方法文章

重复性小鼠坐骨神经挤压和再生的后续评估整装肌肉分析

DOI:

10.3791/3606

2012年2月22日

本文内容

摘要

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在这份报告中,我们描述了一种方法来粉碎小鼠坐骨神经。这种方法使用现成的止血钳和轻松,重现产生完整的坐骨神经。此外,我们描述了一种方法来准备适合分析坐骨神经后神经再生肌肉整个坐骑。

摘要

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再生周围神经系统(PNS)被广泛研究人类疾病的相关了解PNS的神经元,从而有可能阐明中枢神经系统再生1失败安装强大的再生反应。坐骨神经(axonotmesis)的是在啮齿类动物2周围神经损伤的最常见的车型之一。粉碎中断所有轴突,但雪旺氏细胞基部叶片,使再生的最佳3,4保留。这使得研究者,研究正是越来越轴突的互动能力与雪旺氏细胞和基底椎板4。大鼠一般都首选的动物模型实验神经压榨。它们被广泛使用,其损毁坐骨神经提供了一个合理的近似人类神经病变5,4。虽然在规模小于大鼠神经,鼠神经有许多相似的特质。但最重要的,谅解备忘录E型是由于转基因株系的广泛的可用性日益成为宝贵的,现在允许一个关键的单个分子神经再生6,7的详细解剖。此前研究者已经使用了多种方法来产生神经挤压或损伤,包括简单的直角钳,冷藏镊子,止血钳,血管钳,研究者设计的夹8,9,10,11,12。研究者还利用各种方法标记的损伤部位,包括缝合,碳粒子和荧光珠13,14,1。我们描述的方法来获取准确和持久性标志的使用罚款的止血钳和随后的碳爱恋标志着网站的爱恋现场1再现完整的坐骨神经。作为我们描述的坐骨神经过程的一部分,我们还包括肌肉整体的一个比较简单的方法安装,我们使用到随后量化再生。

方案

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1。动物主题

1.1。治疗

  1. 所有动物的程序应与本地机构的动物护理和伦理委员会的批准,并按照使用和卫生准则委员会和国家机构,采取措施以减少疼痛和不适。
  2. 我们的小鼠饲养温度控制在12小时的反向光明与黑暗周期条件下,而美联储鼠标议员和水随意。
  3. 对于成人再生的研究,老鼠应该是年龄至少6周时,坐骨神经进行。这个年龄段是超出修剪polyneural神经肌肉接头时发生的时间。
  4. 在这些实验中,我们用6-8周龄的C57BL / 6小鼠,从查尔斯河收购。当比较后坐骨神经再生(即:轴突生长率)应该是相同的小鼠品系,为轴突再生的差异已经不不同的近交系15,16之间。如果要使用小鼠基因操纵,窝控制是最合适的。

1.2。术前准备

  1. 动物深感麻醉手术通过腹腔注射氯胺酮(100毫克/千克)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤)的鸡尾酒。每个动物也收到了美洛昔康皮下注射(10毫克/公斤),以减少手术后的疼痛。
  2. 都躯仔细剃光使用外科快船(Roboz,RC-5903)和脱毛奈尔脱毛膏(在当地的药店)完成的。
  3. 使用无菌棉头涂药器和手术优碘擦洗尔科技(19066452),皮肤洁净。
  4. 眼药膏(费希尔科学,19082795)被应用到眼睛,用无菌棉头涂药器。
  5. 鼠标被放置在一个干净的不锈钢板,....

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讨论

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我们已经提出了一个方法来获取可靠完整的坐骨神经与精确标记的美眉现场。如前所述,坐骨神经是一种常见的周围神经损伤的小鼠和大鼠模型。虽然每个美眉的方法都有其优点和缺点,我们发现,这种方法产生一个完整的挤压,很容易被一个特殊的设备(如特殊夹具等)的最低标记。

粉碎方法

仪器用于小鼠坐骨神经的最常见的是5号直角钳。虽然它有可能获得一个完整的压榨,用这种方法,我们发现,这种仪器产生,尤其是在一个新的用户手中变量美眉(太少的力量离开幸免轴突或神经太大撕裂),。

其他不常见的方法,用于生产挤压包括小动脉瘤夹,在液氮冷却的镊子,并speciallŸ制造,校准,无锯齿夹9,12,5,7。这些文书的每个人都可以可靠地产生一个完整的迷恋。我们选择了止血钳,因为仪器是很容易获得,产生一个可靠的挤压,和允许的美眉网站的明确标志。止血钳的一个缺点是,我们不能轻易衡量粉碎过程中产生的力。然而,一次测试,止血钳将可靠地产生一个完整的美眉,可以很容易地替换相同的镊子如果镊子被损坏。

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披露

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我们什么都没有透露。

致谢

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这项工作是由国家卫生研究院资助K08NS065157(TAF),此外支持,宾夕法尼亚肌肉劳损,关节炎研究所奖号码P30AR050950,肌肉骨骼及皮肤疾病(TAF和史蒂文与舍雷尔)支持这项工作。最后,施赖纳斯儿科研究中心种子资金(TAF),支持这项工作。我们要感谢年轻的博士,金的儿子,初步证明她的援助,在整个安装过程和Amy A.金生产的草图图1。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
名称(描述/数量) 供应商 目录编号
迷你快船号0000刀片 roboz RC-5903
奈尔头发卸妆(9盎司) 教会和德怀特有限公司,公司 N / A
优碘外科磨砂(1加仑) Fisher Scientific则 19066452
眼药膏(1盎司) Fisher Scientific则 19082795

手术工具:

名称(描述/数量) 供应商 目录编号
福斯特250热珠消毒罚款科学工具 18000-45
虹膜剪刀(11厘米长) 世界精密仪器 500216
帕兹 - 史密斯钳(直;18厘米的; 1X2牙) 罚款科学工具 11024-18
麦克弗森Vannas剪刀(5毫米刀片) 世界精密仪器 14124 - G
杜蒙#5镊子 - Dumoxel标准提示罚款科学工具 11252-30
杜蒙#5/45钳 - Dumoxel小费标准罚款科学工具 11251-35
精细止血超(直光滑的内表面) 罚款科学工具 13020-12
粉末活性炭(500克) Fisher Scientific则 C272-500
大小6-0缝线的C-1针(不育,丝绸,黑色,编织,非吸收性; 18“的长度;盒36) roboz 位SUT-1073-11
反射的剪辑APPLIER(9毫米剪辑) 世界精密仪器 500345
9mm不锈钢的反射剪辑(100/box) 世界精密仪器 500346

动物护理:

名称(描述/数量) 供应商 目录编号
0.9%氯化钠注射液(不含防腐剂; 20毫升) Hospira公司 0409-4888-20
完整的柔性探头Homeothermic毛毯系统(中等,115伏,60赫兹) 哈佛仪器 507222F

手术Platform和拉钩:

(在当地的五金商店购买)

名称(描述/) 数量
不锈钢平台(铣削〜12“X12”X1 / 8“) 1
按钮磁铁(例如:Eclipse的E825) 3
不锈钢螺栓(长3“按钮磁铁决心直径) 3
不锈钢螺母(大小以适合螺栓) 9
橡皮筋(轻张力) 3
昆虫销(两端弯曲,形成挂钩) 3

半变薄:

名称(描述/数量) 供应商</ STRONG> 目录编号
多聚甲醛(1公斤) Sigma-Aldrich公司 P6148-1KG
无水磷酸氢钠(500克;用于制备磷酸盐缓冲液) Fisher Scientific则 S375-500
无水磷酸二氢钠(1公斤;用于制备磷酸盐缓冲液) Fisher Scientific则 AC38987-0010
戊二醛(50%; 10×10毫升) 特德·佩拉,公司 18431
四氧化锇(4%水溶液,10×10毫升) 特德·佩拉,公司 18465
环氧丙烷(450毫升) 特德·佩拉,公司 18601
嵌入812(包,硬质块/图像对比度高) 电子显微镜科学 14120
toluidiNE蓝(25克) 特德·佩拉,公司 19451

整个山肌肉的制备及免疫组化:

名称(描述/数量) 供应商 目录编号
多聚甲醛(1公斤) Sigma-Aldrich公司 P6148-1KG
无水磷酸氢钠(500克;用于制备磷酸盐缓冲液) Fisher Scientific则 S375-500
无水磷酸二氢钠(1公斤;用于制备磷酸盐缓冲液) Fisher Scientific则 AC38987-0010
10%BSA稀释液/封闭液(200毫升)

kirkegaard佩里实验室,公司 50-61-00
的Triton X-100(100毫升) 点科技有限公司的 9002-93-1
甘氨酸,98%(1公斤) Fisher Scientific则 AC12007-0010
组织TEK的Cryo-OCT复合(12个案例; 4盎司瓶) Fisher Scientific则 14-373-65
sylgard陶氏170(2磅包) Fisher Scientific则 NC9492579
不锈钢昆虫销,大小为1(100/pkg) 罚款科学工具 26001-40
四甲-A银环蛇毒素(0.5毫克) Sigma-Aldrich公司 T0195-.5MG
单克隆抗体对SMI-312(0.1毫升) Covance公司 SMI-312R
单克隆抗体反对SV2(0.1毫升) 发展研究杂交瘤细胞银行(DSHB) SV2
兔聚GAP-43单克隆抗体对 Novus公司生物制品 NB300-143
flourescein标记的羊抗鼠IgG,Fcγ小类1比杰克逊ImmunoResearch 11 5-095-205
DyLight 649共轭的驴抗兔IgG 杰克逊ImmunoResearch 711-495-152
4',6-diamidino-2-苯基吲哚(DAPI,dilactate; 10毫克) Invitrogen公司 D3571
vectashield安装介质(10毫升) 媒介实验室的H-1000
superfrost加上载玻片(白尺寸:75×25毫米; 144包) Fisher Scientific则 12-550-15
高级盖眼镜fisherfinest(尺寸:40×22毫米; 1盎司包。) Fisher Scientific则 12-548-5C

参考文献

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  1. Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo. J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).
  2. Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D.

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