介绍了一种在高水平滑液环境中培养人关节软骨细胞的三维体系。滑液最能反映关节软骨的天然微环境，且易于获取和保存。因此，该体系可用于研究软骨再生以及筛选治疗关节炎的药物。
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本文内容
摘要
摘要
软骨破坏是骨关节炎的核心病理特征，而骨关节炎是美国导致残疾的主要原因之一。成年个体的软骨自我再生能力较弱 体内；因此，骨关节炎会导致不可逆的软骨丧失，并伴有慢性疼痛和活动障碍 1,2软骨组织工程在再生和恢复组织功能方面展现出广阔前景。该技术通常将软骨细胞接种于天然或合成支架材料中，形成三维结构，并在平衡的培养基中进行一段时间的培养，旨在构建出具有成熟生化特性和生物力学性能的组织，可用于移植修复缺损部位 体内 3-6实现软骨细胞生长和基质沉积的最佳条件对于软骨组织工程的成功至关重要。
在天然的关节腔内，覆盖于骨关节表面的软骨浸润在滑液中。这种透明且黏稠的液体为无血管的关节软骨提供营养，并含有对软骨细胞代谢至关重要的生长因子、细胞因子和酶7,8。此外，滑液主要通过分泌两种关键成分——透明质酸和润滑素，实现软骨表面之间的低摩擦运动9 10。相比之下，组织工程软骨通常在人工培养基中培养。尽管这些培养基可能更有利于对软骨细胞代谢进行条件明确的研究，但滑液更能准确反映关节软骨细胞所处的天然微环境。
事实上，滑液具有易于获取和保存的优点，并且通常可由机体定期补充。多个研究团队在培养人、牛、兔和狗的软骨细胞时，已在培养基中添加了滑液，但大多仅使用较低浓度的滑液（低于20%）11-25。尽管已有研究在含有较高比例滑液的培养基中培养鸡、马和人的软骨细胞，但这些培养系统均为二维培养系统26-28。本文中，我们介绍一种在三维培养系统中使用高比例滑液（最高达100%）培养人关节软骨细胞的方法，培养周期为21天。在此过程中，我们克服了滑液高黏度带来的主要技术难题。该系统使得在三维环境中研究滑液对人软骨细胞的影响成为可能，并可进一步结合构成软骨天然生长环境的另外两个重要因素——氧张力和机械负荷29,30，从而模拟软骨生长的自然微环境。此外，该系统还可用于检测滑液对软骨细胞的生物学活性，为开发软骨再生技术和关节炎的治疗方案提供一个研究平台。
方案
一种在滑液中培养人关节软骨细胞的三维系统
在本研究中，我们采用改良的制造商推荐包封方案（Lonza，以及31），将人关节软骨细胞包封于海藻酸盐微球中。利用这些三维结构，我们建立了一种在含有不同比例人滑膜液的培养基中培养细胞的体系，并评估了这些三维结构中软骨相关基因的表达情况。
1. 准备用于三维（3D）包封的人关节软骨细胞（HAC）
- 将一管人关节软骨细胞（HAC）（Lonza）（第2代）在37°C水浴中解冻1分钟。
- 加入1 ml软骨细胞生长培养基（Lonza），在3000 rpm条件下离心3-5分钟以收集细胞，弃去上清液。
- 用软骨细胞生长培养基（Lonza）重悬细胞沉淀。
- 将细胞接种至10 cm组织培养皿（BD Biosciences）中，使用软骨细胞生长培养基（Lonza）培养至细胞融合。人关节软骨细胞应使用不超过第3或第4代（P3或P4）的细胞。
- 用155 mM NaCl溶液而非标准PBS洗涤培养皿中的HAC，随后进行胰蛋白酶消化以收集细胞用于海藻酸盐微珠包封。待细胞脱落后，在3000 rpm条件下离心5分钟。此时细胞已准备好进行三维包封。
2. 将HACs包封到3D微珠中
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讨论
本报告中，我们建立了一种方法，可在含有高浓度人源滑膜液的培养基中，将人关节软骨细胞置于三维环境中进行培养。滑膜液是构成关节腔内自然环境的主要成分之一，而关节软骨细胞即位于此环境中。然而，滑膜液的高黏度一直是软骨细胞三维长期培养的主要挑战。为克服在黏性环境中维持三维结构内营养物质均匀分布的难题，并防止细胞聚集，我们通过轻柔摇动使软骨构建物保持持续运动。为增强软骨构建物的结构完整性，我们对传统将软骨细胞接种至海藻酸盐水凝胶的步骤进行了改进，包括优化微珠形成时间及换液操作31。在长期培养过程中，当软骨构建物需在黏稠的滑膜液中操作时，这些步骤尤为关键。
我们认为，该方法将使我们能够在天然环境——滑液中研究人关节软骨细胞的生物学特性。一个潜在的问题是，包裹在海藻酸盐微球中并在黏稠环境中生长的软骨细胞，其试剂扩散可能并不理想。因此，在研究特定试剂对工程化软骨的影响时，可通过减小海藻酸盐微球的尺寸以及采用灌注系统来促进试剂在滑液中的分布，从而实现更佳的扩散效果。尽管我们的代表性结果来源于在骨关节炎患者来源的滑液中培养正常人软骨细胞，但我们认为该方法可推广应用于其他健康个体.......
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披露
我们无任何披露事项。
致谢
我们感谢 Robin Nye（塔夫茨医学中心）、内村智也（Tomoya Uchimura）和 Dana Cairns（塔夫茨大学）在滑液储存和离心方面的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：1R01AR059106-01A1），资助对象为 L.Z.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 特定试剂与设备列表： | |||
| 试剂名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 海藻酸钠（海藻酸） | Sigma-Aldrich | A2158-250G | 2.4% 溶液，储存于 40°C |
| 氯化钙二水合物，颗粒状 | JT Baker | A19339 | |
| 软骨生成生长培养基 | Lonza Inc. | CC-3156（基础培养基） | |
| CC-4409（添加剂） | |||
| 软骨生成分化培养基 | Lonza Inc. | CC-3226（基础培养基） | |
| CC-4408（添加剂） | |||
| 人关节软骨细胞 | Lonza Inc. | CC-2550 | |
| Dapi（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐） | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy 小量试剂盒（用于RNA提取） | Qiagen | 74104 | |
| PCR试剂：SYBR Green | Quanta Biosciences | 95053-500 | |
| 12 ml 注射器 | Tyco Healthcare, Covidien | 512852 | |
| 22 号皮下注射针头 | Tyco Healthcare, Covidien | 8881 | |
| 显微镜 | Olympus Corporation | IX71 | |
| 平台摇床 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Vari-mix | |
| II型胶原正向引物 | 5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’ | ||
| II型胶原反向引物 | 5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’ | ||
| MMP13 正向引物 | 5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’ | ||
| MMP13 反向引物 | 5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’ | ||
| Caspase 3 正向引物 | 5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’ | ||
| Caspase 3 反向引物 | 5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’ |
参考文献
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E.
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