方法文章

同时记录黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中已鉴定神经元的钙信号与摄食行为

16.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/3625

⸱

2012年4月26日

1Department of Neurobiology, University of Massachusetts Medical School

本文内容

摘要

果蝇 Drosophila melanogaster 在其喙或跗节受到糖刺激时会伸展喙管以进行取食。我将喙管伸展反应（PER）的观察与钙成像技术相结合，从而能够在观察行为的同时监测脑内神经元的活动。

摘要

为了从行为功能的角度研究神经元网络，我们必须分析每种行为模式产生时神经元的活动方式。因此，同步记录神经元活动与行为对于关联脑活动与行为至关重要。在进行此类行为分析时，果蝇（Drosophila melanogaster）是一种常用的模式生物。 黑腹果蝇，使我们能够使用GCaMP等基因编码的钙指示剂1，以监测神经元活动，并利用复杂的遗传操作技术进行光遗传学或热遗传学干预，从而特异性地激活已鉴定的神经元2-5. 利用热遗传学技术，我们发现了对摄食行为至关重要的神经元（Flood 等，正在修订中）。作为摄食行为的主要部分，一个 果蝇 成虫伸出喙以进食6 （喙伸展反应；PER），对位于其喙或跗节上的感觉细胞所感知的甜味刺激产生反应。结合PER实验方案7 采用钙成像技术8 使用 GCaMP3.01, 9，我建立了一个实验系统，可同时监测摄食中枢——咽下神经节（suboesophageal ganglion, SOG）中神经元的活动以及喙的行为表现。我设计了一种装置（“果蝇脑活体成像与电生理记录平台”：“FLIES”），以适应 果蝇 成虫，使其喙能够自由活动，同时将其脑部暴露于浴液中以进行 Ca2+ 通过水浸物镜成像。FLIES 方法也适用于多种类型的果蝇脑部活体实验，例如电生理记录或突触形态的延时成像。由于活体成像结果可与同步的 PER 行为直接关联，该方法可为研究神经网络的信息处理机制，以及细胞活动如何与可塑性过程和记忆形成相耦合，提供一个优良的实验体系。

方案

1. 构建FLIES

  1. 通过熔化35 mm Falcon培养皿盖的侧壁，并将其塑造成适当的角度和厚度，制成一个平台（图1a；图2）。在平台上钻一个孔，用于固定果蝇头部（图1a,b），使口器部分可自由暴露于腔室外部（图1a）。剪裁Pipetman吸头末端，使其尺寸与待观察的果蝇相匹配。将吸头粘接到平台上，如图1a所示，完成FLIES装置的制作（图2）。

2. 准备观察果蝇

  1. 若需饥饿处理，在实验前于 25 °C 下将成年果蝇置于仅含湿润滤纸的试剂管中饥饿 24 小时。
  2. 将果蝇放入一个置于冰上的 15 ml 塑料离心管中，使其麻醉。
  3. 使用镊子将果蝇插入 FLIES 装置的腔室中，并轻轻推入果蝇直至其无法移动，然后插入塞子以固定果蝇。（图 1a,b）。
  4. 将吻部（喙）近端周围部分与孔的内边缘密封；从外部在喙的侧面及上方涂抹少量光固化胶（Tetric EvoFlow）（图 3 中箭头所示）。同时从 FLIES 装置内部在头部背侧与孔内边缘之间的空隙处涂抹胶水（图 1b）。为使喙能够自由活动，应使用睫毛（或类似物）小心涂抹胶水，避免胶水接触喙部。最后，使用足以固化的最弱蓝光照射固化胶水，以避免过热对果蝇造成损伤。随后移除塞子。
  5. 可使用一根细线将喙部部分提起（图 3 中箭头所示），以稳定果蝇头部，防止咽部碰撞到亚食道神经节（SOG），并暴露 SOG 的腹侧区域，尤其是在对 Gr5a 神经元的突触前末梢进行成像时8，因为当喙完全回缩时，部分咽部会覆盖这些结构。
  6. 用不含糖的生理盐水填充平台表面，其成分为（单位：mM）：NaCl, 140；KCl, 2；MgCl2, 4.5；CaCl2, 1.5；HEPES-NaOH, 5，pH 值为 7.110。该无蔗糖生理盐水的渗透压与常用的含蔗糖生理盐水（如 HL3.111）相似。
  7. 使用钨制刀片和尖端磨成剪刀状的镊子打开头壳，该工具为日本 Dr. Kageyuki Yamaoka 定制设计，用于剪除表皮和气管，以暴露亚食道神经节（SOG）（图 4）。头壳的腹侧边缘应尽可能靠腹侧剪开，而背侧边缘的切割则相对不关键。首先使用钨制刀片切开后缘，然后用磨尖的镊子剪开侧缘和前缘。用镊子将剪下的头壳碎片提起并移除。使用磨尖的镊子切除触角及触角神经。
  8. 为避免记录过程中出现运动伪影，需通过去除果蝇的某些组织来稳定脑部。首先选择性地去除 SOG 与表皮之间的气囊。在食道通向咽部的一端以及进入 SOG 的一端进行剪切，以切断咽部与脑之间的连接。然后拉出肌肉 1612，最后分离连接脑与表皮的所有气管。
  9. 我们将 FLIES 装置置于连接旋转盘共聚焦显微镜系统（Improvision，PerkinElmer）的 Olympus BX51WI 显微镜载物台上（图 5）。将水浸物镜（例如 40X/0.8 N.A）浸入浴液中（图 6）。

3. 脑组织的 Ca2+ 成像

  1. 使用GCaMP3.01, 9进行Ca2+成像，实验方法依据Marella et al.8建立的方案（图6）。采用转盘共聚焦显微镜（Improvision），利用Velocity软件（版本4.3，Improvision），在感兴趣区域（如运动神经元或中间神经元的胞体，或味觉感觉神经元的突触前末梢）进行成像，以491 nm激发激光，以4 Hz频率采集单层光学切片，曝光时间为122 ms。

4. 刺激喙

  1. 用带有小灯芯（由日本和纸制成，参见特定试剂表）从针尖端伸出的皮下注射针吸取100 mM的水溶液蔗糖（图7）。
  2. 将少量蔗糖溶液滴加到灯芯上，随即吸入，然后立即将浸润的和纸灯芯接触喙的尖端。为避免饱食效应，和纸灯芯仅需瞬时接触（图8）。在进行Ca2+成像的同时，使用连接在解剖显微镜上的CCD相机监测喙伸展反应（PER）行为（图5）。由于在此条件下PER反应无法维持超过一小时，因此所有数据必须在解剖开始后一小时内采集完毕。

5. 代表性结果

已有研究报道，喙部伸肌（负责抬起喙部以实现喙管伸出的一对主要肌肉）的运动神经元对甜味刺激表现出显著反应13。图9展示了通过Gal4驱动子E4913表达GCaMP3.01, 9，记录到的运动神经元胞体中的Ca2+信号。如视频所示，Ca2+信号升高时同步观察到了显著的喙管伸展反射（PER）。

果蝇解剖装置示意图，侧视图和顶视图，腔室角度，角质层去除，实验方法。
图 1. 果蝇脑活体成像与电生理记录平台（FLIES）示意图。a，FLIES 的设计使得腔壁角度允许果蝇头部笔直伸出。果蝇喙的三个部分用不同颜色标记；其中喙管为品红色。使用镊子将果蝇插入腔室，并用剪下的 Pipetman 吸头末端塞住腔室后部，防止果蝇逃出。b，钻孔需与果蝇头部形状匹配。如图所示，剩余缝隙用光固化胶密封，以确保无泄漏。待胶水固化后，移除作为塞子的 Pipetman 吸头。将生理盐水注入 FLIES，使脑组织表面完全浸没。应确保无盐水泄漏至果蝇头部前端。图中 b 面板中虚线包围的阴影区域表示需要解剖去除的部分。

带有胶墙的果蝇实验装置，行为观察实验，昆虫学研究。
图 2. FLIES 装置的照片。 由胶枪形成的半月形胶墙用于在灌流过程中控制盐溶液的流动，并减少盐溶液的使用量。

昆虫头部固定、胶水使用、显微图像、昆虫学研究、标本制备。
图3. 在FLIES装置中固定的果蝇的正面视图。 该图像展示了果蝇如何被安置在FLIES装置中，以及光固化胶水如何围绕果蝇头部（箭头所示）涂抹，以形成防止盐溶液渗漏的密封。如果盐溶液渗入果蝇的喙部，则实验将失败。连接在载物台上的细线（箭头头所示）用于固定喙部位置，防止其完全回缩，否则会遮挡腹侧的咽下神经节（SOG）并引起运动伪影。

果蝇头部解剖图；标注了触角叶、食道和腹侧神经节；用于教育目的。
图 4. 解剖后果蝇的俯视图（FLIES）。 本图像显示去除体壁后暴露的果蝇腹侧神经节（SOG）。同时已移除食道、第16号肌肉以及与脑连接的气管和部分气囊，以避免其对脑组织造成干扰，从而防止钙信号中出现伪影。

用于PER和果蝇标本分析的共聚焦显微镜装置，配备体视显微镜和CCD相机。
图5. 监测装置。 该装置由一台Olympus BX51WI显微镜连接转盘共聚焦显微镜系统（Improvision）以及一台侧向安装的Nikon SMZ800显微镜组装而成。此配置可在PER行为期间实现对脑部活动的活体成像。

使用40倍水浸物镜在生理盐水中观察果蝇腔室的显微镜装置。
图6. 显示FLIES侧面视图的照片。 一层薄薄的生理盐水夹在40倍水浸物镜与果蝇之间。

自折叠聚合物条示意图及显微镜图像；干燥与湿润状态下的结构转变。
图 7. 制作和纸灯芯的示意图。 甘皮和纸是一种传统的日本羊皮纸，极薄且表面光滑（日本日原）。它还具有很高的强度，并能保留大量液体。和纸必须被裁剪成具有特定尺寸的梯形：宽度分别为 0.3 mm 和 0.7 mm，长度为 4–5 mm（a）。然后将该梯形从 0.7 mm 的一侧插入 23 G 注射针针尖，并可通过插入一根弯成 V 形的昆虫针来固定其位置（b）。c，和纸在接触液体后会变得透明，因此非常适合本实验使用。

用于光子学研究中光学激发和发射分析的显微镜装置。
图 8. 使用 Washi-wick 刺激 FLIES 上的喙。 将皮下注射针尖端的 Washi 纸芯通过操纵杆装置，用一只手瞬时施加刺激。针头通过一根柔性管连接至注射器，注射器由另一只手操控，用于吸取和释放蔗糖溶液。

细胞反应的荧光显微镜观察；图示刺激前/后的图像及结果图。
图9. 代表性结果。a，通过体视显微镜上安装的CCD相机记录的PER行为。饥饿果蝇在刺激前、刺激时和刺激后（箭头所示为伸展的喙），使用含有100 mM蔗糖水溶液的棉芯进行刺激（箭头指示）。照明由用于GCaMP荧光的491 nm激光完成。b，饥饿状态下喙肌伸肌运动神经元中蔗糖诱导的GCaMP 3.0反应。上图：刺激前；下图：刺激后立即成像。比例尺：10 μm。c，蔗糖诱导的GCaMP 3.0反应的定量分析。该运动神经元对蔗糖刺激表现出荧光信号的急剧上升，随后在数秒内恢复至基线水平。

讨论

FLIES 技术可实现 Ca2+ 信号与 PER 行为的同步记录。即使脑组织暴露于生理盐水中，仍能观察到正常的 PER 行为。使用 Gampi-Washi 芯条替代原始毛细管方法中所用的 Kimwipe 芯条，有助于获得高度可重复且稳定的 PER 行为，同时避免了制备和挑选优质 Kimwipe 芯条所需的技术训练。上述实验要点使我们能够有效避免喙部运动带来的干扰，从而实现低噪声、高度稳定的 Ca2+ 信号记录。偶尔，组织清除不充分会导致细胞暴露不完全或运动抑制不足，进而影响实验结果。然而，一旦操作熟练，超过 80% 的样本制备均可获得良好结果。该方法不仅适用于 Ca2+ 成像，还可推广至在观察 PER 行为的同时进行的任何活体成像实验。例如，可通过电极接触任意细胞以直接记录其电活动。结合双光子激发显微镜，我们能够对突触结构进行时间序列成像，从而将其变化与行为改变相关联。因此，这种结合行为观察的脑成像方法不仅有助于神经网络功能的解析，还可作为研究突触可塑性14 与记忆机制之间关联的有力工具。

披露

本人无任何利益冲突可披露。

致谢

感谢 L Watanabe、M Gorczyca 和 Yoshihara 实验室其他成员提供的有益评论和讨论。感谢 K. Scott 和 L. Looger 提供果蝇品系，感谢 S Yokoyama 演示实验操作，Shinya Iguchi 提供技术协助，以及 Nobuko Yoshihara 提供材料信息。本研究得到了美国国家心理健康研究所资助 MH85958 和 Worcester 基金会资助的支持，资助对象为 M.Y。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
特里克 EvoFlow义获嘉伟瓦登特M04115光固化胶
BX51WI 显微镜奥林巴斯公司BX51WI配备 40X（数值孔径 0.8）水浸物镜
转盘共聚焦显微镜系统珀金埃尔默公司配备 491 nm 激光器
体视显微镜尼康仪器SMZ-800连接摆臂装置，可在视频录制时提供立体视觉
神子和纸日本 Haibara一种特殊的传统日本纸张
CCD 相机成像源公司DFK41AU021/2" 1080 × 960 像素 SONY CCD
操纵杆操作器成茂国际MN-151
显微注射仪成茂国际IM-5B

参考文献

  1. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
  2. Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121, 141-152 (2005).
  3. Schroll, C. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  4. Hamada, F. N. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
  5. Peabody, N. C. Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel. J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).
  6. Dethier, V. G. Hungry Fly. , Harvard University Press. (1976).
  7. Shiraiwa, T., Carlson, J. Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).
  8. Marella, S. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category. 49, 285-295 (2006).
  9. Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
  10. Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).
  11. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
  12. Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. M, D. emerecm , John Wiley & Sons. 420-534 (1950).
  13. Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
  14. Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth. Science. 310, 858-863 (2005).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Proboscis Extension Response GCaMP3 0

相关文章