCTH-4）的化学结构。

细胞处理效果；Hoechst染色，相差显微镜，MCF7/SH-SY5Y，荧光显微镜。
图2. JCTH-4 与 TAM 联用时增强诱导细胞核出现凋亡形态。经指定浓度的 TAM 和 JCTH-4 处理 (a) MCF7 细胞 72 小时和 (b) SH-SY5Y 细胞 48 小时后，使用 Hoechst 染料染色观察细胞核形态。对照组使用溶剂（DMSO）处理。图像在荧光显微镜下以 400 倍放大倍数拍摄。比例尺 = 15 μm。

细胞活力检测；Hoechst 和 Annexin V 染料；MCF7、SH-SY5Y、NFF 细胞；荧光显微镜。
图 3. JCTH-4 单独使用或与 TAM 联用可选择性地在癌细胞中诱导磷脂酰丝氨酸外翻。通过 Annexin V 与外翻的磷脂酰丝氨酸结合情况，验证 JCTH-4 和 TAM 在指定浓度下对 (a) MCF7（72 小时）、(b) SH-SY5Y（48 小时）和 (c) NFF（72 小时）细胞诱导凋亡的效果。对照组使用溶剂（DMSO）处理。图像在荧光显微镜下以 400 倍放大倍数拍摄。比例尺 = 15 μm。

MCF7、SH-SY5Y、NFF细胞系的吸光度柱状图；TAM和JCTH-4对细胞活力的影响。
图4. TAM在癌细胞中选择性增强JCTH-4诱导的细胞活力下降。将(a) MCF7、(b) SH-SY5Y和(c) NFF细胞接种于96孔板中，并用指定浓度的JCTH-4和TAM处理。MCF7和NFF细胞处理72小时，SH-SY5Y细胞处理48小时。药物处理并孵育后，向每孔加入WST-1试剂，在450 nm处测定吸光度，并以对照组（DMSO）的百分比表示。统计分析使用GraphPad Prism 5.0版本进行。数据来自3次独立实验的四重复，以均值±标准差表示。MCF7：*p<0.001，**p<0.0001，与对照组比较；#p<0.05，与1 μM JCTH-4比较；†p<0.0001，与10 μM TAM比较。SH-SY5Y：*p<0.0005，与对照组比较；#p<0.005，与1 μM JCTH-4比较；†p<0.005，与10 μM TAM比较。NFF：*p<0.005，与MCF7细胞中10 μM TAM + 1 μM JCTH-4比较；#p<0.01，与SH-SY5Y细胞中10 μM TAM + 1 μM JCTH-4比较。

经TMRM染色处理的MCF7细胞显微图像；SH-SY5Y细胞RFU结果的柱状图。
图5. JCTH-4与TAM作用于线粒体。(a) 将MCF7细胞接种于盖玻片上，用指定浓度的药物处理72小时，随后用TMRM染色以评估线粒体膜电位（MMP）。对照组细胞用溶剂（DMSO）处理。在荧光显微镜下以400倍放大倍数采集图像。比例尺 = 15 μm。(b) 从SH-SY5Y细胞中分离线粒体，用指定浓度的JCTH-4和TAM处理，并在辣根过氧化物酶（HRP）存在下，使用Amplex Red底物检测活性氧（ROS）的生成。对照组细胞用溶剂（DMSO）处理。以250 μM的百草枯（PQ）作为阳性对照。在激发波长560 nm、发射波长590 nm条件下，处理2小时后测定荧光信号，并以相对荧光单位（RFU）表示。统计分析使用GraphPad Prism 5.0版完成。数据代表3次独立实验中具有相似趋势的结果，数值表示1次独立实验中4个重复样本的均值±标准差（SD）。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001，与对照组比较；#p<0.05，与1 μM JCTH-4比较；†p<0.05，与10 μM TAM比较；@p<0.05，与250 μM PQ比较。

MCF7细胞处理分析、显微镜图像及蛋白表达结果，LC3比值柱状图。
图6. TAM增强JCTH-4诱导的自噬作用。(a) 将MCF7细胞接种于盖玻片上，并用指定浓度的JCTH-4和TAM处理72小时。对照组细胞用溶剂（DMSO）处理。处理结束后，用MDC染色MCF7细胞以检测自噬囊泡。在荧光显微镜下以400倍放大倍数采集图像。比例尺= 15 μm。(b) 对经指定浓度药物处理72小时的MCF7细胞裂解液进行LC3和β-Actin的蛋白质印迹分析。使用ImageJ软件进行密度测定分析。统计分析采用GraphPad Prism 5.0版软件完成。数据以均值±标准差表示。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，与对照组比较；#p<0.001，与1 μM JCTH-4组比较；†p<0.001，与10 μM TAM组比较。

缩略语列表。

ER雌激素受体
FMN黄素单核苷酸
JCTH-4JC-TH-乙酸盐-4
LC3微管相关蛋白1轻链3
MDC单丹磺酰尸胺
MMP线粒体膜电位
MRC线粒体呼吸链
NFF正常人胎儿成纤维细胞
PQ百草枯
PST全蟾毒素
RFU相对荧光单位
ROS活性氧物种
TAM他莫昔芬
TMRM四甲基罗丹明甲酯

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讨论

已有研究表明，PST 及类似化合物具有抗癌特性11-15,21。我们此前曾报道，天然 PST 可选择性地破坏癌细胞中的线粒体稳定性，从而通过释放促凋亡因子诱导细胞凋亡12,14。JCTH-4 很可能也通过相同机制发挥作用；JCTH-4 导致 MCF7 细胞线粒体膜电位（MMP）崩溃（如 TMRM 染色所示，图 5a），并增加 SH-SY5Y 细胞分离线粒体中活性氧（ROS）的生成（图 5b），提示线粒体功能障碍。因此，JCTH-4 诱导细胞凋亡的机制极有可能是通过靶向癌细胞中的线粒体实现的。

非癌细胞与癌细胞之间存在多种差异，这些差异可能构成JCTH-4对癌症选择性作用的基础。癌细胞在能量生成过程中高度依赖糖酵解，而对线粒体的依赖性较低；这一现象被称为瓦博格效应22。癌细胞中的这种代谢活动导致胞质内酸性水平升高。因此，酸性的胞质环境会引起癌细胞线粒体的超极化，而线粒体超极化已被证实与增强的侵袭能力及逃避免疫性细胞凋亡相关23。然...

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致谢

本工作得到了安大略省温莎市哥伦布骑士会第9671分会以及授予丹尼斯·马（Dennis Ma）的加拿大卫生研究院弗雷德里克·班廷和查尔斯·贝斯特加拿大研究生奖学金的支持。感谢罗伯特·霍奇（Robert Hodge）和伊丽莎白·菲达尔戈·达席尔瓦（Elizabeth Fidalgo da Silva）在延时显微镜实验中的协助。感谢凯蒂·法塞基亚（Katie Facecchia）对延时显微镜视频的编辑。我们还要感谢苏迪帕·朱妮·查特吉（Sudipa June Chatterjee）和菲利普·特雷布莱（Phillip Tremblay）对本文稿的审阅。本研究谨以此纪念于2010年因癌症逝世的凯文·库维隆（Kevin Couvillon）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SH-SY5Y 细胞系ATCCCRL-2266
杜尔贝科’s 改良 Eagle 培养基 F-12 HAMSigma-Aldrich51448C
胎牛血清 GIBCO，隶属于 Life Technologies16000-044
MCF7细胞系ATCCHTB-22
RPMI-1640 培养基Sigma-AldrichR 0883
表观正常的正常人胎儿成纤维细胞系（NFF）柯里尔医学研究机构AG04431B
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s Medium，高糖培养基赛默飞世尔科技公司SH30022.01
枸橼酸他莫昔芬盐 Sigma-AldrichT9262
35 mm 玻璃底培养皿 MatTek 公司P35G-014-C
Leica DMI6000 B 倒置显微镜徕卡显微系统N/A
H–chst 33342 染料分子探针，Life TechnologiesH3570
Leica DM IRB 倒置荧光显微镜 Leica MicrosystemsN/A
Annexin V AlexaFluor-488InvitrogenA13201
台盼蓝溶液Sigma-AldrichT8154-20ML
血细胞计数板Fisher Scientific267110
WST-1试剂罗氏集团11644807001
Wallac Victor3 1420 多标签计数器PerkinElmer, Inc.1420-011
四甲基罗丹明甲酯（TMRM） GIBCO，隶属于 Life TechnologiesT-668
玻璃组织研磨器Fisher ScientificK8885300-0002
BioRad 蛋白检测伯乐（Bio-Rad）500-0001底部表单
Amplex RedInvitrogenA12222
辣根过氧化物酶（HRP）Sigma-AldrichP8125
SpectraMax Gemini XPSMolecular Devices3126666
兔源抗LC3抗体Novus BiologicalsNB100-2220
抗小鼠 HRP 标记二抗Abcamab6728
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗Abcamab6802
化学发光过氧化物酶底物Sigma-AldrichCPS160
单丹磺酰基尸胺Sigma-Aldrich30432

参考文献

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