高通量与低通量根结线虫筛选 Meloidogyne spp.

摘要

介绍了两种不同的根结线虫植物筛选方法。所述方法包括以非破坏性方式对线虫进行高通量筛选，从而便于将这些植物用于育种项目。

摘要

根结线虫（Meloidogyne 属）是专性植物寄生线虫，具有极强的多食性，被认为是最重要的植物寄生线虫之一。其感染阶段为在卵内完成一次蜕皮的微观二龄幼虫（J2）。J2从卵中孵化后，在土壤水膜中自由移动，并寻找适宜植物的根尖。侵入植物根部后，它们向维管柱迁移，并利用口针建立取食位点并开始取食。该多细胞取食位点由多个经过核分裂（重复有丝分裂）但未发生胞质分裂的细胞发育而成，形成若干增大的多核细胞，称为“巨型细胞”。邻近的中柱鞘细胞发生分裂并增大，形成典型的根结或根瘤，这是根结线虫感染的典型症状。取食开始后，J2转为定居状态，并经历三次蜕皮发育为成虫。成年雌虫在根表或根下以胶状基质产下150–250粒卵。新孵化的感染性J2由此开始新一轮循环。在26–28°C条件下，根结线虫的生活史周期可在4–6周内完成。

本文介绍了在花盆中种植的植物接种根结线虫的传统方法，以及两种高通量检测方法。第一种高通量方法适用于种子较小的植物，如番茄；第二种方法适用于种子较大的植物，如豇豆和普通菜豆。大粒种子可在几乎无需额外营养补充的条件下支持幼苗较长时间生长。第一种高通量检测方法利用在托盘沙土中培育的幼苗，而第二种方法则在无土壤条件下将植物培养于育苗袋中。育苗袋由一张尺寸为15.5 × 12.5 cm的吸水纸条制成，其顶部折叠形成一个深约2 cm的凹槽，用于放置种子或幼苗，并将该纸条置于透明塑料袋内。这种育苗袋可透过透明表面直接观察线虫侵染症状、根部形成根结及产卵团等情况。两种方法均允许在完成表型鉴定后，将筛选出的植株用于杂交或种子繁殖。使用育苗袋的另一优势在于所需空间较小，因为育苗袋可存放于悬挂在架子上的透明塑料文件夹中。

方案

1. 番茄幼苗在花盆和育苗盘中的生长

1. 进行盆栽试验时，将番茄种子种植于单个花盆中，使用富含有机质的土壤，如Sunshine培养基。在22-28°C的温室中培养。发芽后，每周施用一次Miracle-Gro肥料。
2. 发芽约两周后，在两片真叶期，将幼苗单独移栽至装有无菌沙质土壤的花盆中（直径10 cm，深度17 cm），土壤组成为90%沙子和10%有机混合物。添加Osmocote缓释肥料，并在22-28°C温室中继续培养两周。此后仍需每周施用一次Miracle-Gro肥料。
3. 对于高通量筛选，可直接将种子播种于盛有沙质土壤的育苗盘中，用塑料薄膜覆盖育苗盘直至种子发芽，并按上述条件进行培养。发芽后，添加Osmocote缓释肥料，并每周施用一次Miracle-Gro肥料。

2. 在种子袋中种植豇豆幼苗

1. 将种子置于铺有多层Kimwipe纸的培养皿中萌发，然后单株转移至育苗袋中，或直接放入育苗袋的纸槽内进行萌发。
2. 将育苗袋放入塑料悬挂式文件夹中，每文件夹放置两个，并将文件夹垂直置于支架上。将支架放入温度控制在25–28 °C、光照周期为16小时光照/8小时黑暗的环境培养室中。支架也可置于温室中培养，但需在植株茎的两侧用铝箔或硬纸板覆盖支架，以减少真菌污染的风险。
3. 每天用反渗透水浇灌育苗袋一次或两次。播种后约10至14天，当形成具有三级根尖的完整根系时（图1），幼苗即可进行接种处理。

3. 线虫卵的提取

从感病根部提取卵的方法经由 Hussey 和 Barker（1973 年）建立的方案修改而来。

1. 在接种线虫前3至4天，从感染的番茄根部提取根结线虫卵。开始卵提取前，用热水彻底清洗工作区域，以避免污染。同时用热水清洗一个搅拌器、两个桶、一个金属网架、一个橡胶锤、孔径分别为425、90和25 μm的三只筛子、一个量筒和剪刀。
2. 将筛子按从上到下的顺序叠放：425、90和25 μm孔径。卵将收集在底部的25 μm筛子上。将叠好的筛子放在置于水槽中的金属网架上，并在金属网架下方放置一个桶，用于收集滤过液。
3. 剪去作为接种源的感病植株地上部分并丢弃。小心地将植株从盆中取出，通过在盛满水的塑料桶中浸泡的方式清洗根部，再用流动水进一步冲洗，直至根部附着的土壤颗粒完全清除。
4. 用剪刀将根部剪成小段，并丢弃主根。
5. 将单株植株的切碎根段放入一个带盖的大塑料罐中，加入适量10%次氯酸钠溶液，刚好浸没根段，然后盖上盖子。
6. 摇动装有根段的塑料罐2分钟。
7. 打开罐子，将内容物倒入最上层筛子，并使用连接雾化喷嘴的软管冲洗。充分冲洗直至完全去除漂白剂气味。用橡胶锤轻敲筛子侧壁，防止筛孔堵塞。
8. 移去最上层筛子，冲洗第二层筛子上的残渣。
9. 移去第二层筛子，收集最下层筛子上的细小残渣（其中包含线虫卵）。用洗瓶中的细水流将残渣冲至筛子一侧，然后将残渣和卵连同少量水一起收集到一个洁净的烧杯中。
10. 将桶中收集的滤液再次通过25 μm筛子过滤一次，以回收可能漏过的卵。用清水充分冲洗，并将收集物并入同一烧杯中。
11. 丢弃最上层筛子中的植物残渣，并用加压水彻底清洗所有三只筛子。切勿触碰筛网部分，以免改变孔径大小。

4. 孵化线虫卵

1. 用几层 Kimwipe 擦镜纸衬垫一个洁净的金属篮，并将其置于玻璃培养皿上，确保篮子底部与培养皿之间保持 1 cm 的距离。
2. 将提取的线虫卵倒入金属丝篮中的纸上。加入适量液体，使金属丝篮的底部接触水面但不浸入水中。用塑料盖盖住顶部。
3. 每天检查水分蒸发情况，并向培养皿中添加适量水，确保篮子底部始终接触水面，以防止卵干燥。
4. 每隔一天，将含有 J2 的水从培养皿中收集至烧杯中。若不能立即使用，需在室温下利用实验室气源或水族泵产生的空气对收集的接种液进行通气。通气后的接种液应在 2 天内使用。J2 可在孵化装置中持续收集 6–8 天。

5. 盆栽或托盘中番茄根部接种及侵染评价

1. 取三份收集的线虫样品，在计数载玻片或培养皿中统计二龄幼虫（J2）的数量，计算平均值，并确定接种所需的体积。通常每盆植株使用3000条J2，育苗盘中生长的植株每株使用500条J2。
2. 在磁力搅拌器上以低速搅拌接种液。
3. 在接种植物前，确保土壤湿润但不过于潮湿。对于盆栽接种，使用铅笔在每株番茄根系周围的沙土中打三个深度约为半盆的孔（图2）。用移液器将J2分别加入三个孔中，完成每株植物的接种，之后覆盖孔洞。
4. 对于育苗盘中的高通量筛选，可使用经改造的带侧孔密封针头——将其侧边打孔后粘接到5 mL移液器吸头，并连接移液器（图3），将J2注入土壤中。或者，也可按照步骤5.3的方法进行线虫接种。
5. 将植株置于温室中，在24–27°C条件下培养6至8周。每月施用两次Miracle-Gro肥料。
6. 为评估侵染情况，小心地将植株从盆中取出，并清洗根部（清洗方法如步骤3.3所述）。
7. 将根部浸入1 mg/L 的赤藓红（erioglaucine）溶液中染色15分钟，使卵块呈现蓝色。
8. 用清水冲洗根部，通过计数单个根系上的染色卵块进行评估。可使用带光源的台式放大镜辅助观察卵块。
9. 若筛选后的植株需用于进一步的遗传学研究，在清洗根部评估前不要剪除地上部分。完成染色和卵块计数后，将幼苗移栽至有机土壤中，大幅修剪地上部分以减少蒸腾作用，并在温室中继续培养。

6. 豆科植物豇豆根部在培养袋中的感染及感染评估

1. 计数线虫接种物，并如前所述在磁力搅拌器上搅拌。
2. 从悬挂式文件夹中取出种植袋，平放在水平表面上。每袋接种5 ml悬浮液，其中含1500条J2幼虫。掀开种植袋的塑料盖，将线虫均匀分布在根系表面。
3. 接种后将种植袋保持水平放置24小时，并用深色纸覆盖以避光，之后放回生长室内的悬挂式文件夹中。
4. 根据需要每天浇水一至两次，使用半浓度Hoagland营养液（Hoagland & Arnon, 1950；表1），直至观察到植株对肥料产生反应，通常表现为叶片明显转绿和地上部分生长更旺盛。通常连续3天使用半浓度Hoagland营养液进行浇灌。此后仅用水保持种植袋湿润。
5. 接种后约30天（范围为28–35天），向每袋注入约10–20 ml浓度为75 mg/L的亮蓝染料（erioglaucine）。将种植袋平放并用染料完全浸没过夜。
6. 排干种植袋中的液体，使用带光源的台式放大镜计数根系上的卵块数量。
7. 若筛选后的植株需用于进一步的遗传学研究或育种工作，应小心将根系从纸袋中取出，移栽至装有有机土壤的花盆中，并在温室中继续培养。

7. 典型结果

图 1 和 2 展示了所述两种系统中用于线虫接种的番茄和豇豆植株的适宜生长阶段。此外，图 4 和 5 展示了番茄和豇豆根部被良好侵染的示例。与大多数抗病性筛选实验类似，建议每种基因型至少使用 6–10 株植物进行线虫接种，以计算平均侵染率。通过使用大小一致的植株以及精确控制接种物的数量和施加方式，可降低相同基因型植株间线虫侵染的变异程度。

使用托盘和生长袋可以在较小的生长空间内对数百至数千株植物进行筛选。生长袋还能够快速、高效地对根结线虫感染进行无损评估，无需清洗根系（图4）。

图 1. 生长两周的豇豆植株，培养于种植袋中，已准备好进行根结线虫接种。

图 2. 一株三周龄的番茄植株，准备进行根结线虫接种。

图3. 一种用于高通量接种线虫的改良针头和移液器吸头。将针头底部密封，并用激光束在针头上钻出三组小孔。随后，将改良后的针头粘接到一个5 ml移液器吸头上。

图4. 被根结线虫侵染的番茄根系。

图5. 接种后30天、28 °C条件下培养的豇豆根系，卵块用亮蓝染色。

讨论

成功的线虫筛选有两个关键步骤：制备高侵染性的接种物以及使用处于适当发育阶段的植物。根结线虫卵的孵化率变异较大，通常在5%至50%之间。因此，为了获得最佳的孵化水平和高侵染性的二龄幼虫（J2），必须严格注意卵的提取和孵化操作过程。卵与次氯酸钠（bleach）接触的时间应尽可能短，并且必须将根组织混合物中的次氯酸钠充分冲洗干净。在孵化卵时，含有卵的悬浮液不应完全浸入水中。此外，应避免将卵洒落到下方用于收集孵化幼虫的培养皿中。为防止孵化过程中卵的洒落，切勿直接向Kimwipe纸中加水，以免纸张破损。而应将水直接加入培养皿中。

为获得最佳结果，应使用新孵化的J2幼虫。若孵化率较低且需要更多接种物，可将J2幼虫在15°C下保存较长时间。接种前需将保存的接种物恢复至室温，以恢复线虫活性。然而，即使在15°C条件下，也不应长期保存J2幼虫，因为饥饿状态的J2幼虫侵染效率会降低。

幼嫩的幼苗是根结线虫接种的最佳发育阶段。然而，此阶段需与根系的充分发育相平衡，以提供足够数量的根尖作为二龄幼虫（J2）的侵入位点。保持植物最佳生长条件对于筛选实验也至关重要。应避免过度浇水，特别是生长在种植袋中的植株。当种植袋底部出现积水时，表明已过度浇水，这会促进真菌生长并损害根系健康。

通过这两种实验方法，可进一步评估线虫侵染情况，并计算每株根系的卵数及每克鲜根的卵数。对于番茄实验，需称量单个根系，并按照接种物制备（第3节）所述方法提取卵。在处理大量植物样品时，可使用搅拌器将整个根系组织匀浆以提取卵。卵的数量应至少在三个等分试样中进行计数，并计算每克鲜根组织中的卵数。对于袋式培养实验，将根系从纸质插片上取下，称重后提取卵。