海藻酸盐微胶囊作为人胚胎干细胞（hESC）向不同谱系扩增与分化的三维平台

摘要

我们优化了一种微胶囊化技术，作为胚胎干细胞向内胚层和多巴胺能（DA）神经元增殖与分化的有效三维平台。该技术还可在细胞移植过程中实现细胞与宿主之间的免疫隔离。此平台也可适用于其他类型的细胞。

摘要

人类胚胎干细胞（hESC）作为一种极具吸引力的细胞替代疗法来源正在兴起，因为它们可以在体外培养中无限扩增，并分化为体内任何类型的细胞。在干细胞培养中，多种类型的生物材料也被用于构建模拟干细胞微环境的体系^1-3。后者对于促进细胞间的相互作用、细胞增殖以及向特定谱系分化和组织结构形成具有重要意义，其机制在于提供一种三维（3D）环境⁴，例如细胞封装技术。细胞封装的基本原理是将活细胞包埋于半透膜内，在三维培养体系中实现物理限制²。这些半透膜允许营养物质、氧气和信号分子自由通过，而宿主中大于微胶囊孔径的抗体和免疫细胞则被阻隔在外⁵。本文介绍了一种利用海藻酸盐微胶囊在三维微环境中培养并诱导hESC分化为多巴胺能（DA）神经元的方法。我们已对培养条件²进行了优化，以提高封装后hESC的存活率。我们先前的研究表明，在该三维培养平台上添加p160-Rho相关卷曲螺旋激酶（ROCK）抑制剂Y-27632以及人胎儿成纤维细胞条件培养的血清替代物（hFF-CM），可显著提升封装hESC的存活率，且这些细胞表达了定型内胚层标志基因¹。目前，我们已将该三维平台应用于hESC的扩增及其向DA神经元的高效分化。在完成DA神经元分化的最终阶段后，蛋白和基因表达分析显示，多巴胺能神经元标志物——酪氨酸羟化酶（TH）的表达水平在两周内提高了>100倍。我们推测，基于海藻酸盐微胶囊构建的这一三维培养平台可能有助于研究hESC向多种谱系的增殖与定向分化过程。此外，该三维系统可在分化过程中实现饲养层细胞与hESC的物理分离，并在未来移植应用中具备免疫隔离的潜力。

方案

以下所有操作均在 II 级生物安全柜内采用无菌技术进行。所用试剂和设备列于下表中。

1. 1.1% 海藻酸钠溶液（w/v）的制备

1. 取0.275 g纯化的海藻酸钠（高甘露糖醛酸含量≥60%，黏度>200 mPa·s，内毒素≤100 EU/g）加入无菌50 ml离心管中，再加入25 ml先前配制的无菌0.1%明胶溶液（0.5 g明胶溶于500 ml Milli-Q H₂O，经高压灭菌溶解）。
2. 涡旋振荡管子约30秒以初步溶解海藻酸钠粉末，随后将管子置于轨道混合器上，10 × g条件下过夜孵育（室温）。
3. 向25 ml海藻酸钠溶液中加入2.778 ml无菌9% NaCl溶液（4.5 g NaCl溶于50 ml Milli-Q H₂O）。涡旋振荡约30秒后，于95 × g离心5分钟。
4. 海藻酸钠溶液可短期储存于4 °C（1–2个月），或长期储存于-20 °C（约一年）。

2. CaCl₂的制备₂ 沉淀浴

1. 将14.7 g的CaCl₂^.2H₂O和2.38 g HEPES溶解于1升milli-Q H₂O中。
2. 调节pH值至7.4。
3. 使用0.22 μm滤器对溶液进行除菌。
4. 沉淀浴可在室温下保存（6–12个月）。

3. 脱壳溶液的制备

1. 在500 ml杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）中，加入50 ml 0.5 M EDTA和5 ml 1 M HEPES。
2. 使用0.22 μm滤器过滤灭菌，或在121 °C下高压灭菌20分钟。
3. 将去囊溶液在室温下保存（6–12个月）。

4. 血清替代物（SR）培养基的制备

1. 在包封之前，按照特定试剂和设备表中的说明预先准备SR培养基。

5. ROCK抑制剂（Y-27632）的配制

1. 将Y-27632粉末用含0.1%人血清白蛋白（HSA）的D-PBS稀释，配制成5 mM的溶液。

6. 胚胎干细胞封装前的准备

1. 在 37 °C 条件下，用添加了 10 μM ROCK 抑制剂（RI）的培养基对细胞进行预处理，持续两小时（避光）。
2. RI 处理后，用 D-PBS 洗涤细胞两次，并在 37 °C 下使用 accutase 酶解 10 分钟，使细胞从培养皿上脱离。
3. 用移液管或细胞刮轻轻刮下细胞，收集至 15 ml 离心管中，并以 1:1 的比例加入 SR 培养基中和 accutase 的作用。
4. 为制备单细胞悬液，使用 40 μm 滤膜过滤中和后的细胞，收集至新的 50 ml 离心管中。
5. 使用血细胞计数板计算溶液中细胞的总数。
6. 将细胞悬液以 95 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液；用预热的 0.9% NaCl 洗涤细胞，再以 95 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。

7. 细胞包封

1. 准备一个连接有14G × 2英寸静脉导管软塑料管的1 ml注射器。该装置用于吸取细胞悬液，并将其装载到注射泵上，如图1所示。
2. 用预热的海藻酸钠溶液重悬细胞，细胞密度为每毫升海藻酸钠溶液含125万个细胞。使用注射器轻轻混匀，避免产生气泡。
3. 按照图1所示设置微珠生成器、注射泵和空气流量计。这些设备的详细信息见“特定试剂与设备”表格。
4. 将吸入细胞的注射器取下静脉导管的塑料管部分，并将注射器连接至包封装置。确保包封装置末端与收集点之间保持10 cm的距离，如图1所示。
5. 通过设定注射泵流速为20 ml/hr、空气流速为8 L/min、压力为100 kPa进行细胞包封（可通过调节空气流速改变微胶囊的大小）。
6. 将包封后的细胞收集至盛有20 ml预热沉淀液的培养皿（100 × 15 mm）中，静置7分钟以稳定微胶囊。
7. 轻柔吸取包封后的细胞，转移至装有20 ml 0.9% NaCl溶液的50 ml离心管中。
8. 待微胶囊沉降至管底后，小心弃去上清液，并用0.9% NaCl溶液重复洗涤一次。
9. 将包封后的细胞重悬于预热的培养基中，培养基中添加RI（10 μM），转移至培养瓶中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育。

8. 包封人胚胎干细胞向多巴胺能神经元的分化

在分化前，将包裹的hESC用RI处理3天。

1. 以 1.0 × 10 的密度接种小鼠基质细胞系 PA6 细胞⁴ 每厘米² 在T75培养瓶中预先用0.1%明胶包被，并在分化前24小时用DA神经分化培养基（见材料表）对PA6细胞进行预处理。
2. 将胶囊转移至50 ml离心管中，静置使其沉降至管底。
3. 弃去上清液，将胶囊重悬于PA6细胞条件化的DA神经分化培养基中。
4. 将包封的人胚胎干细胞（hESC）与PA6细胞单层共培养（9 x 10⁵）⁶ 每 7.5 x 10 的 hESCs⁵ PA6细胞培养28天，第4天换液，之后每隔一天换液一次（每次仅更换一半培养基）。
5. 在与PA6细胞共培养3周后，在剩余的1周内向多巴胺能神经分化培养基中添加100 ng/ml SHH和100 ng/ml FGF8a。

9. 人胚胎干细胞包封体的去包封

1. 将胶囊吸入15 ml离心管中，静置使其沉降至管底，然后小心弃去上清液。
2. 用D-PBS洗涤胶囊两次，待胶囊沉降至管底后，移除上清液。
3. 向胶囊中加入5 ml去囊溶液，通过反复吸打充分混匀悬浮液，随后在室温下孵育4-5分钟。
4. 将去囊后的细胞以95 × g离心3分钟，并弃去上清液。
5. 用D-PBS洗涤细胞沉淀，随后以95 × g离心3分钟，重复一次。
6. 去囊后的细胞可进一步作为单层细胞培养，或用于后续分析。

10. 代表性结果

海藻酸盐微胶囊的直径为 400–500 μm。通过将总细胞数除以每轮实验的微胶囊总数，估算每个胶囊内的细胞数量。因此，估计每个胶囊中约含有 5.0 × 10⁴ 个细胞。据此推断，该胶囊最多可容纳的细胞数约为 1.0 × 10⁵。利用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFDA）/碘化丙啶（PI）染色法测定，包封的人胚胎干细胞（hESC）存活率>80%（图2）。我们通过将海藻酸盐浓度从 2.2% 降低至 1.1%，并将沉淀浴由氯化钡更换为氯化钙，优化了 hESC 的包封条件。在这些条件下，我们发现只有以 1.1% 海藻酸钙包封的细胞能够存活、增殖并体外形成拟胚体（EBs）in vitro¹。为进一步优化条件，我们考察了培养基和ROCK抑制剂 Y-27632（RI）的影响。图2和图3所示数据表明，RI 可防止解离诱导的细胞凋亡，维持细胞存活率，并促进细胞聚集成簇^1,6。此外，在含 RI 的人成纤维细胞条件培养基（hFF-CM + RI）中培养的包封 hESC，其存活率显著高于未添加 RI 的各组；但与在无血清培养基（SR + RI）中培养的包封 hESC 相比，差异无统计学意义。同样，通过 BrdU 检测发现，随着单个细胞逐渐聚集成簇，细胞增殖率从 25% 上升至 75%（图3）。TUNEL 凋亡检测显示，在 SR 培养基中培养的微胶囊内单个细胞发生凋亡（数据未显示），而从 hFF-CM 中回收的细胞簇大多 TUNEL 染色阴性。在一定程度上，添加 bFGF 的 hFF-CM 即使在不使用 Y-27632 的情况下，也能促进包封 hESC 的存活与增殖。然而，在包封前（2 小时）及包封后（额外 4 天）使用 Y-27632 处理，可显著提高在 1.1% 海藻酸钙微胶囊中包封的 hESC 的存活率、增殖能力及聚集成簇能力。

此前我们已证明，包封的人胚胎干细胞（hESC）可成功分化为定型内胚层¹。在此，我们探讨了细胞包封作为一种三维平台，用于将包封的hESC分化为多巴胺能（DA）神经元的应用。在胶囊中形成拟胚体（EB）的hESC在所述条件下直接分化，并在去包封后表现出渐进的神经元形态（图4），培养2-3天后细胞存活率超过90%。基因表达分析显示，分化7天后，多能性标志物OCT4表达下调，而神经前体细胞标志物PAX6和DA神经元标志物TH表达上调（图5A）。免疫荧光染色显示，分化7天后，hESC呈PAX6阳性（>80%），OCT4阴性。进一步分化至21天时，hESC产生TH阳性（>90%）的神经元（图5B）。Western blot分析也显示，TH表达自第14天起上调（图5C），而PAX6表达在第21天后下调。相比之下，在类似条件下的二维（2D）培养环境中（例如，分化前进行2小时RI预处理和3天RI后处理），在整个分化期间PAX6阳性细胞比例仍维持较高水平（>80%），但向TH阳性细胞的分化效率低于包封所提供的3D环境（<60%）（图5A和C）。

讨论

多项利用小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞的研究已证明，三维培养系统在生物材料和组织工程中的优势^2,3我们采用海藻酸钙微胶囊作为合适的三维平台，以研究人胚胎干细胞（hESC）的扩增和分化，相较于海藻酸钡微胶囊，因为hESC在海藻酸钙中封装后表现出显著更高的存活率。该培养系统还支持高密度细胞培养，并允许营养物质和氧气通过膜进行有效交换。⁷在胶囊内已观察到自发性分化现象，推测未分化的hESC在胶囊内持续增殖后，最终会突破胶囊形成畸胎瘤。¹另一种包封技术的临床应用是为移植细胞提供免疫保护，使其免受宿主免疫系统的攻击。预计人胚胎干细胞（hESC）及其分化衍生物在移植后可能引发免疫排斥反应，因为未分化hESC的MHC I类抗原表达水平较低，而在分化后其表达水平会升高⁸. 据报道，移植通常使用较高浓度的海藻酸盐，以避免免疫排斥反应^2,9. 本研究采用较低浓度的海藻酸盐（1.1%），更适用于 体外 hESC 的培养与分化。目前尚不确定，我们所使用的较低浓度海藻酸盐是否会在这些包封的 hESC 移植到免疫活性宿主时，引发与先前报道相...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
海藻酸钠（Pronova UP MVG）	NovaMatrix	4200101	高葡萄糖醛酸含量 ≥60%，黏度 >200 mPa s，和内毒素 <100 EU/g
明胶	Sigma-Aldrich	G1890-100G
0.9% NaCl	Baxter Internationl Inc.	AHF7123
J1型微珠发生器	Nisco Engineering Inc	SPA-0447
多通道注射泵	新时代	Model NE-1000
Ezi-Flow Medical 流量计	Gascon Systems	G0149
Y-27632	默克 & Co., Inc.	688000
人血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4327-1G
Accutase	EMD Millipore	SCR005
14G × 2” 静脉导管	Terumo Medical Corp.	SR-OX1451C
Knockout-DMEM	Invitrogen	10829-018	用于SR培养基（基础）
GlutaMAX -I	Invitrogen	35050-061	对于SR培养基（2 mM）
无血清替代物	Invitrogen	10828-028	对于SR培养基（20%）
青霉素-链霉素	Invitrogen	15070063	对于SR培养基（2.5 U/ml）
胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）	Invitrogen	41400045	对于SR培养基（1x）
β巯基–乙醇	Invitrogen	21985-023	对于SR培养基（0.1 mM）
MEM NEAA 溶液	Invitrogen	11140-050	对于SR培养基（5 mM）
格拉斯哥最低必需培养基	Invitrogen	11710035	用于多巴胺能神经元分化培养基（基础）
无血清替代物	Invitrogen	10828-028	用于多巴胺能神经分化培养基（10%）
丙酮酸钠	Invitrogen	11360070	用于多巴胺能神经分化培养基（1 mM）
MEM非必需氨基酸溶液	Invitrogen	11140-050	用于多巴胺能神经分化培养基（0.1 mM）
β巯基–乙醇	Invitrogen	21985-023	用于多巴胺能神经分化培养基（0.1 mM）
音猬因子（SHH）	R&D Systems	1314-SH-025/CF	用于多巴胺能神经元分化（100 ng/ml）
成纤维细胞生长因子8a（FGF8a）	R&D Systems	4745-F8-050	用于多巴胺能神经分化（100 ng/ml）