本视频方案演示了利用神经球培养法从手术切除的人源多形性胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤组织中分离并扩增类干细胞的操作流程。
本文内容
摘要
摘要
已在乳腺、肺、结肠、前列腺和脑等肿瘤中分离出具有干细胞特性的细胞。在所有这些肿瘤中，尤其是多形性胶质母细胞瘤（GBM）中，一个关键问题在于识别并分离出肿瘤起始细胞群体，以研究其在肿瘤形成、进展和复发中的作用。了解肿瘤起始细胞群体将为寻找这些肿瘤的有效治疗策略提供线索。神经球培养法（NSA）由于其操作简便且可重复性强，已被广泛用作分离和扩增多种此类肿瘤细胞的首选方法。本实验方案展示了利用神经球培养法从手术切除的人源GBM肿瘤组织中分离并扩增干细胞样细胞的技术流程。该操作包括首先对肿瘤组织进行化学消化和机械解离，获得单细胞悬液，随后将其接种于NSA培养体系中。培养7-10天后，可观察到直径为150-200 μm的初级神经球，此时即可进行后续传代与扩增。
方案
1. 原发性胶质母细胞瘤组织的采集
- 从确诊患有胶质母细胞瘤多形性（GBM）并接受手术的患者体内获取GBM肿瘤组织。
- 必须事先与神经外科团队协调安排。神经外科医生将切除的GBM肿瘤组织置于适当大小的管中，管内含有添加了10-15%抗生素（青霉素/链霉素）的神经干细胞（NSC）基础培养基。实验室需向手术室提供低温培养基。 alternatively，也可使用含高浓度抗生素的低温HEPES缓冲最低必需培养基（HEM）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 切除的肿瘤组织需冰上运送至实验室，并置于生物安全柜中。
2. 将原发性肿瘤解离为单细胞悬液
- 从 Falcon 管中移除过量的原始培养基/PBS，并用 5–10 ml PBS/NSC 基础培养基将样本洗涤 2–3 次，以去除血液和碎片。吸除 PBS/培养基后，将 GBM 肿瘤组织置于培养皿中。
- 将组织切成小块，并使用 10 号手术刀片进一步切碎成微小碎片，以增加胰蛋白酶消化过程的表面积。切碎时间根据肿瘤大小而定，通常需要 1–3 分钟。
- 将切碎的组织在 3–5 ml 预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中于 37°C 水浴中消化 10–15 分钟。使用电子移液器将微小的肿瘤组织碎片和胰蛋白酶转移至 15 ml Falcon 管中。
- 孵育结束后，加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶的酶解反应。
- 通过多次上下吹打悬液确保胰蛋白酶完全失活，随后在 800 rpm（110g）条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。
- 弃去上清液，将组织碎片重悬于 1 ml 无菌 NSC 基础培养基中。通过轻柔地上下吹打（3–7 次）使团块解离，直至获得均匀乳白色的单细胞悬液。吹打次数取决于切碎组织中颗粒的大小。应避免长时间或剧烈的机械解离，以免导致细胞死亡并降低成球能力。
- 为去除未解离的组织块和碎片，向管中加入 10–15 ml 基础培养基，并将细胞悬液经 40 微米细胞滤网过滤至 50 ml 管中。
- 将过滤后的悬液在 800 rpm（110g）条件下离心 5 分钟，随后弃去上清液。
- 将沉淀的细胞重悬于 1–2 ml 完全 NSC 培养基中，用于细胞计数。
3. 细胞计数与接种
- 取10 μL细胞悬液加入含有90 μL 0.04%台盼蓝的1 mL离心管中。
注意：也可使用其他适当的细胞稀释比例。 - 吹打混匀悬液，取10 μL细胞与台盼蓝混合液转移至血细胞计数板，用于细胞密度计数。
- 将细胞接种于完全神经干细胞培养基中（神经干细胞基础培养基与神经干细胞增殖添加剂按9:1比例混合），并添加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF以及1 μL/mL 0.2%肝素（终浓度2 μg/mL），培养基体积根据组织培养容器规格选择：T25、T80和T175培养瓶分别使用5 mL、20 mL和40 mL。可根据需要在培养基中添加抗生素（终浓度1:100），以降低污染风险。
- 将培养瓶置于37°C、5% CO2的培养箱中培养。
4. 胶质母细胞瘤来源类球体的传代与扩增：
- 当神经球直径达到平均 150–200 μm 时，培养物即可进行传代。将每个培养瓶中的内容物转移至适当大小的无菌组织培养管中，在室温下以 800 rpm（110 g）离心 5 分钟。
- 弃去上清液，将沉淀物重悬于 1 ml 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中。
- 为实现最佳消化效果，将细胞悬液于 37°C 水浴中孵育 2–3 分钟。为终止胰蛋白酶活性，向细胞悬液中加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂，并轻轻吹打混匀。
- 将细胞悬液以 800 rpm（110 g）离心 5 分钟，弃去上清液，再将细胞重悬于 1 ml NSC 培养基中。
- 按前述方法进行细胞计数。
- 将细胞以 5×104 个细胞/ml 的浓度接种于含生长因子的完全 NSC 培养基中，并根据前述部分所述接种至适当大小的组织培养容器中。
- 在 37°C、含 5% CO2 的湿润化培养箱中孵育 7–10 天后，可形成次级神经球。
5. 代表性结果：
将从胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤组织中分离的单细胞接种后，肿瘤干细胞样细胞在3-4天内增殖并形成由少量细胞组成的小细胞簇（见视频和图1）。随着这些细胞簇的生长，其形态逐渐趋于球形，至7-8天时可形成直径平均为150-200微米、相位对比下明亮清晰的典型球状结构（见视频和图2）。在更高倍镜下观察，健康的球状结构通常在其周边可见微绒毛样突起。培养开始后1-2天内即出现较大的类球状细胞簇，通常是由于培养初期存在未充分解离的细胞团块所致，不应误判为真正的肿瘤球。原代肿瘤球培养中碎片的多少取决于组织来源本身以及是否包含周围脑组织。采用适当的组织处理技术，包括酶消化与机械解离，并在足量培养基中对样本进行充分过滤，可有效减少培养体系中的碎片。
图1. 接种后第4天的原代胶质母细胞瘤球体培养。肿瘤干细胞样细胞在3-4天内增殖并形成小的细胞簇。原始放大倍数：20×。
图2. 接种后第8天的胶质母细胞瘤（GBM）类球体培养物（第一代）。原始放大倍数：20×。
讨论
为了从正常的成年和胎儿脑组织1, 2, 3, 4中分离神经干细胞和祖细胞，以及从肺癌5、前列腺癌6、乳腺癌7和脑癌8, 9等肿瘤组织中分离肿瘤干细胞样细胞，神经球实验（neurosphere assay）已被广泛用作首选方法。利用这一简单且可重复的实验方法，可以从切除的肿瘤组织中获得数量无限的细胞，这些细胞表现出与体细胞干细胞相似的特性：体外多向分化潜能、植入后形成新肿瘤的能力以及自我更新能力。这些细胞可用于研究癌症细胞的基本生物学特性，包括细胞间相互作用，以及分化、迁移、侵袭和细胞死亡等过程。此外，分离得到的肿瘤干细胞样细胞为研究肿瘤的形成、进展和复发机制提供了极为宝贵的工具，也有助于揭示其背后的驱动性细胞机制，最终可能为治疗策略的开发提供新的思路。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由佛罗里达脑肿瘤研究中心及小普雷斯顿·A·威尔斯脑肿瘤治疗中心资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC 基础培养基（人源） | 培养基 | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC 增殖添加剂（人源） | 培养基添加剂 | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| *MEM | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM 组分 |
| *HEPES | 试剂 | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM 组分 |
| *蒸馏水 | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| **DNase I | 试剂 | Roche Group | 104159 | |
| **大豆胰蛋白酶抑制剂 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| 青霉素-链霉素（Pen/Strep） | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| 10 号手术刀片 | 手术工具 | BD Biosciences | 371610 | |
| 培养皿 | 培养器皿 | BD Biosciences | 353003 | |
| 小型镊子 | 手术工具 | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 细胞滤网 | 筛具 | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 培养瓶 | 培养器皿 | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 培养瓶 | 培养器皿 | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml 离心管 | 培养器皿 | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml 离心管 | 培养器皿 | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | 生长因子 | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | 生长因子 | R&D Systems | 3139-FB | |
| 肝素 | 生长因子 | Sigma-Aldrich | H4784 | 用 PBS 重悬 |
| * 配制 HEM：取 1 包 10 L 的 1× MEM 粉末与 160 ml 1 M HEPES 混合，用蒸馏水定容至 8.75 L，调节最终 pH 至 7.4，并于 4°C 保存。 | ||||
| ** 配制胰蛋白酶抑制剂溶液：首先配制 10 ml DNase I 溶液（将 100 mg DNase 溶解于 100 ml HEM 中），然后向 DNase 溶液中加入 0.14 g 胰蛋白酶抑制剂，最后用 HEM 定容至 1 L。将终产物分装后保存于 -20°C 冰箱中。 |
参考文献
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).
- Eramo, A. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).
- Patrawala, L. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
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- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134, 1331-1343 (2011).
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