需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

磁共振弹性成像技术用于评估组织工程构建物生长的方法学

12.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/3618

⸱

2012年2月9日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Engineering Mechanics, University of Nebraska-Lincoln

本文内容

摘要

该实验步骤展示了利用磁共振弹性成像技术，通过显微磁共振弹性成像（μMRE）对脂肪和成骨组织工程构建物的力学特性进行无创局部评估，从而监测其组织工程效果的方法学。

摘要

传统的机械测试通常会导致样本被破坏，而在长期组织工程构建体的研究中，使用破坏性评估方法是不可接受的。一种建议的替代方法是采用一种称为磁共振弹性成像（magnetic resonance elastography）的成像技术。弹性成像是一种非破坏性方法，通过测量局部力学性能值（例如复剪切模量），来确定组织工程的成果，这些力学参数是识别组织结构与功能的关键指标。作为一种无创评估手段，近年来利用磁共振成像（MRI）等成像方式对组织工程构建体进行监测受到越来越多的关注1。例如，磁共振（MR）中的扩散成像和弛豫测量技术已能够表征组织工程发育过程中化学和物理性质的变化2。本方案中提出的方法采用显微磁共振弹性成像（μMRE），这是一种基于磁共振的无创技术，用于测量小型软组织的力学特性3。MRE通过将声学机械激励器与目标组织耦合，并利用磁共振扫描仪记录剪切波的传播来实现4。近年来，μMRE已被应用于组织工程领域，以获取传统上依赖破坏性宏观机械测试方法才能获得的关键生长信息5。在以下实验流程中，弹性成像通过结合机械激励器与改进的Hahn自旋回波序列对组织工程构建体进行成像来实现。如图1所示，改进后的序列将图像采集与外部剪切波的施加同步，并通过使用振荡双极对使信号对运动敏感。在采集具有正负运动敏感性的图像后，通过对数据进行复数除法运算生成剪切波图像。随后，利用反演算法分析该图像，生成剪切刚度图谱6。每个体素所得测量值已被证明与动态力学分析获得的数据高度相关（R2>0.9914）7。在本研究中，弹性成像被整合到组织发育过程中，用于监测人源间充质干细胞（hMSC）向脂肪源性和成骨源性构建体的分化过程，如图2所示。

方案

1. 组织构建体制备

组织构建物的制备过程包括三个主要阶段：细胞群体的扩增、将细胞接种至生物材料支架上，以及通过化学信号分子诱导分化。该构建物制备方案基于Dennis 等、Hong 等以及Marion和Mao8,9,10所采用的方法。

  1. 细胞系培养扩增后，将人源间充质干细胞（hMSCs）以1×106 个细胞/ml的密度接种于明胶海绵（直径4 mm，厚度3.5 mm）上用于成骨诱导，或以3×106 个细胞/ml的密度用于成脂诱导。
  2. 为诱导hMSCs向脂肪细胞分化，当细胞在支架上达到融合状态时，加入成脂诱导培养基，其成分为：1 μM 地塞米松、0.5 μM 异丁基-甲基黄嘌呤、10 μg/ml 人重组胰岛素和200 μM 吲哚美辛，溶于细胞扩增培养基中。三天后，更换为含10 μg/ml人重组胰岛素的扩增培养基，作用24小时，随后恢复使用诱导培养基。重复该循环三次，之后每隔两天仅更换维持培养基。
  3. 为诱导成骨分化，配制成骨诱导培养基：在细胞扩增培养基中加入终浓度为0.1 μM 地塞米松、50 μM L-抗坏血酸-2-磷酸和10 mM β-甘油磷酸钠。每隔两天更换新鲜的成骨诱导培养基。

2. 驱动器表征

驱动器的表征是磁共振弹性成像（MRE）实验的关键步骤。MRE依赖于机械剪切波的传播来评估组织局部的力学特性；因此，需要使用压电驱动器在目标组织内产生并表征这些机械振动。图3展示了该表征过程的示意图。本操作的目的是优化驱动器的运动，以产生具有显著振幅（约250微米）且无害的剪切波。

  1. 实验前，将0.5%琼脂糖凝胶涂覆于10 mm试管内壁以包裹构建物。凝胶温度应约为37 °C，以尽量减少对构建物的损伤。
  2. 待琼脂糖凝胶在室温下静置5分钟使其凝固后，将压电弯曲驱动器的尖端插入凝胶表面。
  3. 将含有样品和驱动器的试管固定于刚性支架上，并将激光多普勒测振仪的光束对准机械驱动器的尖端。调整系统位置以优化反射信号，必要时可使用反光胶带。
  4. 根据机械驱动器预期的共振频率，设置函数发生器以20 Vpp的工作电压和白噪声信号扫描目标频率范围（本实验中为20至2000 Hz）。
  5. 在Polytec Vibrosoft程序中查看表征谱图，确定系统的共振频率，并将程序设置为FFT模式，纵轴为速度。
  6. 进行位移测量时，将驱动器设置为在指定共振频率下以200 Vpp工作电压输出连续正弦波，并记录传递至凝胶表面的位移量。将Vibrosoft设置为显示FFT谱图，纵轴为位移。

3. 图像采集

  1. 完成驱动器表征后，将样品和驱动器置于MRI扫描仪中心。对于组织构建物实验，使用小型且更灵敏的射频线圈（本实验中为10 mm）进行射频信号的发射与接收。（本实验所用设备为配备三轴梯度系统、梯度强度达100 G/cm的9.4 T垂直腔磁体）。
  2. 获取定位像以确定构建物的位置。
  3. 设置成像参数。体外矢状面扫描的典型参数包括：重复时间1000 ms，回波时间20–40 ms，层厚0.5–1.0 mm，视野12×10 mm2，矩阵大小为128×128像素。
  4. 对于弹性成像参数，将驱动器频率设置为激光多普勒振动仪表征所确定的数值。在本研究中，使用一对双极性梯度脉冲，梯度幅值为50 G/cm。其他需调整的参数包括延迟时间，初始采集时应设为0毫秒。
  5. 将函数发生器切换至脉冲模式，并调节其参数以匹配弹性成像采集参数中的频率和周期数。同时，将函数发生器设置为外部触发模式。
  6. 对于矢状面图像，将运动敏感编码方向设为正向层面方向并开始扫描。采集完成后，检查图像，并将敏感编码方向改为负向层面方向。
  7. 运行MATLAB程序，执行复数除法运算以生成剪切波图像。
  8. 评估图像中剪切波的存在情况以及可能的伪影（如相位卷褶）。
  9. 若无需对图像进行调整，则将参数数组大小设为八个等间距的时间点，范围从0秒至表征所得共振频率的一个完整周期。
  10. 在正向和负向层面方向上分别采集扫描图像。
  11. 图像采集完成后，使用专为从图像数组生成剪切波数据而设计的MATLAB程序进行处理。

4. 磁共振弹性成像实验图像处理

  1. MRE 的最后一步是根据剪切波图像计算剪切刚度。将数据导入 MATLAB 程序，以分析三维数据集（2 个空间维度，1 个时间维度）。

注意：通过假设为平面剪切波，运动方程可解耦，从而能够根据位移及其拉普拉斯算子估算复值剪切模量。该算法采用有限差分法近似空间二阶导数，并逐像素计算剪切模量。由此复数可推导出多种力学参数，如剪切波速度、波衰减、剪切刚度、剪切弹性、剪切黏度等。该算法还允许选择感兴趣区域，计算各参数的均值和标准差。

  1. 程序开始前需要设定成像参数。此外，可调整弹性图的上限值以优化样品的对比度。

注意：该程序提供中间结果（低通滤波后的波形、方向滤波后的波形、时间傅里叶变换、线轮廓等），有助于用户评估恢复的保真度。

  1. 可根据这些信息调整某些参数，例如低通滤波器的水平、运动的时间频率、波的传播方向等。特定感兴趣区域内某参数的标准差也是计算质量的一个指标。

5. 代表性结果

图4显示了成骨和成脂构建物在四周发育过程中力学性能的变化。磁共振弹性成像（MRE）在730-820 Hz频率下进行。两种接种海绵初始模量均约为3 kPa，成骨诱导组织的刚度增至22 kPa，而成脂诱导组织的刚度则下降至1 kPa。此外，成骨构建物在研究结束时相较于初始状态表现出明显的体积减小。弹性成像研究得出的其他参数见表1。

磁共振相位对比梯度图与运动敏感化；剪切波成像结果。
图1. 磁共振弹性成像的图像采集过程。在图像采集期间，脉冲序列（a）控制函数发生器与磁共振成像仪双极梯度脉冲之间的同步（b）。在采集正负方向切换的双极梯度信号后，（c）通过复数除法生成剪切波图像。

包含支架、磁共振图像、弹性图和组织学染色的细胞成像过程示意图。
图 2. 用于组织工程构建物的磁共振弹性成像（MRE）流程图。首先，细胞（a）被培养并扩增至设计项目所需的细胞数量。随后将细胞接种（b）到生物材料支架上，并施加化学试剂以诱导分化。支架通过MRE进行表征，其第一步（c）是确定与构建物耦合的激励器的共振频率。接下来，获取磁共振成像（MRI）图像（d），以生成剪切波图像（e）。最后，应用算法生成弹性图（f），以映射构建物的刚度。同时，对构建物进行切片以进行组织学评估（g），从而验证分化效果。

组织构建体动力学；压电装置、激光多普勒测振仪、共振、位移。
图3. 驱动器表征流程。明胶支架被包裹在0.5%的琼脂糖凝胶中。为表征传递至样品的运动，首先向系统输入白噪声信号（1a），并使用激光多普勒测振仪检测所产生的运动（1b）。确定共振频率后，输入一个在共振频率下的连续正弦信号（2a），以测定传递至明胶环境的位移（2b）。

剪切波弹性成像图；硬度测量，颜色标尺，第0至4周分析。
图4. 四周期间构建物发育图。从左到右依次显示成脂（A）和成骨（O）构建物，及其对应的幅度图像和剪切波图像、弹性图以及平均剪切刚度。弹性图的颜色标尺与柱状图的颜色方案相对应，误差线表示各构建物感兴趣区域内的标准差。

显示脂肪组织和成骨组织在五周内刚度和黏度比较的表格，数值单位为 kPa 和 Pa.s。
表 1. 脂肪和成骨构建物在四周生长期间的力学性能。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在此实验流程中，展示了从细胞制备到弹性图生成的组织工程构建物磁共振弹性成像（MRE）全过程。通过将无创性力学评估方法应用于组织工程流程，现在可以在多个发育阶段对工程化构建物的变化进行评估。此外，MRE可与其他用于监测组织工程构建物的磁共振方法相互补充，例如扩散成像、磁化转移成像以及化学位移分析1。

进行磁共振弹性成像（MRE）实验时，应注意一些局限性。体外样本的评估是一项对时间敏感的研究，因此建议实验持续时间不超过一小时，以尽量减少对组织构建物的潜在损伤。此外，由于构建物过小或过于僵硬，可能导致刚度图的准确重建受到影响6。解决该问题的一种可能方法是在更高频率（> 2.5 kHz）下操作，因为波长与频率成反比。由高压放大器驱动的压电堆栈执行器能够在该频率范围内提供足够的运动，从而在样品中产生完整的剪切波长。对实验方案的另一种可能改进是采用更快的成像序列，例如快速自旋回波和回波平面成像11, 12。

超越磁共振弹性成像在组织工程构建物中的...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）RO3-EB007299-02 和美国国家科学基金会（NSF）EPSCoR 首席奖的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MSCGM-子弹 套件试剂龙沙公司PT-3001在 4°C 下保存
1X DPBS试剂英潍捷基公司21600-010
0.05% 胰蛋白酶-EDTA试剂吉布科（生命技术公司）25300-054在 -20°C 下保存
地塞米松试剂西格玛-奥德里奇公司D2915
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤试剂西格玛-奥德里奇公司I5879在 -20°C 下保存
牛胰岛素试剂西格玛-奥德里奇公司I6634在 -20°C 下保存
吲哚美辛试剂西格玛-奥德里奇公司I7378
Β-甘油磷酸试剂西格玛-奥德里奇公司G9891
L-抗坏血酸-2-磷酸试剂西格玛-奥德里奇公司A8960
明胶海绵支架材料法玛西亚公司（辉瑞）09-0315-08
人源间充质干细胞细胞系龙沙公司PT-2501
9.4T 磁共振成像仪设备安捷伦科技公司400MHz 宽带
10mm Litz 线圈设备多蒂科学公司
激光多普勒测振仪设备Polytec 公司PDV-100
Vibrosoft (20)软件Polytec 公司
函数发生器设备安捷伦科技公司AFG 3022B
放大器设备Piezo 公司EPA-104-115
压电弯曲电机设备Piezo 公司T234-A4Cl-203X
Linux 计算机设备英特尔公司处理器：Intel Core 2 Duo E8400，内存：2G
Windows 计算机设备英特尔公司处理器：Intel Core 2 Duo E8400，内存：2G
MATLAB软件MathWorks 公司2009b

参考文献

  1. Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging. J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).
  2. Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro. Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).
  3. Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE. Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).
  4. Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves. Science. 269, 1854-1857 (1995).
  5. Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs. NMR Biomed. , Forthcoming (2011).
  6. Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation. Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).
  7. Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test. Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).
  8. Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge. Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).
  9. Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression. Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).
  10. Marion, N. W., Mao, J. J. Mesenchymal stem cells and tissue engineering. Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).
  11. Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain. Proceedings of the International Society of Magnetic Resonance in Medicine, Glasgow, Scotland, , 1647-1647 (2001).
  12. Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. Fast EPI based 3D MR elastography of the brain. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine, Seattle, Washington, , 3385-3385 (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

组织工程构建物力学性能测量无创成像剪切波传播人源间充质干细胞脂肪向分化成骨向分化显微磁共振弹性成像磁共振成像仪
磁共振弹性成像技术用于评估组织工程构建物生长的方法学
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。