我们优化了一种微胶囊化技术，作为胚胎干细胞向内胚层和多巴胺能（DA）神经元增殖与分化的有效三维平台。该技术还可在细胞移植过程中实现细胞与宿主之间的免疫隔离。此平台也可适用于其他类型的细胞。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
人类胚胎干细胞（hESC）作为一种极具吸引力的细胞替代疗法来源正在兴起，因为它们可以在体外培养中无限扩增，并分化为体内任何类型的细胞。在干细胞培养中，多种类型的生物材料也被用于构建模拟干细胞微环境的体系1-3。后者对于促进细胞间的相互作用、细胞增殖以及向特定谱系分化和组织结构形成具有重要意义，其机制在于提供一种三维（3D）环境4，例如细胞封装技术。细胞封装的基本原理是将活细胞包埋于半透膜内，在三维培养体系中实现物理限制2。这些半透膜允许营养物质、氧气和信号分子自由通过，而宿主中大于微胶囊孔径的抗体和免疫细胞则被阻隔在外5。本文介绍了一种利用海藻酸盐微胶囊在三维微环境中培养并诱导hESC分化为多巴胺能（DA）神经元的方法。我们已对培养条件2进行了优化，以提高封装后hESC的存活率。我们先前的研究表明，在该三维培养平台上添加p160-Rho相关卷曲螺旋激酶（ROCK）抑制剂Y-27632以及人胎儿成纤维细胞条件培养的血清替代物（hFF-CM），可显著提升封装hESC的存活率，且这些细胞表达了定型内胚层标志基因1。目前，我们已将该三维平台应用于hESC的扩增及其向DA神经元的高效分化。在完成DA神经元分化的最终阶段后，蛋白和基因表达分析显示，多巴胺能神经元标志物——酪氨酸羟化酶（TH）的表达水平在两周内提高了>100倍。我们推测，基于海藻酸盐微胶囊构建的这一三维培养平台可能有助于研究hESC向多种谱系的增殖与定向分化过程。此外，该三维系统可在分化过程中实现饲养层细胞与hESC的物理分离，并在未来移植应用中具备免疫隔离的潜力。
方案
以下所有操作均在 II 级生物安全柜内采用无菌技术进行。所用试剂和设备列于下表中。
1. 1.1% 海藻酸钠溶液（w/v）的制备
- 取0.275 g纯化的海藻酸钠（高甘露糖醛酸含量≥60%，黏度>200 mPa·s，内毒素≤100 EU/g）加入无菌50 ml离心管中，再加入25 ml先前配制的无菌0.1%明胶溶液（0.5 g明胶溶于500 ml Milli-Q H2O，经高压灭菌溶解）。
- 涡旋振荡管子约30秒以初步溶解海藻酸钠粉末，随后将管子置于轨道混合器上，10 × g条件下过夜孵育（室温）。
- 向25 ml海藻酸钠溶液中加入2.778 ml无菌9% NaCl溶液（4.5 g NaCl溶于50 ml Milli-Q H2O）。涡旋振荡约30秒后，于95 × g离心5分钟。
- 海藻酸钠溶液可短期储存于4 °C（1–2个月），或长期储存于-20 °C（约一年）。
2. CaCl₂的制备2 沉淀浴
- 将14.7 g的CaCl2.2H2O和2.38 g HEPES溶解于1升milli-Q H2O中。
- 调节pH值至7.4。
- ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
多项利用小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞的研究已证明，三维培养系统在生物材料和组织工程中的优势2,3我们采用海藻酸钙微胶囊作为合适的三维平台，以研究人胚胎干细胞（hESC）的扩增和分化，相较于海藻酸钡微胶囊，因为hESC在海藻酸钙中封装后表现出显著更高的存活率。该培养系统还支持高密度细胞培养，并允许营养物质和氧气通过膜进行有效交换。7在胶囊内已观察到自发性分化现象，推测未分化的hESC在胶囊内持续增殖后，最终会突破胶囊形成畸胎瘤。1另一种包封技术的临床应用是为移植细胞提供免疫保护，使其免受宿主免疫系统的攻击。预计人胚胎干细胞（hESC）及其分化衍生物在移植后可能引发免疫排斥反应，因为未分化hESC的MHC I类抗原表达水平较低，而在分化后其表达水平会升高8. 据报道，移植通常使用较高浓度的海藻酸盐，以避免免疫排斥反应2,9. 本研究采用较低浓度的海藻酸盐（1.1%），更适用于 体外 hESC 的培养与分化。目前尚不确定，我们所使用的较低浓度海藻酸盐是否会在这些包封的 hESC 移植到免疫活性宿主时，引发与先前报道相.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
我们无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由澳大利亚国家健康与医学研究委员会项目资助（NHMRC Program Grant #568969，PSS）以及新南威尔士大学医学院干细胞计划（KSS）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 海藻酸钠（Pronova UP MVG） | NovaMatrix | 4200101 | 高葡萄糖醛酸含量 ≥60%，黏度 >200 mPa s，和内毒素 <100 EU/g |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| J1型微珠发生器 | Nisco Engineering Inc | SPA-0447 | |
| 多通道注射泵 | 新时代 | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical 流量计 | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | 默克 & Co., Inc. | 688000 | |
| 人血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G × 2” 静脉导管 | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | 用于SR培养基（基础） |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | 对于SR培养基（2 mM） |
| 无血清替代物 | Invitrogen | 10828-028 | 对于SR培养基（20%） |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15070063 | 对于SR培养基（2.5 U/ml） |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS） | Invitrogen | 41400045 | 对于SR培养基（1x） |
| β巯基–乙醇 | Invitrogen | 21985-023 | 对于SR培养基（0.1 mM） |
| MEM NEAA 溶液 | Invitrogen | 11140-050 | 对于SR培养基（5 mM） |
| 格拉斯哥最低必需培养基 | Invitrogen | 11710035 | 用于多巴胺能神经元分化培养基（基础） |
| 无血清替代物 | Invitrogen | 10828-028 | 用于多巴胺能神经分化培养基（10%） |
| 丙酮酸钠 | Invitrogen | 11360070 | 用于多巴胺能神经分化培养基（1 mM） |
| MEM非必需氨基酸溶液 | Invitrogen | 11140-050 | 用于多巴胺能神经分化培养基（0.1 mM） |
| β巯基–乙醇 | Invitrogen | 21985-023 | 用于多巴胺能神经分化培养基（0.1 mM） |
| 音猬因子（SHH） | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | 用于多巴胺能神经元分化（100 ng/ml） |
| 成纤维细胞生长因子8a（FGF8a） | R&D Systems | 4745-F8-050 | 用于多巴胺能神经分化（100 ng/ml） |
参考文献
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Diffe....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
