我们介绍一种可用于观察并定量评估在小脑组织切片培养物中生长的单个浦肯野细胞树突树形态的实验方案。该方案旨在促进对浦肯野细胞树突发育机制的研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
浦肯野细胞是研究树突发育的优良模型系统，因为它们具有显著的树突树，该树突树严格地沿矢状面定向排列，并且在小型啮齿类动物中主要于出生后阶段发育3。此外，已有多种抗体可用于选择性且强效地标记浦肯野细胞，包括其所有突起，其中抗-Calbindin D28K 抗体应用最为广泛。为了观察活细胞中的树突，杰克逊实验室提供了在浦肯野细胞中特异性表达 EGFP 的小鼠模型11。脑片器官型小脑切片培养系统便于对浦肯野细胞树突发育进行实验操作，因为浦肯野细胞树突树的大部分扩展实际上发生在培养期间4。本文介绍一种简短、可靠且易于操作的方案，用于观察和分析在脑片器官型小脑切片培养中生长的浦肯野细胞的树突形态。在许多研究中，对浦肯野细胞树突树进行定量评估具有重要意义。本文重点关注两个参数：树突树大小和分支点数量，这两个参数可从经抗-Calbindin 染色的小脑切片培养样本中快速且简便地测定。这两个参数能够可靠而灵敏地反映浦肯野细胞树突树的变化。以蛋白激酶 C（PKC）激活剂 PMA 和代谢型谷氨酸受体 1（mGluR1）的处理为例，我们展示了树突发育差异的可视化方法及定量评估手段。凭借其发达的树突树、选择性强且信号强的免疫标记方法、覆盖树突生长时期的器官型脑片培养系统，以及浦肯野细胞特异性表达 EGFP 的小鼠模型，浦肯野细胞成为揭示树突发育机制的强大模型系统。
方案
1. 建立脑片器官型小脑培养
小脑切片培养物采用静态孵育法10，从小鼠出生后第8天（P8）的幼鼠制备。在我们的实验室中，使用B6CF1品系小鼠。在部分实验中也使用了转基因小鼠，其在浦肯野细胞中特异性表达EGFP。每只幼鼠的切片培养制备过程约需30分钟，即一窝6只幼鼠共需约3小时。所有操作均在超净工作台内无菌条件下进行，使用灭菌的外科器械。
- 使用体视显微镜，在冰浴的预冷培养基（MEM（Gibco 目录号 11012）添加谷氨酰胺 1:100，pH 7.3）中分离 P8 小鼠幼崽的小脑组织。
- 小脑被切成 350 μm 使用McIlwain组织切片机沿矢状面切割厚切片。
- 将切片置于 Millipore 细胞培养插件中（每插件约 6 片，Millipore PICM03050），放入 6 孔板中，每孔加入 0.75 ml 培养液（48.35 ml MEM，25 ml Eagle 培养基，25 ml 马血清，1 ml GlutaMAX I，0.65 ml 无菌 10% 葡萄糖溶液，pH 7.3），在含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育2 在 37 °C所有组织培养试剂均来自 Gibco，Invitrogen。
- 药理学处理通常在体外培养第3天（DIV3）开始，将药物以所需浓度加入培养基中。佛波醇-12-十四烷酸-13-乙酸酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）和（RS）-3,5-二羟基苯基甘氨酸（(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine, DHPG）购自英国Tocris公司。由于许多药物在配制储备液时需要使用二甲基亚砜（DMSO）或乙醇（例如PMA），因此应确保加入培养基中的溶剂总体积不超过1%7.5 μl 每孔）。每隔2天换液时同时更换药物nd 或 3rd 天
2. 小脑类器官切片培养物的固定与免疫染色
小脑的一个重要优势在于，已有可特异性且强效标记小脑主要神经元（即浦肯野细胞和颗粒细胞）的抗体。通过抗钙结合蛋白D28K免疫染色可显示浦肯野细胞的树突形态。
- 固定培养物时，吸除培养基，每孔中加入 3 ml 冷的 4% 多聚甲醛（溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.4），该孔中含有膜上附着小脑切片的 Millicell 插入物。培养物于4°C过夜固定，随后去除固定液，并用磷酸盐缓冲液清洗培养物。
- 免疫染色所用抗体如下：兔抗 calbindin D-28K 抗体（Swant, Bellinzona, Switzerland），稀释度 1:1000，用于特异性显示浦肯野细胞；单克隆抗 NeuN 抗体（Chemicon, Millipore），稀释度 1:500，用于特异性显示颗粒细胞12。兔抗 GFP 抗体购自 Abcam，英国。荧光二抗 Alexa 抗体购自 Molecular Probes, Invitrogen。
- 将 3% 正常山羊血清 + 0.3% TritonX100 溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液中（封闭液），加入培养物以进行通透和封闭。抗 calbindin D28K 和抗 NeuN 抗体用封闭液稀释后，将培养物在含抗体的封闭液中于 4 °C 轻微振荡孵育过夜。所有稀释比例均以 %（v/v）表示，Triton X100 使用 10% 储存液稀释，以便移液操作。
- 培养物用 0.1 M 磷酸盐缓冲液清洗 3 次，然后加入合适的二抗（例如：山羊抗兔 Alexa 568 和山羊抗小鼠 Alexa 488），以 1:500 稀释于 0.1 M 磷酸盐缓冲液 + 0.1% TritonX100 中，在室温下孵育 2 小时。随后用 0.1 M 磷酸盐缓冲液再清洗 3 次。
- 用画笔将染色后的切片从培养孔中取出，置于 Superfrost plus 玻片上，用适当的封片介质（如 Mowiol）封片。此时可在配备落射荧光装置的普通显微镜或共聚焦显微镜下观察培养物。
3. 在器官型脑片培养物中观察单个浦肯野细胞
- 使用Calbindin D28k进行免疫染色后，浦肯野细胞的整个胞质均被强烈染色，包括树突和轴突。由于浦肯野细胞在浦肯野细胞层中排列密集，大多数浦肯野细胞的树突分支相互重叠，使得难以研究单个细胞的完整树突结构。然而，由于在制备过程中部分浦肯野细胞发生死亡，在许多培养样本中存在浦肯野细胞密度较低的区域。在这些区域中，可以找到树突结构完整且不与其他细胞重叠的浦肯野细胞。在这些细胞中，树突结构的观察和分析质量可与高尔基染色相媲美。由于在小脑中只有浦肯野细胞表达Calbindin D28k，因此这些细胞也可据此被鉴定为浦肯野细胞。
- 另一种方法是使用来自B6;FVB-Tg(Pcp2-EGFP)146.244Yuza/J小鼠（以下简称Pcp2-EGFP小鼠，可从Jackson实验室获得）的培养物，该小鼠在浦肯野细胞特异性的L7启动子驱动下表达EGFP11。在这些脑片培养物中，活体浦肯野细胞可通过EGFP的表达进行可视化。此外，还可以随时间追踪单个细胞的树突形态变化。或者，在固定后，可使用抗GFP抗体对表达EGFP的浦肯野细胞进行免疫染色。这两种方法均适用于在器官型培养物中对浦肯野细胞的树突、胞体和轴突进行染色。由于Pcp2-EGFP小鼠中L7启动子并非在每一个浦肯野细胞中都表达，且不同小鼠之间表达EGFP的浦肯野细胞频率存在差异（Kapfhammer，未发表数据），因此来源于这些小鼠的脑片培养物更便于观察和测量那些树突与其他浦肯野细胞树突重叠的细胞。当相邻的、树突结构重叠的浦肯野细胞不表达GFP时，这些树突结构可被单独观察（图1A, B）。
4. 测量浦肯野细胞树突树的大小和分支点
- 树突树大小。通过浦肯野细胞的荧光标记，若树突树未与其他细胞重叠，则可轻松测量特定细胞的树突树大小。由于Calbindin免疫染色会标记所有浦肯野细胞，因此可能难以识别具有非重叠树突树的细胞。在此情况下，建议使用Pcp2-EGFP以简化识别出足够数量具有非重叠树突树的浦肯野细胞。一旦确定了一个树突树无重叠的浦肯野细胞，即使用20倍物镜观察，并用数码相机记录图像。随后可使用图像分析软件对该图像进行分析。我们使用Image Pro Plus软件，在测量模式下利用魔棒工具单击即可勾勒出细胞的树突树轮廓（图2A）。该程序随后计算树突树所覆盖的面积，并将其导出至MS Excel。数据的统计分析使用GraphPad Prism软件完成（见下文）。
- 分支点数量。由于浦肯野细胞树突树具有高度分支且形态精细的特点，分支点需手动计数。将浦肯野细胞的20倍图像文件在Adobe Photoshop中放大至占据屏幕大部分区域，然后逐一计数每个分支点，并用一个亮色圆点标记（图2B）。
5. 典型结果
监测培养期间浦肯野细胞树突树的发育
来自Pcp2-EGFP小鼠的器官型脑片培养物，其中EGFP特异性地在浦肯野细胞中表达，可用于在培养期间连续数天观察单个细胞的形态。通过这种方法，可以清晰记录培养期间浦肯野细胞树突树的生长与发育过程。每隔2天对活体可识别的浦肯野细胞进行拍照nd 或 3rd 在培养期间每天使用10倍物镜进行观察。选择此低倍物镜是为了避免和减少荧光光照对细胞造成的光毒性损伤。 图3 显示了在活体培养中拍摄的浦肯野细胞的两个示例。第一个细胞从第2天开始被追踪 体外 直至 7 天 体外 (图3，A-C）。显然，该细胞的树突在这一时期长出了若干新分支，并且体积有所扩大。在第二个例子中，一颗浦肯野细胞从第4天到第11天被持续观察 体外 (图3，D-F）。DIV4时存在的小型树突在该时间段内显著扩展。这两个例子表明，培养结束时浦肯野细胞所具有的大部分树突树确实是在培养过程中发育形成的。
蛋白激酶C或代谢型谷氨酸受体1激活抑制浦肯野细胞树突树的发育
小脑组织切片培养物培养了11天。从第2天开始nd 体外培养第1天，部分培养物分别用PMA（50 nM，一种刺激PKC的佛波酯）或DHPG处理10 μM），一种mGluR1激动剂，直至固定培养物。先前的研究已表明，这两种化合物均可抑制并限制浦肯野细胞树突的生长 7, 8, 9, 5在未处理的对照组脑片中，浦肯野细胞发育出典型的大型且高度分支的树突树，可通过抗钙结合蛋白免疫染色进行可视化（图4A）或在表达EGFP的浦肯野细胞培养物中，通过使用抗GFP抗体进行免疫染色（图 4D）。在经PMA处理的培养物中，树突树的形态发生了显著改变。树突增粗，且仅有少量短的侧支。许多浦肯野细胞不再像对照组培养物中那样呈单极形态（即从胞体发出一条主树突），而是发育出两条甚至更多的主树突。图4B、E）。树突树所覆盖的区域明显缩小（见下文）。DHPG处理的培养物中也存在类似情况。浦肯野细胞的树突树显著缩小，分支程度明显降低（图4C，F）。然而，与PMA处理的培养物相比，也存在一些定性差异：树突分支未出现增粗，且初级树突上带有许多非常短的次级树突。图 4C，F) 表明PMA和DHPG处理的浦肯野细胞中发生的信号事件可能相似，但并不完全相同。
浦肯野细胞树突树大小和分支点数量的定量评估 进行定量评估时，按照上述方法测量浦肯野细胞树突树的大小以及每个浦肯野细胞的分支点数量。至少三项独立实验的结果被合并分析，且每组需分析不少于20个细胞。对照实验中树突树所覆盖面积的平均值被设定为100%，其他实验组的数值则相应表示为百分比形式。数据分析采用 GraphPad Prism 软件进行。由于我们不假设所有测量值均符合正态分布，因此选用不依赖于数据呈高斯分布的统计检验方法。在比较多个实验条件并检验统计学显著性时，我们采用Kruskal-Wallis检验，随后根据秩次统计量进行适当的事后检验校正，例如 GraphPad Prism 中内置的Dunn's事后检验。结果通常以柱状图形式展示。图5给出了此类统计分析的一个示例。对树突树大小（图5A）和每个浦肯野细胞分支点数量（图5B）的分析均显示，对照组与DHPG或PMA处理组之间存在显著差异。根据Kruskal-Wallis检验，这两个参数的差异均具有统计学显著性（p<0.001）。
图1. EGFP标记的浦肯野细胞。在Pcp2-EGFP小鼠中，并非所有浦肯野细胞都表达EGFP。因此，当某些浦肯野细胞表达EGFP时（A图中的EGFP通道），其树突结构可被单独观察，而邻近具有重叠树突结构的浦肯野细胞则不表达EGFP（A图EGFP通道中呈阴性，B图红色通道抗钙结合蛋白染色中呈阳性）。比例尺 = 50 μm。
图 2. 普肯耶细胞树突参数的测量。 （A）使用 Image Pro Plus 图像分析软件中的魔棒工具，通过单次鼠标点击勾勒普肯耶细胞轮廓，即可轻松测量树突结构的大小。使用魔棒工具时，需确保线条完全包围整个树突树，包括细胞胞体及所有树突分支。（B）普肯耶细胞图像中的分支点数量通过人工计数。每个分支点均以黄色圆点标记。比例尺 = 50 μm。
图3. 监测浦肯野细胞树突树的发育 鉴定出的浦肯野细胞被反复拍照，以监测树突树的生长。（A-C）：浦肯野细胞树突树从第0天到第64天的生长与发育过程 体外 （DIV）2至DIV7。在此培养期间，神经元树突持续生长并分支。（D-F）：浦肯野细胞的树突从DIV4至DIV11期间的生长与发育过程。在此培养期间，树突结构显著扩展。比例尺 = 50 μm.
图 4. PKC 或 mGluR1 激活抑制浦肯野细胞树突树的发育。 （A）、（D）：未经处理的对照细胞，具有发育良好的树突树。（B）、（E）：经 PMA 处理 9 天后，树突增粗，树突树显著缩小。细胞常失去极性，变为双极形态（E）。（C）、（F）：经 DHPG 处理 9 天后，树突树明显缩小。与 PMA 处理不同，在初级和次级树突上可见大量非常细小且短的侧支。细胞也常失去极性，变为双极形态（F）。浦肯野细胞在（A - C）中通过抗钙结合蛋白（Calbindin）免疫染色显示，在（D - F）中通过源自 Pcp2-EGFP 小鼠的培养物中的 EGFP 表达显示。比例尺 = 50 μm。
图5. 普肯耶细胞树突树大小与分支的定量评估。 定量测量显示，经 PMA 或 DHPG 处理后，树突树的大小（上方柱状图）和分支点数量（下方柱状图）均显著减少。对照组树突树与处理后培养物中普肯耶细胞树突树之间的差异具有统计学显著性（p<0.001）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述方法可用于研究器官型小脑切片培养中浦肯野细胞树突的发育过程，并通过测量树突树的大小和树突分支点的数量，对浦肯野细胞树突的扩展进行定量评估。当然，还可以对浦肯野细胞树突进行更广泛且更精细的定量分析，例如测定总树突长度、进行Sholl分析或确定树突树的分形维度。此类分析通常需要手动将完整的浦肯野细胞树突树结构 traced 进分析软件（如 Neuro-Lucida）。尽管这些更精细的方法无疑能提供更高水平的分析结果（例如参见1, 6），但与本文所述方法相比，它们更加耗时，且需要更专业的设备和分析软件。对于大多数应用，特别是当浦肯野细胞树突的变化较为显著且在定性上可见时，本文介绍的简单方法已足够使用。 需要注意的是，来源于P8小鼠的器官型小脑切片培养仅能涵盖浦肯野细胞树突发育的后期阶段，该阶段以树突快速扩展为特征。若要研究更早期的发育阶段，需将切片培养方法调整为使用新生或胚胎期动物的脑切片，从而覆盖树突发育的早期阶段（例如2）。
为了在离体小脑切片培养物中可视化浦肯野细胞，我们仅聚焦于两种常规方法：抗钙结合蛋白...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
动物实验遵循1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）的规定，并经瑞士相关机构审查和批准。作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由巴塞尔大学生物医学系和瑞士国家科学基金会（31003A-116624）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
参考文献
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation. J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).
- Kapfhammer, J. P. Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells. Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).
- Kapfhammer, L. C. Cerebellar slice cultures. Protocols for Neural cell culture. Doering, J. P. , 4th edition, Springer Protocols Handbooks. 285-298 (2010).
- Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death. J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).
- Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling. Neuron. 68, 45-60 (2010).
- Metzger, F., Kapfhammer, J. P. Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures. Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).
- Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice. Neuroscience. 110, 675-689 (2002).
- Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures. Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- Weyer, A., Schilling, K. Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum. J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
