小鼠强迫游泳实验

摘要

强迫游泳实验已被验证为一种用于评估啮齿类动物潜在抗抑郁药效的实验方法。将实验动物放入盛水的容器中，量化其与逃脱相关的运动行为。本文描述了该实验小鼠版本的常规操作步骤。

摘要

强迫游泳实验是一种用于评估抗抑郁药物、新化合物的抗抑郁效果以及旨在诱发或预防类抑郁状态的实验操作的啮齿类动物行为学测试。将小鼠置于装有水的不可逃脱的透明容器中，测量其与逃避相关的运动行为。强迫游泳实验操作简便，可靠性高，且所需专用设备极少。成功实施强迫游泳实验需严格遵守特定的操作细节，并尽量减少对小鼠的非必要应激。在本实验方案描述及配套视频中，我们详细说明了如何开展小鼠版本的该实验，重点强调可能影响结果解释的潜在陷阱及其规避方法。此外，我们还解释了如何评估实验中表现出的行为。

方案

1. 材料与方法

1.1. 水箱

本实验室进行小鼠强迫游泳实验（FST）所需的圆柱形水箱（高 30 cm，直径 20 cm）由透明有机玻璃（Plexiglas）制成，因为与玻璃相比，该材料更能耐受水箱频繁移动和意外碰撞。水位应距离水箱底部 15 cm，并应在水箱上标记该水位线，以确保各只小鼠实验时的水量保持一致。水箱的数量最好至少为同时测试小鼠数量的两倍，以便在使用第一组水箱时，可同时准备第二组水箱并注水。水箱的尺寸应选择得当，确保小鼠在游泳过程中无法用足或尾部触碰到水箱底部。水箱高度应足够高，以防止小鼠逃出水箱。请注意，水箱直径和水深是重要的参数，可通过调整这些参数来改变小鼠的行为表现（有关这些问题的详细分析，请参见^1-3）。

1.2. 温度计

建议使用防水型红外温度计，因为快速测量温度可缩短检测所需时间。然而，玻璃水银温度计也可满足本实验需求。

1.3. 计时器

1.4. 视频记录设备

我们使用由三脚架支撑的摄像机进行拍摄。由于该实验通常需要同时测试多只动物，因此实时评分将非常困难，不建议采用。摄像机应以足够高的分辨率进行录制，以获得可用于后续行为评分的高质量图像。在开始实验前，务必确保摄像机有足够的录制存储空间。我们使用的摄像机以数字方式记录，无需使用机械介质（例如录像带），便于视频的数字化传输。如果水箱表面存在过度反光（在使用顶部荧光照明的实验室环境中可能出现这种情况），建议为摄像机配备偏振镜头滤光片。

1.5. 分隔符

在我们的实验室中，有两组分隔板（35 cm 高 × 22 cm 宽 × 22 cm 深）。这些分隔板为矩形结构，具有三个侧壁，既可用作背景，也可放置于笼盒之间作为遮挡物，以防止小鼠在实验过程中相互看见，从而避免其行为受到潜在影响。其中一组分隔板为黑色，适用于白化或浅色动物；另一组为浅色，适用于深色动物，以实现高对比度。实验人员应确保分隔板表面不会过度反光，以免干扰摄像图像或造成光照强度的显著差异。

1.6. 白噪声发生器

在可能突然出现巨大声响而惊扰动物的实验环境中，需要使用噪声发生器来掩盖此类间歇性干扰声音。白噪声发生器的音量应设置为高于其他环境噪声和意外噪声的水平。在我们的实验室内，未开启白噪声发生器时的环境噪声水平为60 dB；开启白噪声发生器后，在放置饲养箱位置测得的总噪声水平为70–72 dB。但需注意，这些数值仅作为示例提供，各实验室应根据自身独特的环境和具体情况选择合适的噪声水平。

1.7. 干燥纸张与加热灯

在将动物放回其饲养笼之前，应使用纸巾轻轻擦干动物，并可使用加热灯（确保暴露温度不超过32°C）以防止低体温，这有助于动物恢复。

2. 行为学实验步骤

1. 整体实验设计应体现对实验特有变量的适当平衡。例如，在我们的实验中，每次强迫游泳实验（FST）中均尽量使每个组别均有同等代表（即，若有四个处理组，则每组均会在每次实验中出现）。此外，小鼠应进行轮换，使每个处理组的小鼠在每次实验中被放置于不同的水箱中。
2. 将摄像机和隔板放置到位。摄像机应尽可能靠近水箱，以获得小鼠的最高分辨率图像。
3. 用水龙头水将水箱注水至预定水位，水温保持在室温（23–25°C），水位线应预先标记在水箱壁上。如果实验场所无法持续供应恒温的冷/热水，可提前准备热水和/或冰块，以便快速调节水温至目标范围。使用红外温度计检测水温。或者，若实验场所的热水和冷水温度恒定，可在水箱上标记两条线——一条为热水水位线，另一条为加入冷水后达到目标水温的水位线——以快速接近正确的最终水温。
4. 在将小鼠带入测试室之前，启动白噪声发生器（如使用）。白噪声的音量应仅足以掩盖外界噪音。避免音量过高，并确保所有动物均使用相同的白噪声强度。
5. 将动物带入测试室。如果动物饲养的屏障环境与测试室相邻或距离很近，环境条件相似，且运输过程中对笼具的干扰最小，则无需适应期。否则，应将动物置于测试室内进行适应（通常至少一小时）。若需适应期，需确保正在适应的动物不会受到同室内正在进行测试的小鼠的影响。请注意，同室内的其他动物可能感知到嗅觉和超声波信号。
6. 在将动物放入水箱之前，启动视频录制。
7. 用手握住小鼠尾部，轻柔缓慢地将其放入水中。当小鼠进入水中后，缓慢松开尾部。通常，采用此方法可避免小鼠头部完全浸入水中。
8. 将小鼠放入水箱的顺序应尽量减少对录像的遮挡。该顺序当然还需结合组别平衡及其他实验设计的具体要求来确定。
9. 当所有小鼠均进入水箱后，启动秒表倒计时。小鼠FST的常规测试时长为六分钟。
10. 测试过程中，实验人员应保持与动物的合理距离，避免做出任何可能被动物察觉的动作或发出噪音。小鼠通常能够自然漂浮于水面，但如果使用的是新小鼠品系或尚未了解其对游泳行为影响的新化合物，实验人员应更密切地观察动物状态。与大鼠不同，小鼠在FST中通常不会潜水；若出现潜水行为，应立即将小鼠从水箱中移出。若实验人员需离开房间，应通过视频持续监控小鼠，以防其无法维持游泳和漂浮行为，并在必要时及时终止测试。
11. 六分钟测试结束后，停止录像。在我们实验室中，会在每次录像结束时，将一张注明动物信息的纸条置于摄像机前。采用此方法后，后续对录像进行评分的人员将无法提前知晓动物身份，因为身份信息仅在录像末尾显示。这可避免后续与录像相关的动物身份识别和记录管理问题。无论采用何种记录管理策略，均应能明确标识动物，同时防止后续评分人员知晓动物的分组信息。
12. 按照放入水箱的相同顺序，通过尾部将动物从水中取出，用吸水纸轻轻擦干，并放回其原饲养笼中。

3. 行为分析

1. 小鼠版本的强迫游泳实验（FST）通常从开始到结束持续六分钟。然而，一般仅分析测试的最后四分钟，原因在于大多数小鼠在实验开始阶段活动性较强，治疗干预的潜在效应可能在前两分钟内被掩盖。
2. 在本实验室中，我们将视频文件直接从摄像机上传至计算机，并在计算机上进行分析。
3. 在行为学分析过程中，测量每只小鼠处于活动状态的时间。将总活动时间从240秒的测试时长中减去，所得结果即为静止时间。尽管可以直接测量静止时间，但在本实验室的操作实践中，我们发现检测和记录主动运动比判断运动缺失更为简便可靠。
4. 行为学分析中最重要的环节，也是FST中观察者间差异最常见的来源，即准确识别被计为真实活动（bona fide mobility）的运动行为。我们在FST中对“活动性”的操作性定义为：除维持身体平衡和保持头部露出水面所必需的动作之外的任何运动⁴。小鼠通常能轻易漂浮于水面，但仍会表现出微小动作以维持身体平衡并保持头部在水面上。此类行为并非试图逃脱，不应记为活动。此外，在一次活动行为结束后，即使小鼠已基本静止，仍可能因动量作用而在水中漂移，此类移动亦不应记为活动。
5. 在本实验室中，我们使用屏幕计时软件（Xnote Stopwatch，dnSoft Research Group）进行时间测量。屏幕上同时使用两个独立的秒表：第一个秒表从240秒开始倒计时，并在行为分析阶段结束时提醒观察者；第二个秒表用于记录小鼠的活动时间。部分秒表软件支持将特定按键分配给启动和停止功能，从而可通过键盘控制屏幕上的秒表。在本实验室中，我们并未使用普通键盘，而是采用一种通常称为“游戏手柄”（gamepad）的输入设备来控制秒表。
6. 当使用计算机量化静止时间时，若屏幕上同时显示多只被测试小鼠，建议遮挡其他动物的影像（可使用其他程序窗口或用纸张物理遮盖屏幕），以避免其动作干扰观察者的判断。
7. 若使用屏幕秒表，应确保仅保留毫秒位数字可见，其余部分需遮盖。这样做的目的是在防止观察者产生偏差的同时，仍能判断秒表是否正在运行。由于观察者虽不知动物的分组信息，但可能对小鼠活动水平有大致预期，若允许其在分析完成前看到某只小鼠的累计活动时间，可能会引入偏差。通过遮盖秒表，观察者仅能知晓秒表当前处于开启或关闭状态，而无法得知已累计的总时间，从而避免受到偏差影响。
8. 在正式采集实验动物数据之前，应对每位新观察者进行观察者间信度测试。在本实验室中，每位新观察者首先需观摩经验丰富的观察者进行评分。待其能够自信地区分活动与静止行为后，再由资深观察者监督其评分过程，并指出任何错误。成功完成此阶段后，新观察者需分析一组我们实验室专门用于培训的FST视频资料。只有当新观察者与资深观察者之间达到较高的一致性相关水平后，方可开始参与实际实验中的FST视频分析。我们存档这些培训分析的数据，作为实验室内部标准以供未来参考。我们已观察到不同品系小鼠在表达活动（及静止）行为方式上存在差异，以及不同性别间平均静止时间的差异。当实验室引入新的品系、性别或基因修饰小鼠模型时，必须重新进行此类信度分析。

4. 代表性结果

不同遗传背景的近交系和远交系小鼠品系在基础不动行为以及对特定药物的反应方面存在显著差异^5-11。例如，我们发现一组小鼠品系对锂盐的抗抑郁样反应存在差异（图1）⁵。该实验的详细方法发表于Can et al., 2011⁵。

图 1. 各种近交系和远交系小鼠在单次腹腔注射生理盐水或 200、300、400 mg/kg 药物后 5 小时，强迫游泳实验中的不动时间（单位：秒）。*:p<0.05，**:p<0.01，***:p<0.001 表示与生理盐水组相比具有显著性差异（Dunnett's post hoc 检验）。数据以均值 ± 标准误表示。每组每种品系小鼠数量为 6–8 只（该图引自文献⁵）。

并非所有小鼠品系都适用于强迫游泳实验（FST）。某些品系，如 Black Swiss、NIH Swiss 和 FVB/NJ，在对照条件下表现出极少甚至几乎无不动行为，因而呈现出地板效应（图1）⁵。由于缺乏基础不动水平，实际上无法检测到实验干预的抗抑郁样效应。此外，尽管极为罕见，某些小鼠品系在测试过程中可能出现异常行为，例如即使能够漂浮仍会潜入水中。DBA/1OlaHsd 即为其中一例（本实验室未发表观察结果）。此类品系不适用于强迫游泳实验。鉴于潜入行为的风险（无论多么微小），在测试此前未用于强迫游泳实验的新品系小鼠，或携带新型基因操作的小鼠时，必须仔细观察初始试验过程，以便在小鼠出现潜在有害行为时及时实施救援。

在本实验设计中，可同时对多只动物（最多五只）进行测试。尽管我们使用的隔板可在测试期间阻止小鼠相互看见，且白噪声发生器可抑制可听见的发声，但该装置无法完全阻断所有超声波或嗅觉信号的传递。尽管根据测试性质这种情况可能性较低，但这些信号仍可能影响小鼠的行为。解决此问题的一种方案是单独测试每只动物。然而，这种方法本身也存在若干问题。例如，通常每轮测试中的动物均来自同一饲养笼，这有利于对实验变量进行随机化和交叉平衡。若采用单独测试，则需逐个从小鼠饲养笼中移出动物，这将反复造成笼内剩余小鼠的应激反应和社会等级结构的扰动。另一个单独测试所面临的问题是时间限制：逐只测试将使实验持续数小时，导致小鼠在昼夜节律的不同时间点接受测试，可能引入混杂的时间效应。研究人员在设计实验时应充分考虑上述问题。

讨论

强迫游泳实验（FST，有时称为Porsolt游泳实验）最初是为大鼠设计的，随后由Porsolt及其同事改良用于小鼠^12,13。除本实验室成功使用的上述方案外，已有多种细微调整的实验方法被发表（详见Hascoët和Bourin的全面综述¹）。该实验是基础与临床前研究中评估抗抑郁药物疗效以及各种行为和神经生物学干预效应的常用方法^3,14-16。该实验被认为可诱发“行为绝望”状态，即动物对逃离应激环境失去希望¹³。小鼠版本的强迫游泳实验是一种相对简短且成本较低的行为学测试，无需对小鼠进行训练，且仅需最少的设备即可实施。这与大鼠版本的实验不同，后者通常需要在测试前一天让动物预先暴露于水箱中¹⁷。

由于其广泛应用，关于各种抗抑郁药物在强迫游泳实验（FST）中作用效果的数据十分丰富。这使得研究人员能够将自己的结果与其他研究进行比较和对照（参见Hascoët和Bourin在2009年的综述¹）。FST的这些特性使其成为学术研究以及工业界药物研发中的重要工具，尤其在需...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
水箱
温度计
计时器
摄像机
白噪声发生器（可选）
吸水纸