一种用于在滑液中培养人关节软骨细胞的三维培养系统

摘要

介绍了一种在高水平滑液环境中培养人关节软骨细胞的三维体系。滑液最能反映关节软骨的天然微环境，且易于获取和保存。因此，该体系可用于研究软骨再生以及筛选治疗关节炎的药物。

摘要

软骨破坏是骨关节炎的核心病理特征，而骨关节炎是美国导致残疾的主要原因之一。成年个体的软骨自我再生能力较弱 体内；因此，骨关节炎会导致不可逆的软骨丧失，并伴有慢性疼痛和活动障碍 ^1,2软骨组织工程在再生和恢复组织功能方面展现出广阔前景。该技术通常将软骨细胞接种于天然或合成支架材料中，形成三维结构，并在平衡的培养基中进行一段时间的培养，旨在构建出具有成熟生化特性和生物力学性能的组织，可用于移植修复缺损部位 体内 ^3-6实现软骨细胞生长和基质沉积的最佳条件对于软骨组织工程的成功至关重要。

在天然的关节腔内，覆盖于骨关节表面的软骨浸润在滑液中。这种透明且黏稠的液体为无血管的关节软骨提供营养，并含有对软骨细胞代谢至关重要的生长因子、细胞因子和酶^7,8。此外，滑液主要通过分泌两种关键成分——透明质酸和润滑素，实现软骨表面之间的低摩擦运动^{9 10}。相比之下，组织工程软骨通常在人工培养基中培养。尽管这些培养基可能更有利于对软骨细胞代谢进行条件明确的研究，但滑液更能准确反映关节软骨细胞所处的天然微环境。

事实上，滑液具有易于获取和保存的优点，并且通常可由机体定期补充。多个研究团队在培养人、牛、兔和狗的软骨细胞时，已在培养基中添加了滑液，但大多仅使用较低浓度的滑液（低于20%）^11-25。尽管已有研究在含有较高比例滑液的培养基中培养鸡、马和人的软骨细胞，但这些培养系统均为二维培养系统^26-28。本文中，我们介绍一种在三维培养系统中使用高比例滑液（最高达100%）培养人关节软骨细胞的方法，培养周期为21天。在此过程中，我们克服了滑液高黏度带来的主要技术难题。该系统使得在三维环境中研究滑液对人软骨细胞的影响成为可能，并可进一步结合构成软骨天然生长环境的另外两个重要因素——氧张力和机械负荷^29,30，从而模拟软骨生长的自然微环境。此外，该系统还可用于检测滑液对软骨细胞的生物学活性，为开发软骨再生技术和关节炎的治疗方案提供一个研究平台。

方案

一种在滑液中培养人关节软骨细胞的三维系统

在本研究中，我们采用改良的制造商推荐包封方案（Lonza，以及³¹），将人关节软骨细胞包封于海藻酸盐微球中。利用这些三维结构，我们建立了一种在含有不同比例人滑膜液的培养基中培养细胞的体系，并评估了这些三维结构中软骨相关基因的表达情况。

1. 准备用于三维（3D）包封的人关节软骨细胞（HAC）

1. 将一管人关节软骨细胞（HAC）（Lonza）（第2代）在37°C水浴中解冻1分钟。
2. 加入1 ml软骨细胞生长培养基（Lonza），在3000 rpm条件下离心3-5分钟以收集细胞，弃去上清液。
3. 用软骨细胞生长培养基（Lonza）重悬细胞沉淀。
4. 将细胞接种至10 cm组织培养皿（BD Biosciences）中，使用软骨细胞生长培养基（Lonza）培养至细胞融合。人关节软骨细胞应使用不超过第3或第4代（P3或P4）的细胞。
5. 用155 mM NaCl溶液而非标准PBS洗涤培养皿中的HAC，随后进行胰蛋白酶消化以收集细胞用于海藻酸盐微珠包封。待细胞脱落后，在3000 rpm条件下离心5分钟。此时细胞已准备好进行三维包封。

2. 将HACs包封到3D微珠中

将HACs重悬于1.2%的海藻酸钠溶液（Sigma）中，细胞密度为8×10⁵个细胞/mL。在包封前需使用标准细胞计数仪确定细胞数量。充分混匀至关重要，以确保细胞在微珠中分布均匀。

1. 将HAC/海藻酸盐溶液混合物用移液器吸入一个连接22号针头（Tyco healthcare, Inc.）的12 ml注射器中。
2. 同时，准备一个50 mL烧杯，加入体积为HAC/海藻酸盐溶液体积5倍的102 mM CaCl₂溶液。在烧杯中放入搅拌子，并以约150 rpm的速度缓慢搅拌102 mM CaCl₂溶液。
3. 将注射器针尖保持在CaCl₂溶液液面上方约6英寸处，逐滴将HAC/海藻酸盐混合物加入CaCl₂溶液中。通常情况下，形成的海藻酸盐微球直径为2 mm，包封密度约为10⁴个细胞/微球。注意：注射器距CaCl₂溶液的高度至关重要，距离过短会导致微球呈泪滴状而非球形，从而造成机械强度不均和细胞包封不均。
4. 让微球在CaCl₂溶液中搅拌20–25分钟。尽管其他海藻酸盐包封方案建议较短的10分钟孵育时间，但我们发现延长在CaCl₂溶液中的孵育时间有助于增强微球的完整性。
5. 去除CaCl₂溶液，用2–3倍体积的NaCl溶液洗涤微球2–3次，再用软骨细胞分化培养基（Lonza）洗涤一次。虽然其他海藻酸盐微球包封方案使用滤膜进行上述洗涤步骤，但我们发现微球常被截留在滤膜中并干燥，从而降低包封效率。我们发现最有效的方法是在倾倒溶液前让微球自然沉降到烧杯底部。
6. 使用标准刮勺将微球转移至培养皿中。我们通常在软骨细胞生长培养基中，每3 cm孔培养12个微球，培养2天，使软骨细胞适应包封过程；之后更换为含滑膜液的软骨细胞分化培养基（Lonza）继续培养。

3. 在滑膜液培养基中培养软骨细胞

1. 可从门诊诊所获取新鲜的滑液（我们从塔夫茨医学中心获取滑液）。将滑液转移至15 ml Falcon管中并立即送至实验室，以3000 rpm离心15分钟以去除细胞碎片。将无细胞的滑液分装至1.5 mL微量离心管中，以避免反复冻融。上清液可于-80°C保存至使用。
2. 在培养前，将滑液与软骨细胞分化培养基（CDM，Lonza）按不同体积比混合，同时保持100 mM抗坏血酸和9 mM CaCl₂的恒定浓度（此微量CaCl₂用于确保海藻酸盐微珠的完整性）。
3. 将培养板置于37°C培养箱内的摇床上（摇动频率约75次/分钟），以促进海藻酸盐微珠内部的营养物质分布，并减少微珠聚集。这一点在长期培养软骨细胞（长达4周）时尤为重要。注意：尽管软骨细胞生长与分化培养基（Lonza）含有两种常用抗生素——庆大霉素和两性霉素，但在使用不同比例滑液进行软骨细胞培养时，我们未额外添加任何抗生素。实验过程中从未观察到污染现象。
4. 每2–3天更换一次培养基混合物。在长期培养过程中，滑液的黏度一直是海藻酸盐微珠包封软骨细胞培养的主要障碍。我们发现，将含滑液的培养基用102 mM CaCl₂（50% V/V）稀释最为有效，该处理同时可增强海藻酸盐微珠的结构完整性。通过此方法，可用移液器缓慢移除培养基而不损伤微珠。

4. 收集海藻酸盐微珠中的HAC用于基因表达分析

在从海藻酸盐微珠中收获HACs用于基因表达分析时，必须格外小心。

1. 用 102 mM CaCl₂ 溶液洗涤海藻酸盐微珠 3 次，每次约 5 分钟。
2. 加入体积为微珠 4–5 倍的 55 mM 柠檬酸钠（NaCitrate）以回收软骨细胞。需确保海藻酸盐微珠完全浸没于柠檬酸钠溶液中。振荡或摇动 20–30 分钟。
3. 离心收集细胞，弃去上清液。
4. 进行 RT-PCR 分析时，将细胞沉淀重悬于细胞裂解缓冲液（Qiagen RNA 提取试剂盒）中，随后进行 RNA 纯化。

5. 用海藻酸盐微珠固定 HACs 以进行组织学分析

进行组织学分析时，必须特别小心地从3D微珠中收获HACs。

1. 用 102 mM CaCl₂ 溶液清洗海藻酸盐微珠 3 次，每次约 5 分钟。为彻底去除黏稠的滑液，我们发现最有效的方法是使用软骨细胞分化培养基（Lonza）在 37°C 培养箱中振荡过夜清洗（振荡频率：约 75 次/分钟）。使用软骨细胞生长培养基可确保软骨细胞在长时间清洗过程中的存活，并促进固定剂最大程度地渗透。
2. 将微珠在 70% 乙醇中固定过夜，随后进行组织学分析。如需进行 DAPI 染色，将海藻酸盐微珠与 DAPI 溶液（500 ng/ml）在轻柔振荡条件下孵育 1 小时，然后用 102 mM CaCl₂ 溶液清洗 3 次，每次 15 分钟。DAPI 荧光图像可在荧光显微镜下观察。微珠也可切片后进行阿利新蓝（alcian blue）和苏木精-伊红（H&E）染色。

6. 代表性结果

我们用于在高比例滑膜液中培养人软骨细胞的3D培养方法如图1所示的示意图。在将人软骨细胞包埋于海藻酸盐微珠后，将其置于添加不同比例滑膜液的培养基中进行培养。由于滑膜液具有较高黏度，因此必须在持续振荡条件下培养软骨细胞，以防止软骨结构聚集，并确保营养物质均匀分布。此外，在回收软骨细胞前必须对海藻酸盐微珠进行充分洗涤，以便固定液或裂解缓冲液能够渗透进入微珠内部（图1）。图2展示了海藻酸盐微珠中软骨细胞的明场（BF）图像。通过DAPI染色确认了细胞在微珠内的均匀分布情况（图2）。在21天培养期结束时，采用qRT-PCR进行基因表达分析。所有PCR均以GAPDH作为参考基因进行标准化，因其被确定为软骨细胞qPCR分析中最可靠的参考基因之一³²。图3展示了一个示例，其中我们分析了来自6名骨关节炎患者混合滑膜液中培养的人关节软骨细胞的结果。与Lonza来源的软骨细胞已在2D培养中扩增、不可避免地导致去分化³³的事实一致，我们发现第0天的软骨细胞几乎不表达软骨基质相关基因（图3）。使用软骨细胞分化培养基（Lonza）或添加滑膜液的培养基进行3D培养，显著提高了胶原蛋白、聚集蛋白聚糖（aggrecan）和MMP13等软骨相关基因的表达水平，表明至第21天软骨细胞发生了再分化（图3）³⁴。随着培养基中滑膜液比例的增加，软骨基质标志物II型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达水平保持在相似水平（图3A和3B）。此外，与仅在普通培养基中培养的细胞相比，在100%滑膜液中培养的软骨细胞甚至表现出软骨降解酶MMP13的mRNA表达下降（图3C）。有趣的是，细胞死亡标志物caspase 3的表达水平随着滑膜液比例的增加而逐渐降低，提示滑膜液培养可减少细胞凋亡水平（图3D）。因此，我们的结果表明，在3D条件下使用高比例滑膜液培养人关节软骨细胞是一种可行的技术。

表格与图示

图1. 在三维海藻酸盐微珠中以高比例滑液培养人关节软骨细胞的方法示意图。首先，将软骨细胞与海藻酸盐溶液混合。当逐滴加入CaCl₂溶液时，软骨细胞被固定在交联的Ca-海藻酸盐水凝胶微珠内。这些三维结构随后在软骨细胞分化培养基（Lonza）中培养，并添加不同比例的人滑液。在摇床条件下培养21天后，对含细胞的海藻酸盐微珠进行充分洗涤，随后回收细胞用于基因表达分析。

图 2。 包含 0%、30%、50%、70% 和 100% 滑膜液的人类关节软骨细胞包封培养物的明场（BF）和 DAPI 图像。在所有培养条件下，软骨细胞均呈球形。叠加明场（BF）与 DAPI 图像以确认软骨细胞的位置和分布。插图：放大图像。箭头：BF 与 DAPI 染色图像中软骨细胞的共定位。

图 3. 包封的人关节软骨细胞在培养第 0 天（D0）及添加不同比例滑膜液（SF）（0%、30%、50%、70% 和 100%）培养 21 天后（D21）的 qRT-PCR 分析结果。此处显示四个独立样本的结果。所有 PCR 均以 GAPDH 作为内参。A. II 型胶原 mRNA 表达。B. 聚集蛋白聚糖 mRNA 表达。C. MMP13 mRNA 表达。D. Caspase 3 mRNA 表达。使用 INSTAT 软件对 0% 与 100% 滑膜液（SF）培养条件下的第 0 天和第 21 天样本进行统计学显著性分析。* 表示 P<0.05。

讨论

本报告中，我们建立了一种方法，可在含有高浓度人源滑膜液的培养基中，将人关节软骨细胞置于三维环境中进行培养。滑膜液是构成关节腔内自然环境的主要成分之一，而关节软骨细胞即位于此环境中。然而，滑膜液的高黏度一直是软骨细胞三维长期培养的主要挑战。为克服在黏性环境中维持三维结构内营养物质均匀分布的难题，并防止细胞聚集，我们通过轻柔摇动使软骨构建物保持持续运动。为增强软骨构建物的结构完整性，我们对传统将软骨细胞接种至海藻酸盐水凝胶的步骤进行了改进，包括优化微珠形成时间及换液操作³¹。在长期培养过程中，当软骨构建物需在黏稠的滑膜液中操作时，这些步骤尤为关键。

我们认为，该方法将使我们能够在天然环境——滑液中研究人关节软骨细胞的生物学特性。一个潜在的问题是，包裹在海藻酸盐微球中并在黏稠环境中生长的软骨细胞，其试剂扩散可能并不理想。因此，在研究特定试剂对工程化软骨的影响时，可通过减小海藻酸盐微球的尺寸以及采用灌注系统来促进试剂在滑液中的分布，从而实现更佳的扩散效果。尽管我们的代表性结果来源于在骨关节炎患者来源的滑液中培养正常人软骨细胞，但我们认为该方法可推广应用于其他健康个体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
特定试剂与设备列表：
试剂名称	公司	目录编号	备注
海藻酸钠（海藻酸）	Sigma-Aldrich	A2158-250G	2.4% 溶液，储存于 40°C
氯化钙二水合物，颗粒状	JT Baker	A19339
软骨生成生长培养基	Lonza Inc.	CC-3156（基础培养基）
CC-4409（添加剂）
软骨生成分化培养基	Lonza Inc.	CC-3226（基础培养基）
CC-4408（添加剂）
人关节软骨细胞	Lonza Inc.	CC-2550
Dapi（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）	Sigma-Aldrich	D9542
RNeasy 小量试剂盒（用于RNA提取）	Qiagen	74104
PCR试剂：SYBR Green	Quanta Biosciences	95053-500
12 ml 注射器	Tyco Healthcare, Covidien	512852
22 号皮下注射针头	Tyco Healthcare, Covidien	8881
显微镜	Olympus Corporation	IX71
平台摇床	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Vari-mix
II型胶原正向引物			5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’
II型胶原反向引物			5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’
MMP13 正向引物			5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’
MMP13 反向引物			5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’
Caspase 3 正向引物			5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’
Caspase 3 反向引物			5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’