本报告中，我们描述了一种 crush 小鼠坐骨神经的方法。该方法使用常规可得的止血钳，能够简便、可重复地实现完全的坐骨神经 crush。此外，我们还介绍了一种制备肌肉全装片的方法，适用于在坐骨神经 crush 后对神经再生进行分析。
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方法文章
可重复的小鼠坐骨神经挤压损伤模型及通过完整肌肉标本分析评估再生 关键词：小鼠，坐骨神经，神经挤压，神经再生，完整肌肉标本，神经功能评估
本文内容
摘要
摘要
周围神经系统（PNS）中的再生现象被广泛研究，不仅因其与人类疾病密切相关，也因为PNS神经元具有强大的再生能力，这可能有助于揭示中枢神经系统（CNS）再生失败的原因1。坐骨神经 crush（轴突断裂，axonotmesis）是啮齿类动物中最常见的周围神经损伤模型之一2。压迫损伤可中断所有轴突，但施万细胞的基底膜得以保留，从而使再生达到最佳状态3,4。这种方法使研究者能够精确研究生长中的轴突与施万细胞及基底膜之间的相互作用4。通常，大鼠是实验性神经压迫研究的首选动物模型。它们来源广泛，其受损的坐骨神经能较好地模拟人类神经损伤情况5,4。尽管小鼠神经比大鼠小，但具有许多相似的特性。更重要的是，由于目前转基因小鼠品系丰富，小鼠模型在深入解析神经再生关键分子机制方面的价值日益凸显6, 7。以往的研究者曾采用多种方法制造神经压迫或损伤，包括使用简单斜角镊子、冷却镊子、止血镊、血管夹以及自行设计的夹具8,9,10,11,12。研究者还使用了多种标记损伤部位的方法，如缝线标记、碳颗粒和荧光微珠13,14,1。本文描述了一种利用精细止血镊进行可重复且完全的坐骨神经压迫，并结合碳颗粒对压迫部位进行准确、持久标记的方法。在描述坐骨神经压迫操作的过程中，我们还介绍了一种相对简单的肌肉全组织制片方法，用于后续定量评估神经再生情况。
方案
1. 动物实验对象
1.1. 治疗
- 所有动物实验均应获得当地机构动物护理与伦理委员会的批准，并遵循国家卫生研究院的使用指南和委员会规定，同时采取措施尽量减少动物的疼痛与不适。
- 我们的小鼠饲养在温度受控的环境中，采用12小时颠倒光照周期，并可自由摄取小鼠饲料和饮水。
- 在进行成年小鼠再生研究时，实施坐骨神经 crush 损伤时小鼠年龄应至少为6周。此年龄已超过多神经支配的神经肌肉接头发生修剪的时间点。
- 在本实验中，我们使用了来自 Charles River 的6至8周龄 C57BL/6 小鼠。当比较坐骨神经 crush 损伤后的再生能力（即轴突生长速率）时，应使用相同品系的小鼠，因为不同近交品系之间在轴突再生能力上已观察到差异15,16。若使用基因改造小鼠，最合适的对照是同窝出生的对照小鼠。
1.2. 手术准备
- 通过腹腔注射给予动物混合制剂（氯胺酮 100 mg/kg 和赛拉嗪 10 mg/kg）以实现手术所需的深度麻醉。同时，每只动物均接受皮下注射美洛昔康（10 mg/kg），以减轻术后疼痛。
- 使用外科剪刀（Roboz, RC-5903）仔细剃除双侧后肢毛发，并配合市售脱毛膏（Nair 脱毛霜）完成脱毛。
- 采用无菌棉签蘸取聚维酮碘外科洗手液（Fisher Scientific, 19066452）对皮肤进行清洁消毒。
- 使用无菌棉签将眼用软膏（Fisher Scientific, 19082795）涂抹于眼睛表面，防止角膜干燥。
- 将小鼠置于洁净的不锈钢板上，板下放置预热的恒温加热毯系统（Harvard Apparatus, 507222F），以维持动物体温在 37°C。
- 用胶带固定所有四肢，注意对称摆放后肢，使膝关节与身体呈直角（图 1，图版 A）。
- 手术区域覆盖无菌手术巾。所有手术器械均通过高压灭菌或干热灭菌珠（Fine Science Tools, 18000-45）进行消毒，术者佩戴口罩、手术衣及无菌手套。
2. 可重复的坐骨神经挤压损伤
- 制备完成后，在皮肤上沿中线做一弧形切口（图1）。将皮肤轻柔地从下方肌肉组织上分离，并向外翻折以在操作过程中保持无遮挡。操作过程中使用0.1 mL无菌生理盐水（Hospira, 0409-4888-20）定期润湿皮肤以保持湿润。
- 打开臀大肌与股二头肌前头之间的筋膜平面，暴露出坐骨神经（图1，面板A）。作为手术对照，应暴露并游离对侧坐骨神经，但保持其完整。随后使用6-0编织丝线、不可吸收缝线（Roboz, SUT-1073-11）将臀部肌肉重新对合并缝合。
- 以相同方式暴露实验侧坐骨神经，并使用牵开器以改善视野（图1，面板B）。使用前应对牵开器进行灭菌。
注意：尽管市面上有商用牵开器系统，但通常价格昂贵。我们使用低成本五金材料和昆虫针自行制作了一套有效的牵开器系统（详见材料部分）。 - 使用虹膜剪轻柔地将坐骨神经从周围结缔组织中游离出来。
- 使用精细5/45镊子（Fine Science Tools, 11251-35）将神经置于超细止血钳（Fine Science Tools, 13020-12）的下钳叶上。三个神经束应依次排列，不可重叠（图1，插图B）。止血钳在距尖端1.5 mm处刻有标记线。在实施压迫前，将坐骨神经最外侧部分对齐该标记线。这可确保压迫宽度一致，并防止神经在受压扁平化后超出止血钳钳叶范围。若神经超出钳尖，则仅会部分受压。
- 压迫方向垂直于神经，位置位于距第三趾45 mm处，通过一根沿坐骨神经走行路径的细线测量确定。使用止血钳在3档压力下一次性压迫15秒。操作时注意避免牵拉神经。当止血钳重新打开后，整个压迫部位应呈现透明状。
- 使用第二把预先浸入碳粉（Fisher Scientific, C272-500）的相同止血钳标记压迫部位。在同一压迫位置以3档压力再次压迫15秒。碳标记不应超出初始压迫区域边界。若需精确定位压迫部位，此步骤尤为关键。使用前，碳粉经紫外线照射两小时灭菌，并始终采用无菌操作技术处理。
- 为在避免手术区域广泛污染碳粉的前提下完成预浸，将止血钳张开后浸入碳粉，再轻轻闭合（但不锁紧），随后用无菌纱布擦去钳体外表面的多余碳粉。在至少3倍放大镜下检查，确认钳叶压迫面均匀覆盖碳粉。如有必要，可重复浸蘸并擦拭。
- 臀部肌肉以与对侧相同方式重新对合并缝合。
- 最后，使用9 mm回弹式夹（World Precision Instruments, 500346；施夹器：500345）闭合皮肤切口。若发现9 mm夹限制动物活动，可改用较小尺寸回弹夹或6-0缝线（Roboz, SUT-1073-11）。
3. 术后护理
- 按照操作步骤，将动物置于37°C的加热垫上，直至其出现活动迹象。
- 随后将其移回原饲养笼中，笼内地面放置水凝胶和湿润饲料，便于动物随时获取水和食物。
4. 半薄切片制备
- 过量注射戊巴比妥钠（300 mg/kg）后，去除腿部肌肉以暴露坐骨神经*。保持神经原位，将后肢浸入含2%多聚甲醛和2%戊二醛的0.1 M磷酸盐缓冲液中，置于冰上固定30分钟。
*若进行整体肌肉制备，应在暴露坐骨神经前先取材肌肉。 - 小心取出神经，操作时仅接触其近端。随后将神经在相同固定液中继续后固定3小时。
- 固定完成后，用0.1 M磷酸盐缓冲液冲洗神经三次。
- 将神经浸入含2%四氧化锇的0.1 M磷酸盐缓冲液中1小时。
- 随后通过依次浸入浓度递增的乙醇（50%、70%、80%、95%、100%、100%、100%）进行脱水，每次浸泡15分钟。
- 脱水后的神经在丙烯氧化物中孵育两次，每次3分钟。
- 然后将神经浸入丙烯氧化物与Embed 812按1:1比例配制的混合液中至少6小时（通常过夜）。
- 再将神经浸入丙烯氧化物与Embed 812按2:1比例配制的混合液中过夜。
- 最后，将神经浸入纯Embed 812中6小时，随后置于适当模具中包埋，并在60°C下烘烤48小时。
- 使用Leica Ultracut UCT超薄切片机配合玻璃刀，从压伤部位一定距离处的远端神经残端切取1.0 μm切片，并用甲苯胺蓝染色。也可制备超薄切片，用于透射电子显微镜下观察超微结构。
5. 全肌组织制备
- 首先，使用过量戊巴比妥（300 mg/kg）处死小鼠，并在膝关节处切除后肢。
- 取后肢中的四块肌肉进行分析：胫骨前肌（TA）、趾长伸肌（EDL）、比目鱼肌和腓骨长肌。
- 所有肌肉均通过精细解剖取出，并通过其结缔组织固定在涂有黑色硅胶（Sylgard）（Fisher Scientific，NC9492579）的培养皿上。用PBS冲洗后，再用4%多聚甲醛固定30分钟。
- 随后将TA用PBS冲洗，包埋于O.C.T.（Fisher Scientific，14-373-65）中，并在丙酮与干冰混合液中快速冷冻。
- 保存于-80 °C，以备薄切片使用，以防整体装片制备失败。通常情况下，TA过厚，难以获得理想的整体装片。
- EDL、比目鱼肌和腓骨长肌用PBS冲洗3次，每次10分钟，随后置于0.1 M甘氨酸*（Fisher Scientific，AC12007-0010；用PBS稀释）中30分钟，再用PBS冲洗3次，每次10分钟。然后在冰冻的100%甲醇中于-20°C条件下淬灭精确5分钟，再次用PBS冲洗3次，每次10分钟，接着在荧光标记的α-银环蛇毒素（以PBS按1:200稀释）中孵育30分钟。肌肉用PBS冲洗3次，每次10分钟，随后在含2% BSA（KPL，50-61-00）和0.2% Triton X-100（Dot Scientific Incorporated，9002-93-1）的PBS*中封闭1小时，并在4°C条件下与一抗混合液（用相同的2% BSA/0.2% Triton封闭液稀释）一起轻轻振荡孵育过夜。
*甘氨酸溶液及封闭液均在肌肉取材当天配制，并在室温下搅拌30–60分钟后再使用。- 为标记轴突和神经肌肉突触，我们联合使用小鼠单克隆神经丝蛋白抗体（Covance，SMI-312R；1:1000稀释）、小鼠单克隆突触小泡标志物抗体（SV2 DSHB，1:1000稀释）以及罗丹明标记的α-银环蛇毒素（Sigma-Aldrich，1:200稀释）。为标记反应性施万细胞，使用兔抗GAP-43抗体（Novus Biologicals，NB300-143，1:500稀释）。一抗通过IgG1亚型特异性的荧光素标记山羊抗小鼠二抗和DyLight 649标记的驴抗兔二抗（Jackson ImmunoResearch，1:200稀释）进行可视化。
- 次日，肌肉用PBS冲洗3次，每次10分钟，然后在含2% BSA/0.2% Triton的封闭液中以1:200稀释的二抗中孵育。随后用PBS冲洗2次，每次10分钟，接着浸入DAPI（Invitrogen，D3571；用去离子水稀释至300 nM）中5分钟，最后再用PBS冲洗10分钟。
- 每块肌肉随后置于涂有黑色硅胶（Sylgard）（Fisher Scientific，NC9492579）的培养皿中进行解剖。首先在肌腱插入点处切除肌腱，然后通过剥离内部肌纤维使肌肉变薄（图3，A-C图）。操作过程中需注意保护肌肉的外表面，包括终板带区域（图3，D-F图）。处理后的肌肉置于载玻片（Fisher Scientific，12-550-15）上，使用Vectashield封片剂（Vector Laboratories，H-1000）和22 × 40 mm盖玻片（Fisher Scientific，12-548-5C）封片，两侧用透明指甲油密封。正确装片时，终板带应紧贴盖玻片。
6. 测量再生
- 可在所有三种肌肉（腓骨肌、EDL 和比目鱼肌）中评估再生情况。我们通常在神经 crush 损伤后 14 天检查再生情况，此时已有相当比例的神经肌肉接头（NMJ）实现再支配。根据具体科学问题，也可选择更早或更晚的时间点。在每种肌肉中，均检查整个终板带的再支配情况。仅对表面正视的神经肌肉接头进行评分。采用此方法，每种肌肉可快速检查至少 200 个神经肌肉接头。
- 为评估肌肉再支配，我们计算“再支配比率”。分母为去神经支配的神经肌肉接头数量，通过 α-银环蛇毒素结合和施万细胞 GAP-43 免疫反应性标记；分子为再支配的神经肌肉接头数量，通过神经丝蛋白/SV2 免疫反应性标记。如有需要，可将神经肌肉接头分为部分再支配（SV2 对 α-银环蛇毒素标记区域覆盖不完全）或完全再支配（SV2 对 α-银环蛇毒素标记区域完全覆盖）。有关再支配与去神经支配神经肌肉接头的示例，请参见图 3 的 G 和 H 面板。
7. 代表性结果
图1. 与神经挤压相关的后肢解剖示意图。 A. 已做半圆形皮肤切口，暴露出下方肌肉组织。 B. 臀部肌肉已被分离，坐骨神经暴露（见上述步骤2.4）。箭头指示大致的挤压位置。牵开器的位置仅作为一般性参考，在每次手术中可根据实际情况调整，以利于坐骨神经的观察以及止血钳接近进行挤压操作。 B（插图）： 挤压前坐骨神经置于止血钳下钳口的位置（见上述步骤2.5）。图中标注了不同的神经束，以显示在挤压过程中它们彼此水平相邻，而非垂直排列。尽管本图仅标注了三个神经束，但有时还可观察到第四个神经束，即腓总神经的关节支。如需了解挤压点远端坐骨神经束分支模式的更详细解剖图示，请参见Greene的《大鼠解剖学》，图18817。
图 2. 原位的碳标记压伤部位及经甲苯胺蓝染色的坐骨神经半薄切片。A. 原位压伤部位示例（左后肢）。黑色碳标记表示压伤部位。星号标记了支配大腿肌肉的胫神经分支，在压伤手术中可作为有用的解剖标志。坐骨神经的胫神经分支以蓝色轮廓标出，腓神经以绿色标出，腓肠神经以黄色标出。B. 半薄切片显示使用止血钳实施的完全性压伤。C. 半薄切片显示使用斜头钳实施的不完全性压伤。两幅图像中，变性的髓鞘结构均以箭头头标记。C 图中箭头标记了保留的髓鞘结构示例及一簇幸存的轴突。比例尺为 10 μm。
图3. 整体肌肉示意图及代表性神经肌肉接头 A-C： EDL 的渲染图像（A），腓骨长肌（B）和比目鱼肌（C) 从后肢取出后的肌肉。图示肌肉来自 右侧 后肢。膝关节和踝关节的解剖方位也一并标出以作参考。位于肌肉表层的肌腱以白色显示，并用实心黑色线条勾勒；当肌腱延伸至肌肉下方时，则以黑色虚线勾勒。红色虚线表示切割位置。如蓝色箭头所示，从切割部位将肌肉剥离，并进一步削薄。削薄后，通过切断残留的被固定肌腱部分，将肌肉与固定针分离。 D-F： 去除结缔组织并进一步薄化后，对完整肌肉样本进行成像。每块肌肉上的终板带均已标出。 G-H： 坐骨神经挤压伤后14天的比目鱼肌整体封片，显示再神经支配（G) 及去神经支配的（H神经肌肉接头。在这些图中，神经肌肉接头、轴突和施万细胞的可视化方法如上文5.5.1节所述。乙酰胆碱受体呈红色，轴突呈绿色，施万细胞突起呈蓝色。在图中 G，箭头指示的是由轴突重新支配的神经肌肉接头区域。在图中 H 箭头指示 GAP-43 阳性的施万细胞突起。注意轴突的缺失。比例尺为 10 μm.
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讨论
我们介绍了一种可可靠实现坐骨神经完全性压榨损伤并精确定位压榨部位的方法。如前所述，坐骨神经压榨是小鼠和大鼠外周神经损伤的常用模型。尽管每种压榨方法各有优缺点，但我们发现该方法能够产生完全的神经压榨，且仅需最少的特殊设备（例如特殊夹具等），即可方便地标记压榨位置。
破碎方法
用于小鼠坐骨神经挤压最常用的器械是5号斜头镊。虽然使用该方法有可能实现完全挤压，但我们发现该器械产生的挤压效果不稳定（用力过小会导致部分轴突残留，用力过大则会撕裂神经），尤其是在新手操作时更为明显。
其他较少使用的制备压伤的方法包括小型动脉瘤夹、浸于液氮中冷却的镊子，以及专门制造的、经过校准的无齿钳9,12,5,7。这些器械均可稳定地产生完全压伤。我们选择止血镊是因为该器械易于获取，可产生可靠的压伤，并且便于清晰标记压伤部位。止血镊的一个缺点是无法直接测量压伤过程中施加的力。然而，一旦经过验证，止血镊便能稳定地产生完全压伤；若镊子损坏，也可轻松更换为相同的镊子。
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）K08NS065157 基金（授予 T.A.F.）的支持。此外，美国国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所（National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases）资助的宾夕法尼亚大学肌肉骨骼疾病中心（Penn Center for Musculoskeletal Disorders）项目（资助编号：P30AR050950）也为本研究提供了支持（T.A.F. 和 Steven S. Scherer）。最后，Shriners 儿科研究中心的种子基金（T.A.F.）也资助了本研究。我们感谢 Young-Jin Son 博士首次演示了整体封片技术，同时感谢 Amy A. Kim 在绘制图1示意图过程中提供的帮助。
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